破译翻译起始因子5嗜盐古生菌的改造途径

文摘

翻译起始因子5 (IF5A)是至关重要的,真核生物中高度保守的(eIF5A)和古菌(aIF5A)。IF5A的活动需要hypusine,转译后的改性聚胺前体亚精胺的合成在真核生物。细胞内聚胺分析显示胍基丁胺、尸胺主要生产的聚胺类Haloferax volcanii在基本培养基,提高hypusine是如何合成的问题在这个嗜盐古生菌。聚胺代谢的代谢重构导致了暂时的照片和aIF5A修改Hfx。volcanii这是实验测试。分析aIF5A从Hfx。volcanii质/ deoxyhypusinylated独家透露这是女士。基因研究证实预测精氨酸脱羧酶基因的作用(HVO_1958)胍基丁胺合成。agmatinase-like基因(HVO_2299)被发现是至关重要的,符合在aIF5A修改预测的物理集群的证据。重组deoxyhypusine合成酶(DHS)酿酒酵母从亚精胺被证明转让4-aminobutyl一半aIF5A来自哪里Hfx。volcanii体外。然而,至少测试条件下,这种传输与没有被观察到Hfx。volcanii国土安全部。此外,的发展Hfx。volcanii不是由古典GC7国土安全部抑制剂抑制。我们提出一个模型deoxyhypusine合成的Hfx。volcanii不同于规范化真核途径,为进一步研究铺平了道路。

1。介绍

翻译起始因子5 (IF5A)是真核生物中高度保守的(eIF5A)和古菌(aIF5A),而细菌港同族体延长因子P (EF-P)。IF5A执行多个细胞内功能和参与细胞生长和死亡1,2]。虽然eIF5A和EF-P蛋白质被最初与翻译起始(1,3),最近的研究表明,它们所需蛋白质的高效的翻译包含polyproline伸展(Pro-Pro-Pro;Pro-Pro-Gly) [4- - - - - -10]。

主要IF5A和EF-P之间的差异存在,即使他们的核心功能在翻译是守恒的。首先,eIF5A和aIF5A至关重要(11,12而删除的细菌efp可以可行并导致一系列表型取决于有机体(13- - - - - -16]。第二,严格守恒的赖氨酸的转译后修饰(K50,人类eIF5A)为pN^ε(4-amino-2hydroxybutyl)赖氨酸或hypusine eIF5A活动和所需hypusine修改路径守恒在真核生物11]。相反,没有找到hypusine在细菌蛋白质EF-P相当于添加赖氨酸可以修改β赖氨酸残基(17- - - - - -21]或rhamnosylation [22,23]。

真核hypusine合成通路包含两个连续的步骤(11,24- - - - - -27]。第一个酶,deoxyhypusine合成酶(DHS),催化转让4-aminobutyl一半目标赖氨酸残基形成的亚精胺deoxyhypusine中间(26]。这中间由deoxyhypusine羟化羟化酶(DOHH)形成生物活性hypusinylated因素(11]。N¹-Guanyl-1 7-diaminoheptane (GC7),亚精胺同系物,非常有效地抑制hypusination绑定到国土安全部的第一步(28,29日]。在真核生物中,hypusine修改eIF5A发生后不久的合成eIF5A和没有池未改性蛋白质的检测(30.,31日]。有趣的是,尽管deoxyhypusine / hypusine修改是必不可少的在所有的真核生物,只有国土安全部是至关重要的酿酒酵母与deoxyhypusine eIF5A部分修改功能(1,3]。

古细菌aIF5A蛋白及其改性途径缺乏特点。国土安全部同系物存在于所有古细菌基因组测序;但是到目前为止,没有DOHH orthologue已被确定在任何古细菌基因组或蛋白质组(25,26),质疑这最后修改的本质古生菌。基于氨基酸组成数据分析报告的存在hypusine和deoxyhypusine古生菌(32]。在几个Crenarchaea像Hypusine检测硫化叶菌acidocaldarius,Pyrodictium occultum,Thermoproteus tenax,Acidianus ambivalens。然而,高水平的deoxyhypusine但没有或只有低水平的痕迹hypusine Euryarchaeota(即被发现。产烷生物,halobacteriales thermococcales和thermoplasmales) (32)和修改的具体性质aIF5A蛋白质从未证实了质谱仪(MS)的方法。增长抑制GC7一直在报道四个热点美国acidocaldarius,硫化叶菌solfataricus,Halobacterium halobiumDSM 670,Haloferax mediterraneiDSM1411 [33),这表明古deoxyhypusine途径至关重要,如真核生物。美国acidocaldariusaIF5A是迄今为止唯一的古细菌蛋白质的存在hypusine修改已经被实验证实了氨基酸组成(34]。国土安全部在古细菌基因组编码基因的存在,再加上GC7抑制的结果,强烈表明,deoxyhypusine古细菌,真核生物合成了类似的机制,但还存在很多问题。

亚精胺的4-aminobutyl捐赠者是真核国土安全部酶(11),但多胺发现古生菌的多样性表明这并不总是在这个王国的生活。事实上,亚精胺中检测出Thermococcus kodakarensis(35),在各硫化叶菌物种(36]和homospermidine(这也可能是一个aminobutyl捐赠者国土安全部(37)被发现是一个丰富的聚胺在产甲烷菌(38)(表S1)。然而,细胞内的成分分析了多胺在117年古细菌嗜盐菌菌株和微量的亚精胺和精胺被发现只有20株(39]。胍基丁胺似乎是此订单的主要积累聚胺(表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7316725)[36,40,41]。胍基丁胺的前体agmatidine必不可少的修改反密码子的摆动在古细菌胞嘧啶(42- - - - - -44]。胍丁胺是一个重要的古细菌代谢物,可以是合成的新创或打捞42]。更普遍,而古细菌聚胺代谢途径部分阐明了嗜热古菌(35,45),对聚胺通路在嗜盐古生菌。

