文摘
可见范围圆二色性滴定被用来研究铜(II)的绑定属性Multimetal结合位点(MBS)人血清白蛋白(HSA)。形成三元MBS-Cu(2)缓冲复合物在pH值7.4正验证磷酸钠,三,和消息灵通的,三个最常见的生化缓冲区。磷酸盐>玫瑰>三亲和力,加上强大的光谱变化诱导专门三,表明存在两个Buffer-Cu (II)和Buffer-HSA交互。配合物都是强大到足以产生近100%三元复杂地层的0.5毫米HSA溶解在100毫米的解决方案各自的缓冲区。华法林和布洛芬的影响,特定的配体的疏水口袋I和II在HSA铜(II)绑定到MBS也被调查。布洛芬的影响可以忽略不计,但华法林减少铜(II)的MBS亲和力的20倍,由于间接构象的影响。这些结果表明,金属MBS的绑定属性可以调制直接或间接由小分子。
1。介绍
人血清白蛋白(HSA)是最丰富的血清蛋白质,钙的浓度。0.6毫米(4%)。这是一个多功能的载体蛋白,参与运输激素、维生素、脂肪酸,外源性物质,药物和代谢物1]。保险公司也有金属离子,包括生理Ca2 +、锌2 +、有限公司2 +,铜2 +,以及有毒的Cd2 +和倪2 +(1- - - - - -3]。四个不同金属结合位点在HSA特点是迄今为止。Cys-34,唯一自由硫醇在HSA,位于疏水口袋的底部。它选择性地结合疏水复合物的重金属离子,如Pt2 +和非盟+(4- - - - - -7]。三个其他网站更容易和更多功能。氨基结合位点(nt,也叫做ATCUN主题)一直特别好。它由HSA的前三个氨基酸残基序列,Asp-Ala-His。这个序列不是限制sterically,就是明证缺乏跟踪这些残留在HSA [x射线结构1,2),有一个构象环绕一个金属离子的自由。结果square-planar复杂展览一个罕见的协调模式deprotonated酰胺氮的阿拉巴马州和他的残留物,除了氨基胺和3咪唑捐赠(8- - - - - -10]。它提供的主要结合位点铜(II)和镍(II)离子和三级网站公司(II)离子(10,11]。我们最近证明了有条件的离解常数为铜(II)绑定nt是低至下午1点12]。类似3网站的短肽的研究模型和其他实验室执行,例如,通过Hadjiliadis et al .,一致表示对铜(II)很高的亲和力,同时镍(II)离子(13- - - - - -15]。有充分的实验证据完全饱和的协调领域的铜(II)离子连着nt和模型肽(9,11- - - - - -16]。
另一个网站是由侧链His67, His247, Asn99我Asp249。它位于界面HSA的域I和II。我们叫它multimetal结合位点(MBS)在我们之前的研究中,因为我们证明它可以绑定铜(II)、镍(II)、锌(II)、Cd (II),以及公司(II)离子与可比亲和力(10,11]。这个网站是相同的与镉site B(国开行)以核磁共振光谱学17- - - - - -19]。最近的研究对锌(II)绑定在MBS提供关键数据对其空间布置(18]。第三的位置,叫镉网站(CdA),仍然是未知的。是主站点的Cd (II)和(2)离子,但不参与铜(II)绑定(11]。
的结构分析了MBS NMR和锌(II)的分子建模复杂(18]。锌(II)离子在一个方形锥体pentacoordinate几何,与赤道协调提供了两个咪唑氮(His67和His247),一个羧酸盐(Asp249)和羰基氧(Asn99)。这种结构的轴向网站是被一个水分子。这一事实表明,MBS结合位点可能修改外部配体,形成假设的三元的物种。
在这个工作我们试图找出常见的缓冲区是否可能与铜(II)离子在MBS保税。我们还测试了是否占领疏水口袋,用于运输的内生和外生芳香分子(20.- - - - - -23),可能会影响MBS的协调性能。
2。实验
2.1。材料
得到均匀、纯度高、脱脂HSAσ。CuCl2、玫瑰、三磷酸钠,氯化钠从奥尔德里奇获得。股票的解决方案CuCl2是标准化的complexometrically。CuCl2解决方案是校准中描述(15]。氢氧化钠和盐酸从默克公司购买。
2.2。方法
