替代路线的血红素产甲烷Archaeon甲烷八叠球菌属巴氏细菌

文摘

在生物体血红素形成的共同前体uroporphyrinogen三世通过两个显著不同的途径之一。与真核生物和大多数细菌采用所谓的“经典”血红素生物合成途径,古生菌使用另一种路线。在这个途径,血红素是由通过中间体precorrin-2 uroporphyrinogen三世,sirohydrochlorin, siroheme, 12日18-didecarboxysiroheme, iron-coproporphyrin三世。在这个研究血红素生物合成蛋白质AhbAB AhbC, AhbD甲烷八叠球菌属巴氏细菌功能特点。使用一个在活的有机体内酶活性测定结果表明,AhbA和AhbB (Mbar_A1459和Mbar_A1460)催化siroheme转化为12,18-didecarboxysiroheme。两种蛋白质组成heterodimeric复杂可能受到反馈通路最终产品监管的血红素。此外,AhbC (Mbar_A1793)催化iron-coproporphyrin三世的形成在活的有机体内。最后,重组AhbD (Mbar_A1458)生产的大肠杆菌和纯化表明这种蛋白质最有可能包含两个[4 fe-4s]集群。使用一个在体外酶活性测定是证明AhbD催化iron-coproporphyrin三世的转换成血红素。

1。介绍

血红素作为一个重要的辅基在许多酶参与基本生物过程在几乎所有生物(1]。在真核生物和大多数细菌,通过守恒的血红素生物合成的收益,“古典”特征路径(2]。相比之下,血红素形成通过另一种路线的古生菌和细菌硫酸盐还原等脱磷孤菌属物种(3- - - - - -9]。在古典和替代途径,5-aminolevulinic酸(ALA)作为血红素形成的共同前体转化为生物合成的中间uroporphyrinogen III (UROGEN)连续三酶步骤。经典通路中的UROGEN然后转化成血红素通过中间体coproporphyrinogen三世,protoporphyrinogen IX,原卟啉IX [2]。

相比之下,在另一种血红素生物合成路线UROGEN是甲基化收益率precorrin-2然后进一步转化为血红素通过中间体sirohydrochlorin siroheme (SH), 12日18-didecarboxysiroheme (DDSH)和iron-coproporphyrin三世(Fe-COPRO III)(图1(一))[6]。而将近20年了,大家就都知道替代路线的第一步年代-adenosyl-L-methionine (SAM)依赖UROGEN precorrin-2[的甲基化7- - - - - -9),其余步骤替代血红素生物合成途径的阐明最近才(6]。古细菌基因组的完整测序的生物信息学分析显示存在潜在的血红素生物合成基因簇组成的“早期”哼哼UROGEN的形成和几个所需基因近红外光谱例如基因编码蛋白质的同源酶参与血红素生物反硝化细菌(图1 (b))[3]。相似的基因也确认等硫酸盐还原细菌的基因组脱磷孤菌属寻常的Hildenborough或脱磷孤菌属desulfuricans(6,10]。因为大多数古生菌和硫酸盐还原菌不具有细胞色素cd₁亚硝酸盐还原酶,因此不合成血红素,这是推测的近红外光谱——基因的基因组中标识这些生物可能参与血红素生物合成。随后,这是显示在体外相应的重组Nir-like蛋白质d .寻常的Hildenborough和d . desulfuricans确实能够促进逐步siroheme转化为血红素,即替代血红素生物合成途径的最后步骤(图1 (c))。根据他们的新发现在替代血红素生物合成功能,这些蛋白质有前缀Ahb [6]。

表明AhbA和AhbB一起催化脱羧酯侧链的环SH屈服DDSH C和D。同样的反应也发生在血红素生物合成在反硝化细菌的催化同源蛋白质NirD NirL, NirG, NirH [6]。接下来,AhbC发现催化乙酸的侧链的A和B环DDSH给Fe-COPRO三世。AhbC同源NirJ参与血红素生物合成。最后,AhbD证明Fe-COPRO三世转化为血红素通过催化氧化脱羧丙酸的两个侧链在A和B环对应的乙烯基组(6]。AhbD也是血红素同源然而,生物合成蛋白质NirJ比AhbC程度较低。如上所述,Ahb蛋白的酶的活动显示主要为硫酸盐还原细菌的重组酶d .寻常的Hildenborough和d . desulfuricans。

之前报道和基于生物信息学分析,古生菌也具有这些Nir-like替代血红素生物合成蛋白质的同系物,当时名为Ahb-Nir [3]。在这个术语,Ahb-NirD对应AhbA, Ahb-NirH AhbB, Ahb-NirJ2 AhbC,和Ahb-NirJ1 AhbD(图1 (b))。为了避免进一步的混乱,我们将采取四个字母命名(AhbA, AhbB、AhbC AhbD)也为古Ahb-Nir蛋白质。