结合代谢重建、遗传学、比较基因组学和生物化学研究中,我们阐明聚胺和aIF5A修改模型数据通路Haloferax volcanii。

2。实验程序

2.1。品种和生长条件

所有菌株、质粒和寡核苷酸用于本研究中列出表S2和S3。Hfx。volcaniiH26用作亲本菌株。大肠杆菌衍生品通常生长在LB-Lennox(磅)(费舍尔)或磅琼脂(费舍尔)37°C和在需要时补充与氨苄青霉素(Amp, 100年μg / mL)。Hfx。volcanii菌株生长在42°C丰富(写明ATCC 974)或最小的媒体(Hv_min)如前所述46]。新生霉素(0.1μg / mL)和琼脂(5 g / L)包括。尿嘧啶溶解到50毫克/毫升的100% (v / v) DMSO和添加到生长介质在最后50浓度μ克/毫升。转换的大肠杆菌和Hfx。volcanii进行如前所述[46]。

2.2。质粒和菌株结构

2.2.1。HVO_1958和HVO_2299删除

质粒用于删除HVO_1958和HVO_2299基因构造(如前所述44]。简单地说,~ 600 bp -和下游的地区HVO_1958和HVO_2299使用Phusion扩增从纯化菌进行基因组DNA聚合酶(内)和寡核苷酸插入表S3中列出,然后使用在融合(Clontech) pTA131,线性化通过消化生态国际扶轮和Xho由此产生的质粒,pIKB313 pIKB298,包含删除构造HVO_1958和HVO_2299,使通过之前分别被测序验证大肠杆菌Inv110(表达载体)。质粒是后来变成了Hfx。volcanii应变H26,删除菌株产生的pyrE2 -基于“突然出现/弹出"删除方法(47,48),与标准的媒体准备(46除了媒体补充了100年μ胍基丁胺为删除HVO_1958或有或没有1毫米腐胺的删除HVO_2299。删除HVO_1958被使用的引物PCR方法验证ext f和ext r(表S3),产生应变VDC3253(表S2)。

2.3。LSP5061

H26与pIKB298转换和生成突然出现47,48)与标准媒体准备。突然出现的十个独立殖民地汇集在一起,生长在液体产生主管细胞(47]。主管“突然出现应变”转变的pLSP21由克隆的质粒HVO_2299的控制下子到pJAM202导数pPT002(表S2)的2.5毫米色氨酸和新生霉素(0.1μg / mL)在生成弹出(LSP5061)之前的2.5毫米色氨酸和新生霉素(0.1μg / mL) (49]。删除HVO_2299从Hfx。volcanii基因组是由使用引物PCR方法验证fw - 391和rv - 391(表S3)。

2.3.1。TIF5A-C-Term他的要素

VDC2577,包含的本地副本aIF5A (HVO_2300)c端他(6 x),被转化生成的Hfx。volcaniiH26 pIKB473(表S2),构造如先前所述[44),表中列出的寡核苷酸S3。

2.4。生理学研究

2.4.1。压力条件

细胞受到不同压力条件下如[50]。简而言之,H26接种到5毫升写明ATCC 974,然后稀释到25毫升写明ATCC 974 OD的新鲜_600年0.0074。细胞生长在42°C 24小时以达到早期指数增长阶段()压力之前申请4小时(氧化和冷休克)或24小时(蛋白酶抑制剂)。氧化应激诱导的H₂O₂最终浓度为0.78% (w / v) 4小时42°C用颤抖(200 rpm)。冷休克,细胞生长在30°C 4小时用颤抖(200 rpm)。蛋白酶体抑制剂,bortezomib (LC实验室),增加了100μ米决赛中描述浓度(51]。文化是孵化用颤抖(200 rpm) 42°C 24小时。压力后,增长是监控和2毫升的OD文化_600年免疫印迹分析0.043是收获。

2.4.2。文化GC7的存在

监测N的影响¹-guanyl-1, 7-diaminoheptane (GC7)(圣克鲁斯生物技术)Hfx。volcanii增长,H26接种到5毫升的写明ATCC 974中、成长记录的阶段。细胞被亚文化为5毫升新鲜Hv_min介质到对数生长期。细胞(1毫升OD_600年= 1)洗4次Hv_min介质和连续稀释Hv_min介质spot-plated (15μL)在固体Hv_min琼脂缺席或者1毫米GC7的存在。细胞生长在45°C为4天。实验用两个生物复制(即。,two independent cultures) and three technical duplicates (three measurements per culture).