CD光谱被记录下来Jasco j - 715分光偏振计(日本Jasco光谱有限公司广岛,日本),在300 - 800纳米的范围,使用试管1厘米。的表达谱,在那里和摩尔吸光系数为左和右圆偏振光,分别。在缓冲实验解决方案包含100毫米玫瑰,三,磷酸钠,或生理盐水,在pH值7.4。
HSA溶解在一个0.3 - -0.5毫米100毫米玫瑰,三、磷酸钠缓冲区,pH值7.4,或者在一个无缓冲的100毫米氯化钠溶液。控制两种类型的样本的pH值保持在7.38 - -7.42走廊和调整submicroliter必要时大量的浓盐酸或氢氧化钠。浓度的股票解HSA估计spectrophotometrically 279海里(9)和铜(II)滴定。nt的部分丰富HSA被小心使用校准CD滴定测量铜(II)的解决方案。0.73得到的平均值,与先前的研究在协议(10- - - - - -12,15,24]。
3所示。结果与讨论
3.1。缓冲区的绑定的影响铜(II)离子在MBS
我们选择磷酸钠,三羟甲基氨基甲烷和玫瑰是最常见的物质用于液缓冲蛋白质在pH值7.4解决方案。影响铜(II)绑定在0.1集中阶段研究了HSA和无缓冲的0.1 M氯化钠,用作控制解决方案。后者的选择是由0.1血清中氯的存在(25]。氯化钠的pH值控制样本的增加少量的浓盐酸或氢氧化钠的解决方案,必要时。这是由于self-buffering HSA的属性,实现基于多个他残留在表面的存在(9,26]。滴定被CD光谱监测,类似地,我们的先前的研究10,15]。
一个典型的滴定呈现在图1。图2显示滴定曲线,从滴定实验获得通过绘制椭圆率的变化()铜(II)配合物在MBS(665海里剩余三羟甲基氨基甲烷和695 nm液解决方案)。椭圆率的变化相关的转换在nt铜(II)配合物,在492和565海里,是线性的nt饱和,按照这个网站的亲和力很高12]。
,适合公式,
在MBS)铜(II)绑定四个解决方案研究:(一)生理盐水;(b)消息灵通的;(c)磷酸钠;(d)三。nt的纯光谱和MBS复合物在单个解决方案,通过外推计算滴定数据,数据所示3和4,分别。nt乐队的形状和强度不受缓冲区进行了研究。相比之下,三的存在改变了MBS乐队的外观特征,生理盐水相比参考。磷酸盐和玫瑰的效果不太明显,但仍然显著。
明显的绑定常量()铜(II) mbs复合物在缓冲区的存在从滴定呈现在图2。这些常数,计算技术假设二进制物种的形成,提出了在桌子上1。表1还包含进一步常数,计算相对于铜(II) mbs交互在氯化钠,作为对应于二进制形成复杂的100%。上述的计算是基于光谱的影响以及日志之间的显著差异值。
首先,竞争的影响的缓冲区铜(II)入账文学质子化作用和铜(II)绑定常量的玫瑰27),三羟甲基氨基甲烷(液28],和磷酸盐离子[29日)被用于这些计算。在竞争的互动模式,不可能,然而,再现滴定曲线,它是必要的,包括三元复杂的形成。图5说明了这个问题的消息灵通的缓冲区。MBS的转变→带30 nm更高的能量,从695年在665海里,也提供了一个明确的证据支持三元复杂的形成有三。基于这样的假设,计算所有三个缓冲区,执行产生了平衡常数,给出表1。定义这些常数的反应提供了表的脚注1。
),模拟滴定没有三元复杂的形成(
)滴定的MBS在0.1玫瑰,pH值7.4。简单地说,描述的整体形成一个三元的物种,是文学绑定常量铜(II)复杂的缓冲区,对应的三元复杂地层的MBS buffer-complexed铜(II),和的平衡常数的形成三元复杂反应的两个二元复合物,因此以二进制组件的趋势形成一种三元(33]。所有这些常数,除了条件,尊重,pH值为7.4。
计算这些缓冲区的滴定表明,观察到光谱几乎纯光谱混合复合物。二进制MBS的参与滴定点复杂的不到1.5%。这个特性允许我们推测三元复合物的绑定模式。玫瑰和磷酸盐的光谱是几乎相同的二进制复杂,但滴定曲线展示了重要的定量偏离二进制complex-only绑定。因此,最有可能的绑定模式这两种物质是基于一个替换缓冲区的轴向水分子氧供体。三元复合物的较高绑定常量,与二元复合物,演示了创建补助HSA和配体之间的相互作用。带强度的蓝移,改变三表明赤道的一个替代氧气,也许Asn99。