虽然一个等价的功能可以推断出从两组Ahb蛋白质的生物,也就是说,硫酸盐还原细菌和古生菌,基于氨基酸序列的相似性,这些预测仍然需要实验证明。尤其是AhbC的催化功能和AhbD应该验证实验前各自的酶的名字被分配,因为蛋白质与NirJ分享相似,也很相似。因此,在这项研究中,我们调查了Ahb蛋白质的催化功能的产甲烷archaeon甲烷八叠球菌属巴氏细菌为小说血红素生物合成途径,建立了他们的角色在这个有机体。

2。材料和方法

2.1。化学物质

所有化学药品和试剂都来自Sigma-Aldrich (Taufkirchen、德国),卡尔•罗斯(德国卡尔斯鲁厄)Gerbu(德国海德堡),默克公司(达姆施塔特,德国)。DNA聚合酶、限制性内切酶和PCR条件购买来自新英格兰生物学实验室(法兰克福点。,德国)。寡核苷酸引物和plasmid-miniprep包从Metabion购买(Martinsried,德国)。PCR和凝胶萃取净化设备得到从试剂盒(希尔登,德国)。Ni-NTA琼脂糖是购自Macherey-Nagel (Duren,德国)。卟啉是购买从前沿科学(美国纽瓦克)。这四个大肠杆菌codon-optimized基因Mbar_A1459,_A1460,_A1458,和_A1793从m·巴氏细菌被生活技术合成GmbH(达姆施塔特,德国)。

2.2。构建质粒

质粒pETDuet建设nirDLGHJEN包含的基因nirD,nirL,nirG,nirH,nirJ,nirE,和nirN从铜绿假单胞菌包含所有七个基因的DNA片段被放大与引物PCR NirDLGHJEN_NdeI_fw排气口(G插科打诨猫ATG广汽广汽CTC)和移行细胞癌NirDLGHJEN_KpnI_bw(广汽GGT ACC柠檬酸GTG CGA GGT太极拳)使用质粒pHAE2 [11)作为模板。放大DNA片段与限制性内切酶消化濒死经历我和Kpn我和结扎(下划线)到相应的消化向量pETDuet-1 (Novagen,达姆施塔特,德国)生成pETDuetnirDLGHJEN。质粒pETDuet建设ahbAB合成,codon-optimized基因Mbar_A1460(编码AhbB)被使用引物PCR扩增15 nirh_mba_fw (C侠盗猎车手猫ATG手枪AAA ACC手枪GTG AAA)和16 nirh_mba_rev (C GTTCTC呕吐TTA CAG ACG AAC ACC G),放大DNA片段与限制性内切酶消化濒死经历我和Xho我和结扎(下划线)到相应的向量pETDuet-1产生质粒pETDuet消化ahbB。合成,codon-optimized基因Mbar_A1459(编码AhbA)被使用引物PCR扩增13 nird_mba_fw (TG CAG AAT TCG ATG ATC手枪ATT广汽AAC CTG)和14 nird_mba_rev (TAA CGC GGC公司治理文化TTA ACG AAT ATC棉酚)。放大DNA片段与限制性内切酶消化生态国际扶轮和不我和结扎相应地消化质粒pETDuetahbB的质粒pETDuetahbAB。的质粒pET22bahbABCD包含codon-optimized基因Mbar_A1459,_A1460,_A1458,和_A1793(编码AhbABCD)m·巴氏细菌是由像之前描述的那样“链接和锁”的方法(12)使用pET22b (Novagen)作为载体系统。的质粒pET22bahbABCD修改了QuikChange定点诱变工具包(Stratagene)插入一个终止密码子(强调)在吗ahbD利用引物nirJ1_Stop (CTG AAT TGT GTT的猫矫正性大动脉转位甘氨胆酸(CGT GGT AGC ACC AG)和nirJ1_Stop_antisense (CTG GT GCT TGC ACC ACG柠檬酸生成pET22b ATG AAC ACA ATT CAG)ahbABCD_t78a(生产AhbABC)或ahbC生成pET22bahbABC_a76tD(生产AhbABD)通过使用引物nirJ2_Stop (GGT CGT手枪AGC AAATAACTG 20 AGC猫CTG)和nirJ2_Stop_antisense (CAG ATG GCT CGG CAG TTA TTT GCT ATC ACG ACC)阻塞相应的基因的表达。质粒pETDuet建设ahbDcodon-optimized基因Mbar_A1458(编码AhbD)使用底漆NirJ1_Duet_ PCR扩增MfeI_fw (C AAT TGG ATG ATT GCC ATG ACC AAT G)和NirJ1_pGEX_XhoI_bw (GCTC呕吐TTA TTT TTT ACC CGG AC)包含Mfe我和Xho我限制网站(强调),第一只克隆到pJET1.2 /钝克隆载体(热科学)根据制造商的指示。Mbar_A1458然后从这个质粒Mfe我和Xho我内切酶和由此产生的DNA片段被绑定到相应的消化向量pETDuet-1生成pETDuet (Novagen)ahbD。重组质粒pBCM-CysG6编码siroheme合成酶CysG鼠伤寒沙门氏菌请提供了罗伯特·施耐尔博士(瑞典,斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所)13]。