2.4.3。文化胍基丁胺的存在

Hfx。volcaniiH26 (WT、家长)和(VDC3253)生长在5毫升写明ATCC 974中补充了毫米胍基丁胺在42°C。细胞被亚文化为5毫升Hv_min介质在42°C。48小时后细胞生长固定相(42°C)洗4次Hv_min媒介。细胞密度被稀释到OD规范化_600年1和连续稀释spot-plated (15μL)固体琼脂Hv_min中没有或胍基丁胺的存在(1μ米或5μ米)。每个实验进行了两个生物复制和三个技术复制。

2.5。多胺的分析

2.5.1。样品制备

H26是生长在1 L Hv_min介质的2.8 L Fernbach烧瓶在42°C (200 rpm)。在不同的点的增长(早期指数OD_600年= 0.0805,mid-exponential OD_600年= 0.86,指数OD_600年= 1.2),细胞收获5500 rpm(3000年SLA, Sorvall) 40分钟在4°C,然后用50 mM玫瑰,2 M氯化钠,pH值8缓冲区。前颗粒在液态氮冷冻干燥。实验用两个生物复制。

2.5.2。聚胺类萃取

适当的细胞(7至110毫克)转移到一个埃普多夫管和悬浮在1毫升10%三氯乙酸溶液。1分钟的暂停动摇了多次并保持在室温下过夜。暂停然后离心机和上层清液过滤使用0.2μ为了消除粉尘滤膜。必要时滤液稀释在水和应用聚胺分析仪。

2.5.3。多胺的分析

分析了多胺与CK10S列(8.0×70毫米,三菱透)如前所述[52]。简而言之,列了2型缓冲(柠檬酸缓冲含125 g / L(氯化钾)60°C, 2毫升/分钟的流量。多胺被发现使用o -苯二醛和荧光λ450海里(励磁λ340海里)被记录。记录图表分析了如前所述[52]。对于每一个生物样品,两个复制技术进行了分析。所使用的标准是2.0的混合物μ胍基丁胺和2.8μ尸胺。

2.6。蛋白质纯化

2.6.1。aIF5A-His-C-Term净化

大肠杆菌罗塞塔gami 2 (DE3) (Novagen)株新鲜与质粒转化pLSP24生长在1磅Amp在2.8 L Fernbach烧瓶在37°C (200 rpm)在2%葡萄糖。异丙基β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)添加到最后一个0.4毫米在记录阶段(OD的浓度_600年0.4 - -0.6的单位),文化转移到25°C收获前3小时(200 rpm)。细胞被离心收获(5000×g 4°C, 15分钟)和存储在−80°C。细胞(十克湿重)在20 - 25毫升20毫米resuspended Tris-HCl pH值8和2 M氯化钠(缓冲),通过三次打破由法国媒体在2000 psi的压力。经过15分钟的离心3000×g (4°C)删除完整的细胞,上层清液过滤是0.8μ醋酸纤维素膜(费舍尔科学,美国)。当时上层清液应用于惠普HisTrap列(1毫升,通用电气医疗集团)preequilibrated和40毫米咪唑与缓冲,洗在室温下用同样的缓冲。aIF5A-C-term他蛋白质从列筛选了20毫米Tris-HCl pH值8、2 M氯化钠,500毫米咪唑(缓冲B)。纯化蛋白免疫印迹蛋白质进行检测和/或Coomassie蓝色r - 250染色后10% sds - page分离。纯化蛋白质被三氯乙酸沉淀(TCA)所描述的桑切斯(53在sds - page)在装货前。

2.6.2。T7-His-DHS

Hfx。volcaniiLSP5021 (H26携带pLSP23)是用于T7-His-DHS的净化。LSP5021(40克湿重)在80毫升resuspended缓冲和破碎,通过三次通过法国媒体的压力像之前描述的那样2000 psi。短暂,上层清液应用于惠普HisTrap列(5毫升,通用电气医疗集团)。的分数是透析过夜对1 L a缓冲示例应用羟磷灰石列(HTP)(25毫升)preequilibrated缓冲区1毫升/分钟的流量和筛选了连续梯度Tris-HCl 20毫米,2 M氯化钠,400毫米磷酸钠pH值8。收集1毫升的分数。T7-His-DHS被筛选了从列40毫米的磷酸钠缓冲的洗出液集中(分子量3000道尔顿Vivaspin切断,缝匠肌Stedim生物技术)和应用于Sephacryl s - 200人力资源与缓冲凝胶过滤柱平衡流量为0.3毫升/分钟。收集1毫升的分数。

2.6.3。净化的IF5A和国土安全部酿酒酵母和Thermococcus kodakarensis

相应的蛋白质编码序列的克隆到pET28a(+)向量和一个额外的(6 x)中描述他和TEV裂解位点利用低聚糖对补充数据表(S3)。蛋白质在BL21中大肠杆菌细胞生长在37°C从一夜之间文化存在50磅μg / mL卡那霉素。蛋白表达在OD诱导_600年最后一个1毫米IPTG浓度的0.4(罗斯)。1小时后细胞表达细胞溶解使用microfluidizer(美国microfluidizer处理器微流体牛顿)。细胞溶解产物清除使用SS34转子(Sorvall)在4°C和44100 g×30分钟。净化His-tagged蛋白质是完成Protino Ni-NTA琼脂糖珠(Macherey-Nagel)。最后洗出液应用到Superdex一项价值16/60美金HiLoad列(通用电气医疗集团)收益率的最后浓缩蛋白质凝胶过滤缓冲区(50毫米消息灵通的pH值7.4,50 mM氯化钾,100毫米氯化钠,和5毫米2-mercaptoethanol)。

2.7。Deoxyhypusine合酶测定

2.7.1。Thermococcus kodakarensis

国土安全部修改试验是在75年存在的表现μM放射性(¹⁴C]亚精胺三盐酸化物(通用电气医疗集团)或3μM腐胺盐酸盐(1,4 -³H (N)](珀金埃尔默)。反应混合物包含基板5μ米的酿酒酵母eIF5A或t . kodakarensisaIF5A以及2毫米烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺),2.5μ米酿酒酵母国土安全部,或t . kodakarensis国土安全部在0.2 M glycine-NaOH缓冲区,pH值9.4(总量30μL)。在37°C, 120分钟的孵化后的放射性标记的deoxyhypusine Tricine-PAGE凝胶监控使用16.5%,随后干和暴露于高性能放射自显影法电影(通用电气医疗集团)。颜色Prestained广泛蛋白质标准(内)被用来作为分子量标记。

