核靶向Upregulation CRISPRa系统交付β对病毒感染-Defensin地塞米松和苯丙氨酸Dual-Modified聚合物

文摘

的dual-modified聚合物包含地塞米松(检波器)和苯丙氨酸(检)准备提供质粒DNA编码dCas9和single-guide RNA (sgRNA)为特定upregulation的β-defensin。侦破和板式换热器半个协同提高了转染效率,减少了树枝状分子的细胞毒性。结合三个sgRNAs瞄准β-defensin基因表现出更高的激活的效果β-defensin比任何单一的任意两个sgRNAs sgRNA和组合,表现出一种有效的抑制病毒感染和复制。水泡性口炎病毒(VSV)的效价的细胞治疗dCas9-sgRNA定位β-defensin相比降低了约100倍的细胞治疗dCas9-scramble sgRNA (dCas9-scr sgRNA)。在活的有机体内实验表明,精细,Phe-modified树形分子有效地交付质粒DNA编码dCas9蛋白质进入气道上皮细胞,诱导β-defensin表达式。CRISPR激活系统的交付与侦破和聚合物改性对病毒性疾病板式换热器是一种很有前途的方法。

1。介绍

小分子的识别抗病毒治疗和疫苗是费时和费力。特别是小知识新兴病毒很难在短时间内开发特定的药物或疫苗。因此,另一种方法是需要与病毒性疾病。除了针对病毒基因组和蛋白质,针对宿主因素(即。,innate system, adaptive immune apparatus, and other host genes) is an effective strategy to prohibit virus infection or replication. For example, maraviroc prevents cell entry of HIV and HBV virus by blocking human cellular protein CCR [1,2]。然而,只有少数小分子靶向宿主细胞蛋白质筛选治疗病毒性疾病。最近,新兴的基因操作技术,包括锌指核酸酶(ZNF)转录activator-like效应核酸酶(取得),定期和集群空间短回文重复/ Cas9 (CRISPR / Cas9)系统,提供了强大的工具,用于抑制或激活宿主基因表达(3- - - - - -5]。

在这些技术中,CRISPR / Cas9系统,一个复杂与single-guide Cas9蛋白质的RNA (sgRNA,结合transactivating CRISPR RNA和间隔记录CRISPR RNA),吸引了相当大的关注,因为它多基因调控的举止。sgRNA指导Cas9蛋白分裂其互补的双链DNA。乳沟,Cas9蛋白质,目标站点是修理通过nonhomologous结束加入(NHEJ)或homology-directed修复(HDR)机制。此外,CRISPR激活(CRISPRa)和干扰(CRISPRi)系统基于活动Cas9 (dCas9),具体结合DNA序列没有乳沟活动,利用抑制和诱导感兴趣的基因表达(6,7]。至于CRISPRa,转录激活VP16或激活域p65结合dCas9 transactivate多个基因转录。例如,CRISPRa / dCas9方法被用来激活内源性APOBEC3G和APOBEC3B预防艾滋病毒感染8]。

Defensin是一种先天免疫系统的关键因素,在第一线对微生物病原体(9,10]。的主要表现β-defensins屏障上皮细胞被发现,被认为是一种理想的抗病毒剂。然而,高成本和容易退化的人类β-defensin限制其临床使用。幸运的是,CRISPRa系统提供了一个可选择的方法对病毒通过上调β-defensin从而激活先天免疫。

质粒DNA编码dCas9蛋白质和sgRNA无法进入细胞。因此,利用DNA传递向量是必需的。病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒(AAV),和慢病毒病毒)显示交付效率高,但他们的DNA包装容量有限和潜在染色体整合仍是主要障碍(11,12]。相反,病毒的向量是容易获得,成本有效,能够有效地整合siRNAs或Cas9-sgRNA质粒为一个综合13,14]。此外,一些向量如树枝状分子很容易修改和半个包括疏水基团和核本地化的信号分子,大大提高转染效率(15,16]。表面疏水性苯丙氨酸共轭聚合物增强细胞吸收(17]。地塞米松可以绑定到核酸膜,从而促进DNA运输到原子核(18]。阳离子聚合物改性侦破显著增加基因表达水平(19]。然而,dual-modification板式换热器和侦破很少用于提高转染效率。此外,很少有问题通过提高防病毒策略β-defensin表达式使用病毒CRISPRa的交付系统。

这里,我们开发了一个针对板式换热器dual-modified侦破和阳离子聚合物G4和社会学)的侦破CRISPRa目标质粒β-defensin。在体外和在活的有机体内G4实验证实抗病毒效果(社会学依据dendrimer-based病毒CRISPRa。