2.3。菌株和生长条件

大肠杆菌DH10B用作克隆的主机。重组蛋白的生产大肠杆菌应变BL21 (DE3)使用。重组蛋白的生产大肠杆菌菌株携带相应的向量被种植在LB-medium 37°C(有氧生长条件)或LB-medium包含20毫米NaNO₃(厌氧生长条件)补充适当的抗生素。引起的蛋白质产量增加500μM IPTG(异丙基-β-D-thiogalactopyranosid)文化一旦光密度0.2 0.5 578海里的耗氧和厌氧生长的文化了。文化的大肠杆菌细胞含有质粒pBCM-CysG6诱导蛋白生产的0.01% (w / v)。进一步诱导后细胞培养在25°C在一夜之间由离心收获和储存细胞颗粒−20°C。

2.4。在活的有机体内酶活性测定

在活的有机体内活性测定进行培养大肠杆菌BL21 (DE3)细胞包含只有pBCM-CysG6(生产鼠伤寒沙门氏菌CysG)或pBCM-CysG6结合pETDuetnirDLGHJEN(生产铜绿假单胞菌NirDLGH), pETDuetahbAB(生产m·巴氏细菌AhbAB), pET22bahbABCD(生产m·巴氏细菌AhbABCD), pET22bahbABCD_t78a(生产m·巴氏细菌AhbABC)或pET22bahbABC_a76tD(生产m·巴氏细菌分别AhbABD)。在120毫升血浆细胞生长的厌氧瓶和诱导蛋白质生产如上所述。一夜之间培养细胞收获后,直接用于高效液相色谱样品制备或储存在−20°C。

2.5。纯化的酶

重组AhbAB从m·巴氏细菌是生产耗氧大肠杆菌含有质粒pETDuet BL21 (DE3)ahbAB和复杂的蛋白质纯化的IMAC(固定化金属离子亲和色谱法)。细胞颗粒在缓冲resuspended(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.5,150毫米氯化钠,10% (v / v)甘油)和细胞中断使用法国媒体系统(1000 psi)。可溶性蛋白质分数是通过超速离心法(45分钟175000×g 4°C)。上层清液加载在一个Ni-NTA列和洗10列卷(CV)的缓冲和2 CV的缓冲区包含50 mM咪唑洗脱前绑定蛋白7简历的缓冲区包含300毫米咪唑。洗脱的蛋白质含量,分析了分数SDS-polyacrylamide凝胶电泳和包含分数的AhbAB汇集。最后NAP-25缓冲交换对缓冲区进行交联葡聚糖列(Illustra NAP-25,通用电气医疗集团)。纯化AhbAB存储在−20°C。

重组AhbD从m·巴氏细菌产自耗氧增长大肠杆菌含有质粒pETDuet BL21 (DE3)ahbD。细胞收获后所有程序完成的净化AhbD在厌氧条件下进行在一个厌氧室(美国腼腆的实验室、青草湖、MI)。缓冲B细胞的再悬浮颗粒(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.5,250毫米氯化钠,特里同x - 100 0.3%, 2毫米德勤)使用。可溶性蛋白质分数获得如上所述。上层清液加载在5毫升蓝琼脂糖柱(HiTrap蓝色惠普,通用电气医疗集团)平衡与50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.5,包含5毫米德勤和示例应用程序列后用这个缓冲区彻底清洗。绑定蛋白筛选了使用一个线性梯度从0 M氯化钠为1 M氯化钠在50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.5,包含5毫米德勤。AhbD包含分数(洗脱约500毫米氯化钠)汇集和交换的缓冲是50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,包含5毫米德勤。然后,蛋白质溶液是装载在一个阴离子交换柱(Mono问5/50 GL,通用电气医疗集团)平衡与50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,包含5毫米德勤和列被缓冲。一个线性梯度从0 M氯化钠0.5 M氯化钠在50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,包含5毫米德勤用于绑定蛋白的洗脱。AhbD包含分数集中,集中5.6 mg / mL。 The purified AhbD was stored at 4°C.