2.7.2。Haloferax volcanii

国土安全部测试在细胞提取overexpressing国土安全部。国土安全部试验,试验是在75的存在μM放射性(¹⁴C]亚精胺三盐酸化物(111 mCi /更易,通用电气医疗集团)或3μM腐胺盐酸盐(1,4 -³H (N)] (62 Ci /更易,珀金埃尔默)。每30μL示例包含20μL (Hfx。volcanii提取(overexpressing国土安全部3毫克/毫升)的浓度,5μL(1.5毫克/毫升Hfx。volcaniiaIF5A 1μL(100毫米烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和相应的底物。所有的样品都在42°C的环境为2小时。由于高盐浓度的存在Hfx。volcanii提取所有样品受到缓冲区交换(50毫米玫瑰,100毫米K (OAc)和25毫米毫克(OAc))通过Amicon超0.5毫升Ultracel凝胶电泳前3 K(默克密理博)。最后的样品分离Tricine凝胶16.5%。的评价蛋白质光谱多色低量程大小梯(热科学)使用。干凝胶被暴露于高性能放射自显影法电影(通用电气医疗集团)评估aIF5A修改由国土安全部的发生在各自的样本。控制样品和酿酒酵母国土安全部的描述就做好了准备t . kodakarensis国土安全部化验。测试的活动Hfx。volcaniiT7-His-DHS 200 pmol放射性多胺(胍基丁胺、腐胺、亚精胺)和20 pmol T7-His-DHS 100 pmol的存在与否Hfx。volcaniiaIF5A 0.3 glycine-NaOH pH值9.0,2 M氯化钠,1毫米NAD 1小时40°C。

2.7.3。合成放射性标记的胍基丁胺

由于放射性标记的胍基丁胺不是商业化,这是形成从[¹⁴C]精氨酸(珀金埃尔默)使用精氨酸脱羧酶(说)。质粒pAS1(携带speA-C-term-His)转换成BL21大肠杆菌的年代火车(Novagen)和磅媒体表示。文化(200毫升)与1毫米IPTG诱导OD_600年= 0.6,成长为另一个3小时30°C。三十分钟前感应,说法引起增加1%(最终浓度)的乙醇到磅媒体。蛋白质纯化使用Ni-NTA旋转列(试剂盒)根据制造商的协议,其次是缓冲交换(成50毫米消息灵通的pH值7.4,10毫米MgCl₂,100毫米氯化钠,氯化钾50毫米,5毫米beta-mercaptoethanol, 2%甘油)使用PD10脱盐列(通用电气医疗集团)。胍基丁胺合成从[¹⁴C]精氨酸(124金刚石/ pmol)说在0.3进行glycine-NaOH pH值9.0,10毫米MgCl₂在37°C, 1毫米PLP 1小时。反应的进度监控使用硅板(默克密理博)开发的丁醇/乙酸/吡啶/甲醛3:3:2:1和暴露于高性能放射自显影法电影(通用电气医疗集团)。

2.8。分析方法

2.8.1发布。蛋白质浓度

蛋白质浓度测定bicinchoninic酸法(54](热科学皮尔斯BCA蛋白质化验设备,罗克福德,IL)与牛血清白蛋白(BioRad)作为蛋白质标准。

2.8.2。电泳

蛋白质样品在相同的体积比混合2 x加载缓冲区(包含125毫米Tris-HCL pH值6.8,20毫米β巯基乙醇,4% (w / v) SDS, 20% (v / v)甘油,0.01% (w / v)溴酚蓝)和煮15分钟。样本12% SDS - page分离或梯度凝胶4 - 15% (Biorad),使用mini-Protean三世细胞电泳仪(Biorad)在室温20 mA恒流运行缓冲25毫米三羟甲基氨基甲烷和190毫米甘氨酸液pH值8.3与0.1% (w / v) SDS。迁移之后,蛋白质染色凝固态Coomassie蓝色r - 250或被免疫印迹检测。

2.8.3。西方墨点法

aIF5A分析在写明ATCC的增长42°C, H26细胞(2毫升0.043 OD的文化)通过离心收获(14000×g, 10分钟,25°C)和治疗之前所描述的。蛋白质是由sds - page分离(梯度凝胶4 - 15%,Biorad)和转移到PVDF膜(通用电气医疗集团)。相当于蛋白质加载基于OD_600年细胞培养(0.086单位每车道)和染色证实并行凝胶Coomassie蓝色。aIF5A蛋白质通过免疫印迹检测使用TIF5A2(1/10,000)或TIF5A3(1/5,000),紧随其后的是一个次要anti-rabbit IgG抗体(合)(1/5,000)(美国GenScript)。兔多克隆抗体TIF5A2和TIF5A3生产使用,分别合成肽CEIEYLEYEGQRKIV和MAKEQKQVRELQEGC(美国GenScript)。膜是可视化通过化学发光使用西方发射极耦合逻辑清晰(Biorad)和x射线胶片(费舍尔)。aIF5A c项与反C-term-His-HRP检测稀释1/5,000(表达载体)。deoxyhypusine / hypusine修改检测抗体iu - 88(1/1,500)所描述的55]。