CI值在表格的最后一列1计算总浓度的铜(II)和正式的竞争对手 米和在毫米。这些计算是在两个版本进行L(缓冲)浓度的0.5毫米和100毫米。这些HSA和铜(II)离子浓度与生理值,后者可交换的铜(II)在血浆32]。从这些计算,我们可以推断出三元复合物的形成与缓冲相对较小影响铜(II)离子的亲和力MBS。的值证明了玫瑰和三羟甲基氨基甲烷缓冲液有点动摇这种交互,和磷酸盐离子显示一个稳定的效果。然而,其对铜(II)绑定的影响是显著的,实际上使用缓冲浓度的100毫米。消息灵通的应用在连续的调查中,因为这个缓冲区显示最小的干扰MBS的铜(II)绑定参数。
3.2。MBS之间的相互作用和疏水口袋芳香分子
有意思的是找出是否绑定的华法林(战争)和布洛芬(伊布·)图6疏水口袋,外源性配体特征(Sudlow网站)I和II在HSA,分别会影响铜(II)绑定在nt,尤其是MBS。
(一)
(b)
在这些实验中,我们使用HSA样本包含1.75摩尔当量的铜(II)离子。根据上述结果与讨论,这些样本包含完全饱和nt和一摩尔相当于铜(II)与MBS平衡,80%饱和度。样本分别滴定与战争和伊布·。这些两种物质具有供体组织,这将能有效结合铜(II)离子在溶液中。证实了这一概念缺乏复杂地层的指纹在紫外可见光谱和圆二色性(CD)光谱(数据未显示),和文献[20.- - - - - -22,34,35]。
HSA绑定常量战争(米−1)和伊布·(米−1)[30.,36- - - - - -38)足够高,以确保化学计量结合各自绑定口袋在0.5毫米HSA方式添加一个相当于配体收益率93%饱和度为战争和伊布·99%饱和度。图7显示0.5毫米HSA的滴定与战争和伊布·在1.75摩尔当量的铜(II)离子。这些滴定的过程中,我们观察到一个特定的强度降低MBS乐队。乐队的位置保持不变。伊布·的效果是非常微妙的,但战争显然是明显的。有趣的是,乐队的线性强度减少相似的化学计量绑定点前后两个HSA配体。
图8礼物滴定HSA与铜(II)离子的化学计量(1摩尔当量)的存在大量的战争和伊布·,表现在一个100毫米消息灵通的缓冲区,pH值7.4。伊布·滴定法产生的日志值为4.49(5),相同的实验误差,获得的100毫米玫瑰没有伊布·(4.45(5),表1)。然而战争的存在明显影响铜(II)绑定。一个非常低的日志值为3.2 (2)。因此,战争的绑定MBS的亲和力降低铜(II)的20倍。铜(II)绑定在nt是在这两种情况下的影响。
,适合公式,
)和战争(实验分,
,适合公式,
)。在数据的影响7和8可以被考虑疏水口袋的位置。战争结合现场具体我,位于子域名HSA的花絮”,而伊布·结合具体现场II,位于子域名iii a [1,2,31日]。MBS位于域IB和花絮”的界面,更接近网站我比网站II, MBS分开的一个非常大的裂缝(32]。根据目前的数据,我们可以推测,华法令阻凝剂诱导的结合构象变化减少MBS的可访问性。没有CD光谱变化的铜(II) mbs复杂的表示,但是,网站本身的几何形状没有影响。
4所示。结论
上述结果清楚地表明,铜(II)绑定属性的MBS HSA可以影响外部配体。缓冲亲和力的顺序形成的三元MBS-Cu(2)缓冲复合物,表明,不仅限于的交互与金属离子结合。这个概念是由强大的光谱变化诱导专门三,这清楚地表明的三氮原子的协调球体MBS-bound铜(II)离子。华法林的间接影响表明特定的MBS负控制绑定网站我配体的金属离子。
MBS生理上不太可能携带铜(II)但被认为是一个主要的交通站点锌(II)离子血浆(18]。本文中描述的相互作用很可能是共享的MBS占领锌(II)离子,因为铜(II)和锌(II)绑定模式被认为是非常相似的。因此,锌(II) MBS的绑定属性可能调制直接或间接由小分子。这生理上重要的问题将在我们未来的调查研究。
确认
作者要感谢太太的熟练和技术援助主管莉迪亚Januszewska m . c .这项工作是由波兰教育部和科学支持的Wroclaw-Statute医科大学的调查。30-ST30。