2.6。透析的AhbAB

100年μL(纯化AhbAB浓度为7.8毫克/毫升透析在4°C一夜之间在100毫升的缓冲区使用Slide-A-Lyzer透析磁带(马10 k MWCO,热科学,沃尔瑟姆,美国)。然后,使用缓冲区交换反对100毫升新鲜缓冲区和透析继续在4°C三个小时。

2.7。蛋白质浓度测定

测定蛋白质浓度的布拉德福德试剂(Sigma-Aldrich)是按照制造商的指示使用与BSA蛋白标准。

2.8。在体外Iron-Sulfur集群调整

的在体外如前所述(执行iron-sulfur集群的调整14]。调整后多余的铁和硫化物被离心和随后的通道蛋白的解决方案通过一个NAP-25列(通用电气医疗集团),是根据制造商的指示。

2.9。测定铁和硫的内容

纯化AhbD的铁含量是决定根据(15]在蛋白质的变性1米高氯酸和使用bathophenanthroline作为螯合试剂。硫化物含量是决定如前所述16]。

2.10。分子质量测定

本机纯化蛋白质的分子质量估计通过凝胶渗透色谱法(如前所述)(3]。

2.11。在体外AhbAB酶活性测定

执行的试验是在厌氧条件下在手套箱(腼腆的实验室)。衬底siroheme产生在活的有机体内生产的重组CysG大肠杆菌如上所述。然后,原油细胞自由提取制备siroheme包含在厌氧条件下大肠杆菌细胞被直接使用衬底活动分析的解决方案。测定混合物中包含一个250年的总量μL分析缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.5,300毫米氯化钠,5% (v / v)甘油)最后一个20的浓度μM纯化AhbAB是孵化前衬底为0μ5米,μ米,或20μ氯高铁血红素。然后,75年μL siroheme包含细胞自由提取是添加到启动反应。控制反应混合物AhbAB和氯高铁血红素都被省略了。37°C的反应是孵化了19 h。然后,累积四吡咯是由高效液相色谱从测定混合物中提取和分析如下所述。

2.12。在体外AhbD酶活性测定

执行的试验是在厌氧条件下在手套箱(腼腆的实验室)。500年的一个股票的解决方案μM iron-coproporphyrin III (Fe-COPRO III)生成根据詹et al。17]。酶活性测定混合物中含有20μFe-COPRO三世,500μ米年代-adenosyl-L-methionine(山姆),1毫米亚硫酸氢钠(DT),和5μM纯化重组AhbD缓冲b反应混合物中孵化6 h和15 h在17°C。阻止酶反应的5% (v / v)集中HCl是添加到混合存储在−20°C到进一步使用。

2.13。四吡咯的提取和制备高效液相色谱样品

潜在的血红素提取的绑定到纯化AhbAB蛋白质的解决方案是混合1:1 (v / v)和解决方案1(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,2%渐变80)和5% (v / v)盐酸集中增加了蛋白质的变性。后摇的混合物Vortex-Genie 2混合器(美国纽约科学Industries Inc .,波西米亚)两分钟的样本离心机(10分钟,16100×g)。然后,丙酮/盐酸混合(39:1 (v / v))添加1:1 (v / v)的上层清液后面跟着另一个离心步骤。提取得到的上层清液包含四吡咯由高效液相色谱分析。

高效液相色谱的制备的样品在活的有机体内酶活性测定细胞颗粒resuspended 1: 4 (w / v)的解决方案1。这些细胞被破坏与玻璃珠细胞粉碎机(10分钟,3000 rpm)和离心机(10分钟,16100×g)。除了600年的μL丙酮/盐酸(39:1 (v / v)为200μL上层清液和涡流的10分钟是用来提取四吡咯和沉淀的蛋白质。样本离心机(10分钟,16100×g)和上层清液集中在速度休假(埃普多夫,汉堡,德国)200年第四卷μL之前添加5% (v / v)的浓盐酸和离心法(10分钟,16100×g)。获得的上层清液用于高效液相色谱分析。

高效液相色谱的制备的样品在体外酶活性测定分析混合物混合1:1 (v / v)与丙酮/盐酸(39:1 (v / v))其次是涡流和离心(10分钟,16100×g)。5% (v / v)的集中HCl再次添加到上层清液,离心去除残留的蛋白质注入高效液相色谱系统。

2.14。制备高效液相色谱法标准

氯高铁血红素或Fe-COPRO三世于150年解散μL丙酮/盐酸(39:1 (v / v)),然后75年μL的解决方案1是补充道。获得四吡咯的解决方案是离心机(10分钟,16100×g)和上层清液用于高效液相色谱分析。