2.9。质谱分析

简而言之,aIF5A凝固态消化了LysC和光)(kouichi根据舍甫琴科的协议等。56]和脱盐C18-StageTips [57]。肽被反相液相色谱分离(LC) Dionex终极RSLCnano 3000系统(热费希尔科学)。信用证条件如下:30分钟3 - 40% B梯度(0.1%的甲酸,B: 0.1%甲酸/乙腈80%)200 nL /分钟的流量,使用75年μm×300毫米熔融石英发射器(新目标,美国)内部充满了Reprosil-Pur C18-AQ 3μ米粒子(Maisch博士,德国)。筛选了肽是直接喷到Q Exactive质谱仪(热费希尔科学)在视经营模式与10 MS / MS扫描(指标= 25)被记录为每个前体离子扫描。峰列表数据库搜索使用MSConvert准备。数据库搜索与吉祥物2.3执行搜索引擎(矩阵科学)对蛋白质序列数据库包含aIF5A序列和常见的污染物的蛋白质,如胰蛋白酶和角蛋白。搜索参数5 ppm前体质量公差,0.02 Da Orbitrap MS / MS质量公差,和三个错过分裂+一个数量的变量修改如氧化(M)、hypusinylation (K),和deoxyhypusinylation (K),肽点击返回的吉祥物是手动验证和注释使用xiSPEC (http://spectrumviewer.org/)。

2.10。生物信息学

从NCBI获得基因序列。爆炸工具(58NCBI)和资源(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)是经常使用。多重序列比对建成使用Clustalω(59]或MultAlin [60]。蛋白质域分析了使用数据库工具包含了[61年]。与TMHMM服务器跨膜螺旋预测v . 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm - 2.0 /)[62年]。分析的系统发育分布和物理集群进行字符串(http://string-db.org/)(63年)和种子数据库(64年]。

3所示。结果与讨论

3.1。多胺代谢的代谢重建和aIF5A修改Hfx。volcanii

亚精胺的捐赠者是真核国土安全部酶(11]。在最近的一次回顾聚胺代谢在生活的所有王国(37),古生菌的聚胺合成的核心起动通路通过精氨酸,精氨酸脱羧酶进行脱羧反应的酶(ADC)。代谢重建Hfx。volcanii表明大部分的核心生物合成途径合成的亚精胺存在(图1(一))。两种形式的ADC中发现古生菌(37]。第一个类型是pyruvoyl-dependent酶,和相应的基因(TK0149)对增长至关重要t . kodakarensis(65年]。第二是假字AdoMet脱羧酶能脱羧基精氨酸(AdoMet直流),发现主要在Crenarchaeota [37]。就像t . kodakarensis,Hfx。volcanii港口的相同器官pyruvoyl-dependent类型编码HVO_1958(图1(一))[66年]。

提出了古细菌亚精胺通路中的下一步是腐胺的形成由agmatinase /胍基丁胺水解ureohydrolase (AUH)酶。AUH酶的海床horikoshii和Methanocaldococcus jannaschii已经从生物特征(67年,68年),但没有热点突变。一个agmatinase家庭成员,HVO_2299,发现在Hfx。volcanii并可能催化这个反应(图1(一))[66年]。

最后,亚精胺合成酶转移3-aminopropyl一部分从脱羧腺苷甲硫氨酸(dcAdoMet)腐胺。两个成员的家庭中发现亚精胺合成酶Hfx。volcanii:HVO_0255和HVO_B0357(图1(一))[66年]。删除的HVO_B0357基因没有产生任何表型测试条件下(44]。有趣的是,氨基的区域HVO_0255和HVO_B0357和嗜盐的同源染色体包含七个跨膜域(n端运输车像域)(图S1A)。氨基运输车的存在域在这两种蛋白质和腐胺的绑定残留在论文并不守恒的嗜盐的滚筒同系物(图印地)表明,这些蛋白质可能会有其他还未确定的角色。

而AdoMet直流存在t . kodakarensis(69年),没有发现AdoMet DC的同系物Hfx。volcanii或更一般的任何排序嗜盐菌(数据没有显示)。这就提出了一个问题:dcAdoMet潜在来源的一个假定的亚精胺合成酶的反应。

聚胺代谢相关基因推定地Hfx。volcanii包括HVO_0339基因编码的基本agmatidine合成酶tia(图1(一))[44)和HVO_B0045和HVO_B0046基因预测编码l2, 4-diaminobutyrate脱羧酶和l2, 4-aminobutyrate转氨酶。已经提出,这两个酶参与的合成1,3-diaminopropane-based rhizobactin 1021或schizokinen等含铁细胞(70年]。

两个国土安全部的家人在Hfx。volcanii HVO_2297和HVO_B0182(66年]。的HVO_2297基因与基因编码aIF5a物理集群(HVO_2300)(图2)。据我们所知,的活动HVO_2300(如aIF5A)从未通过实验验证,该基因是必要的(12]。因此,HVO_2297是一个潜在的候选人规范化DHS酶和HVO_B0182可以参与homospermidine合成提出的(37)(图1(一))。

总结,如图1,代谢重建只能初步聚胺代谢(图的照片1(一)(数据)和aIF5A改性途径1 (b),1 (c),1 (d))Hfx。volcanii。国土安全部可以转移aminobutyl组从亚精胺aIF5A(图1 (b)),但目前还不清楚如果亚精胺通路存在于这种生物因为没有AdoMet直流基因可以被识别(图1(一))。其他的可能性已经部分讨论(37),Hfx。volcanii国土安全部(i)转移直接腐胺(图1 (b))或aminobutyl群胍基丁胺aIF5A(图1 (c))和(2)转移aIF5A胍基丁胺,与agmatinase作用于修改后的蛋白质底物产生deoxyhypusinylated导数(图1 (d))。