2。材料和方法

2.1。材料

PAMAM树形分子G4、苯丙氨酸和三氟乙酸(组织)从西格玛奥德里奇(圣路易斯,美国)。O-benzotriazole-N 1-Hydroxybenzotriazole (HOBT), N, N ,N - - - - - -tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU)、地塞米松、甲磺酰氯,2-iminothiolane·盐酸(Traut试剂)从J&K购买科学(中国,北京)。肺腺癌A549细胞包括人类,人类肾293 t,人类支气管上皮细胞16 hbe细胞,小鼠神经母细胞瘤N₂一个细胞从写明ATCC购买。水泡性口炎病毒(VSV)写明ATCC(污渍;印第安纳州,美国)。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM) penicillin-streptomycin,胎牛血清(的边后卫)和杜尔贝科的磷酸盐(PBS)从Gibco BRL购买(美国卡尔斯巴德)。生物试剂购自生活的技术。质粒pSP-dCas9-VPR礼物从教授乔治·丘奇(Addgene质粒# 63798)和活化剂冲程体积,三方组成的催化剂激活域VP64, p65,等。质粒pphU6-gRNA教授是来自查尔斯Gersbach (Addgene质粒# 53188)。sgRNAs准备使用T7高产RNA合成装备(新英格兰生物学实验室,内)。引物和sgRNA序列如表所示S1。

2.2。聚合物的合成

phenylalanine-modified一代4.0 (G4) PAMAM树形分子合成主要通过酰胺化苯丙氨酸的羧基和表面之间的氨基酸组G4 PAMAM树形分子。简而言之,G4 PAMAM树形分子(0.5克,0.035更易)溶解在无水DMF在氮气的保护下(5毫升)。Boc-phenylalanines被添加在不同摩尔比率(苯丙氨酸的羧基:表面氨基酸组G4 PAMAM树形分子)的25%和50%,其次是增加1-hydroxybenzotriazole (HOBT)和O-benzotriazole-N, N, N ,N - - - - - -tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU)在Boc-phenylalanine 1.25摩尔当量的羧基,担任缩合试剂和催化剂的反应。在室温下搅拌2 d后,反应的解决方案是在乙醚沉淀三次获得黄色固体沉淀为G4 (Phe-Boc)指出。deprotect tert-butoxycarbonyl(中行)组、G4 (Phe-Boc)聚合物溶解在二氯甲烷加入5毫升三氟乙酸(组织)6小时连续磁搅拌。组织通过旋转蒸发去除后,生成的原油产品再次溶解在DMF和纯化的三轮在丙酮沉淀。最后,黄色产品G4(法)是通过真空干燥。

侦破,糖皮质激素,用于修改PAMAM树形分子。首先,mesylate-activated侦破准备用终端羟基甲磺酸的依据。在氮气保护下,相同(0.11克,0.269更易)溶解在无水吡啶(5毫升)添加到甲磺酰氯在2摩尔当量,然后在冰浴孵化12 h和搅拌,紧随其后的是冰的去离子水沉淀原油产品。的mesylate-activated侦破被从ethanol-acetic醚重结晶纯化。接下来,Traut试剂和地塞米松在2.5毫升无水甲磺酸DMSO 0.015更易(8 equiv. G4 (Phe-Boc))是慢慢加入四国集团(Phe-Boc) 2.0毫升无水DMSO溶液在氮气保护。混合物在室温下搅拌12 h。过多的冷乙酸乙酯是用来沉淀反应的产品。提到的产品是溶解在5毫升组织和搅拌6 h,其次是在乙醚沉淀。这个沉淀过程重复了三次得到淡黄色G4(检)相同。G4的收益率(社会学依据是105毫克。

2.3。制备Polyplexes

准备polyplexes交付质粒,质粒(1的解决方案μ克/μL)添加到四国集团(法)或G4(检)引爆器解决方案在不同的N / P比值。混合解决方案是用移液器吸取大约50倍,然后允许代表35分钟。

2.4。描述

¹核磁共振光谱被记录在瓦里安400 MHz光谱仪使用D₂O和DMSO d₆溶剂在室温下。确定大分子聚合物的重量分布,凝胶渗透色谱法(GPC)进行,使用醋酸缓冲体系(pH值5.0)作为流动相的流速1.0 mL / min。GPC系统配备了水域515泵,一个ultrahydrogel™500列,一个ultrahydrogel™250列,水域2410微分示差折光检测器。样品流过ultrahydrogel™500列,ultrahydrogel™250列的顺序。polyplexes决心的大小利用动态光散射(DLS)。polyplex解决方案通过一个450纳米过滤器过滤。测量进行了在90 + 25°C / BI-MAS设备(莫尔文Panalytical莫尔文,英国)。数据被收集在一个自相关器以90°检测散射光角。测量结果的记录 (SD)的三个独立测量。透射电子显微镜(TEM)观察polyplexes进行使用飞利浦CM120透射电子显微镜(飞利浦、埃因霍温、荷兰)加速80千伏的电压。样本由干燥(10下降μL)样品溶液的铜网格与非晶碳涂层。样本染色,一小滴醋酸双氧铀溶液(1.5 wt %在水中)1分钟后掉在铜网格和涂抹滤纸。最后,网格在干燥器干燥过夜之前TEM观察。