2.15。四吡咯的高效液相色谱法

四吡咯提取使用JASCO高效液相色谱分析了2000系列系统(JASCO Gross-Umstadt,德国)。四吡咯是光度二极管阵列分析探测到200 - 650 nm和荧光测量使用一个激发波长的发射波长409 nm和630 nm。

样品的色谱分离(30μL注入体积)含有血红素和Fe-COPRO III上执行一个Equisil BDS C18柱(Ammerbuch-Entringen Maisch高效液相色谱GmbH博士、德国)5μ粒子大小和250毫米×4.6毫米列维度25°C。四吡咯被筛选了0.5毫升/分钟的流量使用梯度系统基于以前公布的方法(18]。溶剂由1 M醋酸铵(pH值5.2)(分析品位,Sigma-Aldrich), B溶剂甲醇(高效液相色谱年级,Sigma-Aldrich)和乙腈溶剂C(高效液相色谱年级,Sigma-Aldrich)。进样时的流动相由60%的溶剂,溶剂B, 30%,溶剂10% C . 30分钟内溶剂B的内容增加到75%的同时减少溶剂举行了15%,溶剂C稳定的维持在10%左右。然后,溶剂B的含量增加到90%在5分钟内溶剂度保持不变时为10%。这些条件C B(90%和10%)举行前15分钟回到初始条件。

样品的分离(20μ18-didecarboxysiroheme L注入体积)包含siroheme和12日进行一个ReproSil-Pur C18 AQ列(Maisch博士高效液相色谱GmbH) 5μ米粒子大小和150毫米×2毫米列维度25°C和0.2毫升/分钟的流量。四吡咯的洗脱梯度系统使用溶剂组成的0.01% (v / v)甲酸在水中(分析品位,默克公司)和溶剂B组成的乙腈(高效液相色谱年级,Sigma-Aldrich)。初始条件的流动相溶剂包括95%和5%溶剂B,这是增加到20%在6分钟。然后,溶剂B的含量增加到30%在19分钟,最后增加到100%前5分钟,10分钟内回到初始条件。

2.16。18-Didecarboxysiroheme HPLC-MS分析Siroheme和12日

的高效液相色谱法分离四吡咯进行如上所述。群众的淋洗四吡咯电喷雾质谱测量了一个LTQ XL线性离子阱质谱仪(热费希尔科学)正离子模式。

2.17。紫外可见吸收光谱

纯化蛋白的紫外可见吸收光谱记录使用v - 600或v - 650分光光度计(Jasco, Gross-Umstadt,德国)。

2.18。氨基端测序

纯化蛋白的氨基端序列是由埃德曼降解。

3所示。结果与讨论

3.1。AhbA和AhbB甲烷八叠球菌属巴氏细菌催化Siroheme 12进行脱羧反应的酶,18-Didecarboxysiroheme

在替代血红素生物合成路线戒指C和D的醋酯侧链siroheme相应的脱羧甲基(图1 (c))。这个反应是由酶催化(AhbA和AhbB)同源的血红素生物合成的酶NirD、NirL NirG, NirH在血红素催化相同反应形成反硝化细菌等副球菌pantotrophus或铜绿假单胞菌(6]。在m·巴氏细菌潜在AhbA和AhbB蛋白质编码的基因Mbar_A1459和Mbar_A1460分别(图1 (b))。而在m·巴氏细菌和其他产甲烷古菌AhbA和AhbB是由两个不同的基因编码,这两个基因融合到一个单一的基因在所有其他heme-synthesizing古生菌(3]。因此,它是合理的假设AhbA和AhbB催化siroheme进行脱羧反应的酶m·巴氏细菌观察到的同源蛋白质脱磷孤菌属物种(6]。因此,在接下来我们将名字siroheme脱羧酶AhbAB。为了实验验证AhbAB的预测函数m·巴氏细菌作为一个siroheme脱羧酶,我们开发了一个在活的有机体内酶活性测定。在这个试验,siroheme, AhbAB的基质,是生产的大肠杆菌由重组siroheme合成酶CysG鼠伤寒沙门氏菌在质粒编码pBCM-CysG6 [13]。隔夜CysG生产后,siroheme (SH)的内容大肠杆菌分析了细胞四吡咯萃取和高效液相色谱分析中描述的材料和方法,如图2(一个)。接下来,我们一起联合重组CysG AhbA和AhbB重组m·巴氏细菌在相同的大肠杆菌主机和分析了累积四吡咯隔夜后蛋白的生产。此外,与重组NirD也进行相同的实验,NirL NirG, NirH铜绿假单胞菌为血红素,构成潜在siroheme脱羧酶形成这种生物,这都与CysG联合创造一个积极的控制。