3.2。Hfx。volcanii整个生长曲线和Deoxyhypusinylated aIF5A表示在活的有机体内

的Hfx。volcanii基因预测编码aIF5a (HVO_2300)是至关重要的12),但其他知之甚少这个基因/蛋白在这个有机体。获得更好的理解aIF5A古生菌和特别嗜盐aIF5A水平在不同生长阶段被免疫印迹使用监控Hfx。volcaniianti-aIF5A抗体(TIF5A2和TIF5A3)(数据3(一个)和3 (b))。两个独立抗体检测aIF5A约20 kDa的预期理论质量14.2 kDa。观察到的大小差异最可能是由于已知的缓慢流动的嗜盐的蛋白质sds - page (71年- - - - - -73年]。类似的检测到了aIF5A蛋白质含量多达25小时的增长,之后aIF5A减少(图的水平3 (b))。很少有研究的规定eIF5A在真核生物,但它已经表明eIF5A水平监管proteasome-dependent的方式(74年,75年]。不同压力的影响(蛋白酶体抑制剂、冷休克和氧化应激)的水平aIF5A因此监控(如部分所述2)。我们没有注意到任何影响蛋白酶体抑制剂(图S2A)或冷休克aIF5A水平(数据没有显示)。有趣的是,0.78% (w / v)的H₂O₂导致细胞溶解产物蛋白质模式(图的变化3 (c))。相同数量的细胞(OD),额外的高分子量乐队(约85 kDa)观察(图3 (c))。乐队在85 kDa可能是蛋白质的结果修改或聚合由于压力。需要额外的工作来理解机制,调节aIF5A古生菌和更一般的氧化应激的影响Hfx。volcanii蛋白质组。

为了确定Hfx。volcanii修改aIF5A hypusine或deoxyhypusine,蛋白质的纯化是一个明显的同质性作为18 kDa蛋白质(图开通)应变VDC2577 (TIF5A-C-term要素)通过亲和色谱法。我们能够探测到deoxyhypusine / hypusine修改使用国际单位- 88抗体的纯化aIF5A [55](Mirmira博士的礼物)(图开通。iu - 88抗体未能发现修改aIF5A细胞溶解产物在不同生长阶段(数据未显示)。作为这一抗体识别deoxyhypusine和hypusine eIF5A形式(55),18 kDa蛋白质带被切割的sds - page,与LysC消化,通过质谱(图分析3 (d))。这个分析证实,纯化蛋白aIF5A-modified与deoxyhypusine守恒的赖氨酸(36)位置(图3 (d))。此外,当比较普通的强度,hypusinylated, deoxyhypusinylated PGKHGSAK肽,大约99%的aIF5A蛋白质是deoxyhypusinylated。我们的结果证实了先前的观察氨基酸的分析存在deoxyhypusine嗜盐菌(32),显示女士第一次的Hfx。volcaniiaIF5A deoxyhypusinylated。我们的数据表明,Hfx。volcaniiaIF5A只deoxyhypusinylated细胞中,没有发现修改的aIF5A池净化分数和与缺乏DOOH同系物在这个有机体。事实上,在真核生物hypusination eIF5A似乎本构的hypusination蛋白质合成,没有证据表明修改后不久发生人事变动(30.,31日,76年,77年]。我们建议deoxyhypusinylated aIF5A是活跃的形式Hfx。volcanii,因为它已被证明酿酒酵母这部分修改deoxyhypusine eIF5A是功能1,3]。

3.3。细胞内多胺的合成Hfx。volcanii

之前聚胺成分分析研究嗜盐古生菌进行了在不同的媒体类型取决于特定生物调查研究,使得它难以比较的结果。实际上,当细胞生长在富裕的中等污染与回收的多胺可以发生(40]总结如表S1。获得更多的信息,细胞内聚胺成分Hfx。volcaniiH26由高效液相色谱分析。提取细胞内多胺在不同生长阶段(20小时,35小时,40小时)的细胞生长在基本培养基(Hv_min)。两个主要的山峰被发现在胍基丁胺、尸胺(图的位置4)。在这种情况下,没有观察到多胺成分的变化在增长(图4和图S3)。胍基丁胺被发现多聚胺的增长阶段(图4 (b)和图S3)。这个结果证实了先前的研究分配胍基丁胺的主要聚胺在嗜盐古生菌和Hfx。volcanii(表S1) (41,78年- - - - - -80年]。Hamana等人报道时少量的腐胺的存在Hfx。volcanii生长在富裕介质(41)(表S1)(中等NCIMB 2012 30°C)。这个结果并不是复制在基本培养基。尸胺的存在并不是预测从最初的代谢重建(图1(一))。它已被证明在某些细菌,l2 4-diaminobutyrate脱羧酶,参与含铁细胞合成,也可以作为赖氨酸脱羧酶(70年]。我们的研究结果表明,这种情况也可以Hfx。volcanii随着基因HVO_B0045预测编码l2, 4-diaminobutyrate脱羧酶。尸胺曾被报道在一些嗜盐古生菌(表S1),它可能有一个这些生物作用的抗高盐由于这代谢物与pH值和抗盐性81年,82年]。亚精胺的缺乏也与以前的工作相一致(表S1)和事实不编码由dcSAM合成的酶Hfx。volcanii(图1(一))。这些结果提出的问题。同源染色体的作用(HVO_0255和HVO_B0357在这个数据)。