如图2(一个)的高效液相色谱法分析四吡咯提取大肠杆菌细胞生产只有CysG透露的一个主要化合物的保留时间13.9分钟被确认为SH HPLC-MS分析(图2 (b))。912.36的质量检测[M + H]⁺离子与SH双内酯的形式。观察的形成内酯衍生品isobacteriochlorins之前(19- - - - - -21),可能发生在四吡咯在有氧条件下提取。然而,这一结果表明,SH AhbAB潜在的衬底m·巴氏细菌在CysG生产积累大肠杆菌细胞。当重组NirD NirL NirG, NirH铜绿假单胞菌联合在一起的CysG一样吗大肠杆菌主机,只通过高效液相色谱分析检测残留大量的SH在保留时间为13.9分钟,出现了新的重要化合物的保留时间为17.2分钟。这种化合物的质量(824.36 [M + H]⁺离子)与12日18-didecarboxysiroheme (DDSH双内酯的形式(图)2 (b))。因此,这一结果不仅表明我们在活的有机体内活动分析是适合SH脱羧酶活性的检测,而且还首次证实,NirD NirL NirG, NirH铜绿假单胞菌实际上代表了SH血红素的脱羧酶在这个反硝化细菌形成。最后,DDSH也形成了在活的有机体内当AhbA AhbBm·巴氏细菌是一起共同制作CysG根据提取的高效液相色谱法分析四吡咯(图2(一个))。这个结果显然证实m·巴氏细菌基因Mbar_A1459和Mbar_A1460编码SH脱羧酶AhbAB。

3.2。AhbA和AhbB甲烷八叠球菌属巴氏细菌形成一个Heterodimeric, Heme-Binding复杂

在m·巴氏细菌和其他产甲烷古菌,SH脱羧酶AhbAB由两个子单元由两个不同的基因编码蛋白质。相反,在所有其他heme-synthesizing古生菌这两个基因融合到一个单一的基因编码预测SH脱羧酶在这些生物3]。因此,我们假设AhbA和AhbBm·巴氏细菌可能形成一个复杂的相互混合在活的有机体内这表示酶的生理相关的形式。为了验证这个假设,我们联合重组AhbA携带一个氨基端₆标签一起nontagged AhbB相同大肠杆菌主机。然后,他₆-AhbA被亲和色谱法纯化上Ni-NTA琼脂糖和蛋白质含量的最后洗脱馏分被sds - page分析。如图3(一)nontagged AhbB copurified连同他的₆-AhbA实验过程中强烈暗示混合AhbAB复杂的形成在活的有机体内。进一步,净化复杂由凝胶渗透色谱法进行了分析,揭示了存在的异质二聚体(数据没有显示)。基于这些小说的结果,我们建议的SH脱羧酶m·巴氏细菌是一个heterodimeric酶组成的两个子单元AhbA和AhbB。

有趣的是,纯化AhbAB复杂是颜色明亮的橙色。纯化蛋白的紫外可见吸收光谱的孤立和dithionite-reduced形式建议结合血红素辅因子的吸收最大值出现在423年,539年和571海里的孤立的形式和吸收最大值在426、530和559 nm dithionite-reduced形式(图3(b))。为了更详细地描述绑定发色团,纯化蛋白的变性是盐酸和潜在的血红素辅因子被酸化丙酮提取。随后,提取的发色团由高效液相色谱分析,被确认为血红素基于其保留时间(图3(c))和紫外可见吸收光谱(数据没有显示)。虽然结合血红素被撤AhbAB复杂在变性条件下,我们无法单独通过透析protein-chromophore复杂。血红素比AhbAB估计高峰一体化高效液相色谱分析后,确定为0.03摩尔每摩尔AhbAB血红素。总之,这些结果清楚地显示,AhbA AhbB首次m·巴氏细菌形成一个heterodimeric AhbAB复杂这部分包含一个共价,但紧密地绑定血红素。

血红素的存在在纯化AhbAB复杂完全意想不到的。通常,血红素作为氧化还原在酶或代数余子式气体传感器在调控蛋白。然而,没有必要siroheme脱羧酶的氧化还原代数余子式AhbAB和同源蛋白质NirDLGH血红素生物合成中催化相同反应不含任何绑定血红素净化(k . Haufschildt和g层后,未发表的结果)。血红素的潜在作用作为一个代数余子式的催化活性AhbAB似乎不太可能考虑到AhbAB催化反应在辅因子本身的生物合成。这种情况下将提高“鸡和蛋”的问题。另外,有几个不同的可能性在AhbAB绑定血红素的作用。首先,血红素的存在在AhbAB准备可能反映一个最终产品控制AhbAB催化活性的抑制机制。在这样一个机制、heme-free AhbAB复杂会促进DDSH SH进行脱羧反应的酶m·巴氏细菌当血红素是必要的。尽快对血红素的需求满足,代数余子式将绑定到AhbAB复杂,可能抑制其催化活性。第二,血红素结合AhbAB可能控制蛋白质稳定性观察glutamyl-tRNA还原酶的报道是抑制血红素结合,也似乎更适合蛋白水解降解heme-bound形式(22- - - - - -24]。真核5-aminolevulinic酸合成酶(ALAS1)代表由血红素反馈调节的另一个例子。在这种情况下,基因表达和蛋白质稳定性被报道是依赖于线粒体的血红素水平(25,26]。因此,第三个机制可能是heme-bound AhbAB可能会以某种方式影响血红素生物合成基因的基因表达。在这种背景下,有趣的是,蛋白质AhbA和AhbB注释数据库属于单体/ AsnC-family转录监管机构。

3.3。血红素不抑制在体外酶活性的纯化AhbAB

为了获得更多的见解血红素的作用必将AhbAB我们测试了血红素可能抑制蛋白质的催化活性。为此,我们测试了AhbAB活动在一个在体外酶活性测定在没有和不同数量的增加血红素的存在,在材料和方法部分描述。如图4纯化的作用形成的,DDSH AhbAB独立缺失或增加血红素的存在。即使在克分子数相等的大量的血红素的存在对酶没有观察到抑制AhbAB。这些结果表明,血红素不抑制AhbAB的催化活性。然而,AhbAB可能受到血红素通过反馈调节上述其他可能的机制之一。

3.4。AhbC从甲烷八叠球菌属巴氏细菌催化Iron-Coproporphyrin三世的形成

在替代血红素生物合成古生菌和硫酸盐还原菌AhbC蛋白催化乙酸的侧链的A和B环DDSH Fe-COPRO三世。AhbC预测是一个激进的山姆血红素酶同源生物合成的酶NirJ [3,6]。血红素生物合成基因簇m·巴氏细菌(图1 (b))包含两个基因编码两种截然不同的NirJ-like蛋白质(以前叫Ahb-NirJ1和Ahb-NirJ2 [3])。的基因Mbar_A1793编码一种蛋白质氨基酸序列股票38.8%的身份铜绿假单胞菌NirJ,因此最有可能代表AhbC。第二个NirJ-like蛋白质m·巴氏细菌股29.5%序列的身份铜绿假单胞菌NirJ,由基因编码Mbar_A1458可能代表AhbD终端替代血红素生物合成途径的酶。为了实验验证这些功能预测,我们选择一样在活的有机体内分析战略作为AhbAB之前。因此,我们联合重组CysG美国沙门氏菌感染和AhbABm·巴氏细菌要么一起AhbC (Mbar_A1793)或AhbD (Mbar_A1458)或AhbC和AhbDm·巴氏细菌在相同的大肠杆菌主机。后一夜之间蛋白质生产的累计提取四吡咯大肠杆菌细胞自由提取,高效液相色谱分析。

如图5Fe-COPRO三世(保留时间19.6分钟)生产的大肠杆菌在存在重组CysG, AhbAB, AhbC和AhbD或AhbC孤单。相比之下,也就产生不了Fe-COPRO三世在CysG面前,AhbAB, AhbD当AhbC失踪了在活的有机体内化验。这些结果清楚地表明,基因Mbar_A1793事实上编码酶AhbC负责DDSH转化为Fe-COPRO三世在替代血红素生物合成m·巴氏细菌。