3.4。精氨酸脱羧酶的增长至关重要Hfx。volcanii

确认HVO_1958编码一个精氨酸脱羧酶基因被删除(图S4A-B)和删除应变的增长与母公司(H26)没有(图42°C5(一个))或胍基丁胺(数字5 (b)和5 (c))。的HVO_1958应变胍基丁胺和需要5营养缺陷型的吗μM胍丁胺对全面增长(图5 (c)),因此重命名。部分增长是观察胍基丁胺浓度较低(图5 (b)< 1),但没有观察到经济增长μ胍基丁胺(数据未显示)。正如已经看到的t . kodakarensis 应变(65年),经济增长的Hfx。volcanii 突变体只能胍基丁胺所救,而不是任何其他测试多胺如腐胺、亚精胺、尸胺、或鸟氨酸(图S5)。此外,添加多胺在媒体上对亲本菌株的生长没有影响Hfx。volcaniiH26(图S5)。这些遗传实验支持的模型HVO_1958ADC编码是第一个酶聚胺合成的Hfx。volcanii产生必要的中间胍基丁胺(图1(一))。基因研究证实了我们的多胺分析自删除预测精氨酸脱羧酶基因(HVO_1958)导致了胍基丁胺营养缺陷型菌株。产生的胍基丁胺Hfx。volcaniiADC当然是一个前兆的形成基本agmatidine tRNA改性催化tia(图1(一)),但是它也可以形成所需的基本deoxyhypusine修改直接衬底国土安全部(数字1 (c)和1 (d))或最后聚胺的前体的基质国土安全部反应(数字1(一)和1 (b))。

3.5。HVO_2299基因编码一种Agmatinase-Like蛋白质,是至关重要的

上述代谢重建暗示的作用HVO_2299胍基丁胺作为agmatinase参与形成腐胺(图1(一))。然而,腐胺和亚精胺下游产品中检测出我们的聚胺的分析Hfx。volcanii(图4)。获得进一步的洞察agmatinase的作用,基因的社区HVO_2299探讨了(图2)。我们的分析发现了强大的物理集群之间的关联aIF5A和agmatinase编码基因,以39%的古细菌基因组中字符串数据库(130年的古细菌基因组)显示本协会(图2)。这些集群几乎只观察到Euryarchaeota和在场~ 62% Euryarchaeota和非保密古生菌嗜盐的archaeon DL31。有趣的是,该协会aIF5A/agmatinase没有发现Crenarchaeota门,在哪里aIF5A被发现与基因编码DNA拓扑异构酶IV B亚基,DNA拓扑异构酶六世亚基,国土安全部(数据没有显示)。物理集群证据强烈指出HVO_2299在aIF5a修改。这个agmatinase-like蛋白质可以参与中间腐胺的形成(图1(一)),即使它没有被发现在我们的分析或直接水解改性aIF5a前体形成最后deoxyhypusine修改(图1 (d))。

调查如果HVO_2299是必不可少的Hfx。volcanii细胞生存能力,我们试图删除从其染色体的基因位点。大约220名候选人殖民地获得突变体筛选,但没有删除显示这个基因的重要性。基因的删除失败甚至在1毫米腐胺的存在。然后我们继续克隆的HVO_2299到pPT002质粒,tryptophanase下的基因启动子(49,83年]。质粒转化为“突然出现的压力。“在此背景下,可以删除的染色体拷贝HVO_2299(无花果。S4 c - d),再次强烈建议基因的重要性。然而,增长仍然观察到在缺乏色氨酸,当然由已知的泄漏造成的启动子在multicopy质粒(49]。

这一事实HVO_2299基因编码一种蛋白质agmatinase-like至关重要甚至在腐胺的存在,以及没有任何检测到细胞内的腐胺,表明这种酶没有参与胍基丁胺的腐胺的形成Hfx。volcanii。一个,但是,不能排除这种可能性,腐胺不进口这种生物,必须生产新创并立即用来修改aIF5a国土安全部(图1 (b)),减少其积累检测以下限制。这是不可能的所有基因编码亚精胺、腐胺ABC转运蛋白[PotA1 (HVO_A293)和PotA2 (HVO_A293),PotB (HVO_A300),PotC (HVO_A297)和PotD(HVO_A299)中发现的Hfx。volcanii在pHV4质粒基因组物理集群(数据未显示)。如果运输单元中腐胺,然后的重要性HVO_2299将支持一个模型,其中agmatinase蛋白可能是水解后胍基丁胺基转移aIF5A(图1 (d))。需要进一步努力卧底agmatinase-like蛋白质的功能Hfx。volcanii。

3.6。在Euryarchaeota Deoxyhypusine合酶活动

-Guanyl-1 7-diaminoheptane (GC7)是一种非常有效的抑制剂国土安全部在真核生物。这种同族体的亚精胺抑制的第一步hypusination国土安全部(途径28,29日]。文化的硫化叶菌acidocaldariusDSM 639,硫化叶菌solfataricusDSM,Halobacterium halobiumDSM 670,Haloferax mediterraneiDSM GC7[被证明是敏感33]。确定GC7的效果Hfx。volcanii文化,H26生长在没有或有1毫米GC7在Hv_min琼脂42°C。如图6(一),我们没有观察到任何影响GC7 H26即使它应该是运输的增长预测的亚精胺/ ABC转运蛋白存在于腐胺Hfx。volcanii。相同的结果观察液体文化,虽然复合影响增长酿酒酵母文化像预期的那样(数据没有显示)。

确定的国土安全部Hfx。volcanii将4-aminobutyl转移一部分从亚精胺Hfx。volcaniiaIF5A赖氨酸侧链,表达的蛋白质Hfx。volcanii(LSP5021)。蛋白质T7-His-DHS纯化是四聚物,估计分子量约148 kDa(无花果S6)。低聚态纯化国土安全部的协议与人类的晶体结构和其他特征国土安全部酶(84年- - - - - -86年]。反应的底物,Hfx。volcaniiaIF5A-C-term-His,过表达大肠杆菌在两个步骤和纯化。的纯化Hfx。volcaniiT7-His-DHS没有显示任何活动在不同aIF5A浓度和底物浓度(亚精胺,胍丁胺、尸胺、腐胺)(数据没有显示)。为了确定缺乏行动的国土安全部的存在是由于T7-His标签,没有表达的蛋白质标记和国土安全部活动进行了测试Hfx。volcanii细胞溶解产物。没有国土安全部活动中检测出细胞溶解产物(图七)。缺乏活动并不是由于缺陷的Hfx。volcaniiaIF5A-C-term-His衬底,因为酿酒酵母国土安全部催化转移4-aminobutyl一部分从亚精胺Hfx。volcaniiaIF5a-C-term-His(无花果。S7巷11)。国土安全部GC7[序列从古生菌敏感34)(图S8, A组)和嗜盐古生菌,港聚胺尸胺Hfx。volcanii(无花果。S8, B组)对齐和活性部位和亚精胺基质绑定残留映射。如果活动网站K329(人类,P49366)是严格守恒的从人类所有热点国土安全部蛋白质、亚精胺绑定网站残留物(图S8)。亚精胺绑定的残留物(H288)是严格守恒的A组在真核生物和古菌(敏感GC7)但这残留并不守恒在B组古菌(港尸胺)。这些差异可以解释为什么GC7和亚精胺不绑定Hfx。volcanii国土安全部。本研究打开了国土安全部在喜盐生物有机体的问题。

进一步控制,在体外国土安全部Euryarchaeota是探索的另一个成员的活动。重组从嗜热的国土安全部t . kodakarensis及其底物aIF5A纯化和活动测试存在的放射性亚精胺、腐胺。类似于真核酶(图6 (b)、巷1)的国土安全部t . kodakarensis转移4-aminobutyl从亚精胺t . kodakarensisaIF5A在体外(图6 (b),莱茵3)。没有观察到没有转移酶(图6 (b)巷4)或在腐胺的存在(图6 (b)巷7),修改t . kodakarensisaIF5A被质谱分析表明存在守恒的赖氨酸的deoxyhypusine K42(图S9)。

GC7的没有任何影响Hfx。volcanii增长以及无法观察转移4-aminobutyl表明亚精胺不是的衬底Hfx。volcanii国土安全部、确凿的代谢重建,没有检测到细胞内的亚精胺。我们不能排除这种可能性,GC7不是导入细胞,尽管亚精胺、腐胺的存在,ABC转运蛋白基因Hfx。volcanii国土安全部提纯的一种活动形式。不幸的是,我们试图测试不同模型(数据1 (b),1 (c),1 (d)通过测试的活动Hfx。volcanii国土安全部的蛋白质在体外仍然不成功。我们可以净化一个活跃aIF5A deoxyhypusinylated与酿酒酵母国土安全部使用亚精胺作为aminobutyl捐赠者,但所有的尝试Hfx。volcanii国土安全部没有使用亚精胺、腐胺或胍基丁胺作为捐赠者。然而,我们可以显示第一次在体外活动的t . kodakarensis国土安全部与亚精胺的转让4-aminobutyl aIF5A,真核生物。

4所示。结论

我们已经表明,Hfx。volcaniiaIF5A deoxyhypusinylated。亚精胺的缺失Hfx。volcanii确认,这个数据被发现的主要聚胺类胍基丁胺、尸胺。我们建议deoxyhypusine合成Hfx。volcanii不同于典型的真核途径。根据我们的观察,(我)GC7抑制酵母国土安全部的亚精胺模拟,不抑制Hfx。volcanii增长,(ii)agmatinase-like基因的集群国土安全部基因对的发展至关重要Hfx。volcanii甚至在腐胺的存在,和(3)没有活动的Hfx。volcanii国土安全部与亚精胺,我们支持模型图1 (d),国土安全部转移胍基丁胺aIF5A赖氨酸和agmatinase酶生产deoxyhypusine是必需的。

非标准缩写

ADC:	精氨酸脱羧酶
AdoMet DC:	AdoMet脱羧酶
Amp:	氨苄青霉素
AUH:	Agmatinase /胍基丁胺ureohydrolase
dcAdoMet:	脱羧腺苷甲硫氨酸
国土安全部:	Deoxyhypusine合酶
DOHH:	Deoxyhypusine羟化酶
eIF5A:	真核起始因子5
aIF5A:	古细菌5启动因素
GC7:	-Guanyl-diaminoheptane
HTP:	羟磷灰石列
LC:	液相色谱法
柠檬酸:	三氯乙酸
IF5a:	翻译起始因子5。

信息披露

伊恩·k·Blaby目前的地址是生物系,布鲁克海文国家实验室,建立463年,50个贝尔大道,厄普顿,11973年纽约,美国。Agata l . Starosta中心目前的地址是细菌细胞生物学、细胞与分子生物科学研究所,纽卡斯尔大学英国纽卡斯尔。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突声明。

确认

作者感谢美国沉没在佛罗里达大学ICBR桑格DNA测序的基因组学的核心。他们感激地承认克里斯托弗·加德纳FPLC系统。他们感谢Mirmira博士向他们提供iu - 88抗体。他们感谢Thiaville博士构建pPT002 pJAM202的导数,Maupin-Furlow博士的一种礼物。这项工作是由国家卫生研究院R01 GM7064 (v . de Crecy-Lagard)和德意志Forschungsgemeinschaft WI3285/4-1 (d·n·威尔逊)。

补充材料

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