3.5。AhbD从甲烷八叠球菌属巴氏细菌是一个Iron-Sulfur集群包含激进的山姆血红素合酶吗

到目前为止,我们分配了各自的酶功能m·巴氏细菌蛋白质Mbar_A1459 Mbar_A1460, Mbar_A1793我们的使用在活的有机体内活动分析。然而,为了建立Mbar_A1458作为血红素合成酶的酶功能Fe-COPRO三世转换成血红素,在活的有机体内策略大肠杆菌是不适合的,因为大肠杆菌通过经典途径产生血红素本身。因此,潜在AhbDm·巴氏细菌(Mbar_A1458)重组蛋白的生产大肠杆菌和纯化,以建立一个在体外酶活性测定。重组AhbD没有携带任何额外的标签和被亲和色谱法纯化HiTrap蓝色惠普列(通用电气医疗集团)和随后的阴离子交换色谱法在Mono问5/50 GL列(通用电气医疗集团),在材料和方法部分描述。使用这种净化策略获得了大约0.9毫克的AhbD从1 L(细菌培养。净化后的蛋白质表现出稍微褐色的颜色和紫外可见吸收光谱(图中未显示)的纯化AhbD显示广泛的吸收特性在410纳米左右指示一个iron-sulfur集群的存在。如上所述,AhbD属于激进的山姆的家庭酶,因此,[4 fe-4s]集群的存在所协调的三个半胱氨酸残基氨基酸序列基序CX特征₃残雪₂C是预期27]。此外,AhbD的氨基酸序列包含第二个守恒cysteine-rich地区糖基序列表现出主题残雪₂残雪₅残雪_20.c .因此,AhbD可能港口第二iron-sulfur集群除了一个协调的半胱氨酸激进山姆半胱氨酸主题(残雪₃残雪₂C)发现AhbD分子的n端。为了获得更多的洞察AhbD iron-sulfur内容,我们确定了厌氧纯化蛋白的铁含量。我们发现纯化AhbD只包含2.2摩尔每摩尔AhbD铁低于预期的蛋白质含有至少一个[4 fe-4s]集群。然而,这种观察可以解释的部分损失iron-sulfur集群(s)在净化或不完整iron-sulfur集群整合在活的有机体内在重组蛋白的生产。因此,纯化AhbD受到在体外iron-sulfur集群调整在材料和方法部分描述。集群后重建和删除多余的铁和硫的蛋白质表现出强烈的棕色和紫外可见吸收光谱表明[4 fe-4s]集群的存在(图6(a))。随后,硫化铁和蛋白质测定的内容。我们观察到,重组AhbD包含8.5摩尔每摩尔AhbD铁和5.1摩尔每摩尔AhbD硫化。这些结果表明,AhbD最有可能包含两个[4 fe-4s]集群,因此属于激进山姆酶的亚科,包含多个iron-sulfur集群(28]。

为了确定纯化,重组AhbD能够催化血红素Fe-COPRO三世的转换,一个在体外酶活性测定。在这个分析纯化蛋白与衬底孵化Fe-COPRO三世一起代数余子式年代-adenosyl-L-methionine (SAM)和亚硫酸氢钠(DT)作为还原剂AhbD iron-sulfur集群。孵化后的混合物在17岁为0°C h, 6 h, 15 h反应是停在盐酸的加入。在场的四吡咯在反应混合物中提取并进行高效液相色谱分析(图6(b))。初的反应(0 h)只出现在第三Fe-COPRO混合物(图6(b),第一面板)。后6 h(孵化Fe-COPRO三世的数量明显减少,出现了两个新化合物的保留时间为30.1分钟,37.5分钟(图6(b),第二面板)。复合在37.5分钟保留时间是血红素显示相比氯高铁血红素的色谱行为标准(参见图3(c))。化合物在大约30.1分钟保留时间可能是一个monovinyl反应中间。最后,经过15 h衬底Fe-COPRO III和潜在monovinyl中间完全消失了,只有反应产物血红素的反应混合物(图中检测出6(b),第三小组)。相比之下,从反应混合物纯化AhbD省略时,没有转换Fe-COPRO三世15 h(图后观察血红素6(b),第四小组)。也是如此,当“孤立”酶(不是复制)使用(数据未显示)表明,完全融入AhbD iron-sulfur集群需要的活动。这些结果明确AhbD Mbar_A1458的酶的功能,也就是说,血红素合成酶,Fe-COPRO三世转换成血红素替代血红素生物合成途径中甲烷八叠球菌属巴氏细菌。

4所示。结论

通过另一种途径在heme-synthesizing古生菌血红素形成的长有很大区别认识经典途径发现在大多数细菌和真核生物。以前,几个古细菌基因识别提出了参与这个替代途径,然而,只有他们两个的功能实验验证(3]。在这项研究中,预测功能的酶催化的最后三个步骤替代血红素生物合成途径m·巴氏细菌被验证。因此,对于m·巴氏细菌连续的两种酶uroporphyrinogen三世转换成sirohydrochlorin [3)和三个酶siroheme转化为血红素的生化特性(本研究)的特点。唯一缺少的酶来完成整个通路在这个有机体是chelatase这把铁变成sirohydrochlorin siroheme形式。几个潜在chelatases编码m·巴氏细菌基因组和未来的研究将会显示哪些人充当iron-chelatase在血红素的形成。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢罗伯特·施耐尔博士(瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所)的礼物质粒pBCM-CysG6 [13)以及教授迪扬博士和尤尔根•莫泽博士(德国布伦瑞克技术大学)有益的讨论。这项工作是财务支持由德意志Forschungsgemeinschaft (LA 2412/2-1)和全宗der Chemischen工业g层。

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