2.5。凝胶阻滞实验

评估G4的质粒dna结合蛋白能力(法)_25%G4(法)_50%,G4(法)_50%侦破,凝胶电泳进行(Bio-Rad实验室,Inc .)、美国)。树枝状分子首先溶解在PBS (pH值7.4)。然后,质粒被添加到聚合物解决方案准备polyplexes预设N / P比值,紧随其后的是站在室温下35分钟。polyplexes被加载到1%琼脂糖凝胶GoldenView(北京BLKW生物技术有限公司,中国)。质粒DNA的缺陷移动检测和紫外线成像在医嘱能系统(医嘱能系统有限公司、以色列)。

2.6。细胞生存能力分析

A549, 293 t、N₂细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C。细胞被播种到96孔板的密度 ³细胞/。孵化后一夜之间在37°C,细胞进一步孵化Lipofectamine 2000年,四国集团(法)_25%G4(法)_50%,G4(法)_50%依据,结合plasmid-GFP 48 h,在不同浓度和细胞生存能力用MTT试验测量。简单地说,细胞培养基是100年取代μL新鲜DMEM包含10μL MTT方法在PBS(5毫克/毫升),然后孵化一个额外的3 h 37°C。在100年丢弃的媒介μL DMSO溶液加入溶解生成的衬底,持续15分钟。570纳米的吸光度测量使用Tecan无限F200 (Crailsheim,德国)。所有实验进行了一式三份。

2.7。共焦激光扫描显微镜(样品形貌)

A549, 293 t、N₂一个细胞被播种在35毫米的玻璃碗2毫升的DMEM包含10%的边后卫的密度 ³每板。孵化24 h后,介质被新的取代包含polyplexes opti-MEM。细胞核是沾染了赫斯特33342年(Beyotime生物技术,中国)15分钟。细胞被孵化的37°C和成像在指定时间使用蔡司LSM 710共焦激光扫描显微镜(卡尔蔡司、从、德国)。GFP和赫斯特33342年很兴奋在488和352海里,发现在515年和460海里,分别。

2.8。基因表达量

的表达β-defensin转染A549, 293 t、N₂一个细胞在mRNA水平评估。从细胞总RNA提取使用RNeasy微工具包(试剂盒Inc .)、美国)。使用逆转录酶的前体的合成第一链cDNA和随机引物根据制造商的协议(美国表达载体)。互补脱氧核糖核酸(1μg)从总RNA合成使用PrimeScript™RT试剂盒(豆类、日本)。mRNA的表达β-defensin量化实时PCR系统使用是由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(火箭)工具包(瑞士罗氏公司)。的mRNA水平β肌动蛋白也是衡量一个内部规范化标准。引物和探针序列表中列出S1。实时PCR程序是运行在一个StepOnePlus实时PCR系统(美国ABI)在95°C的热循环条件10分钟,其次是40 95°C的周期30年代,15秒58°C, 68°C 15 s。

2.9。在体外水疱性口炎病毒的预防感染

A549细胞被播种在12-well板的密度 ⁵细胞在DMEM /好,孵化37°C下5%的调湿大气CO₂。孵化后一夜之间,包含polyplexes的介质被新的取代介质。G4的数量(法)_50%依据与质粒编码dCas9 sgRNA复合体(1μ在N / P (g) 8。水疱性口炎病毒与polyplexes孵化后24 h,添加到中效价达到100。病毒感染的状态被流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测。文化是浮在表面的连续稀释10倍接种到细胞在DMEM和板材6-well病毒空斑实验。培养3 d后,水疱性口炎病毒的滴定法测定。所有三次测量数据进行了统计分析。

与PBS洗了三次后,细胞被胰蛋白酶化收获,在1500转离心5分钟,并在500年resuspendedμL PBS。一个不负责任的人流式细胞分析仪(美国加州贝克曼库尔特)是用来评估量化转染效率通过使用488 nm激光为激发和发射荧光的Alexa萤石®515收集通过TRITC过滤器。评价的GFP基因表达与polyplexes孵化后,这些细胞被收获根据上述方法和流式细胞术。通常,没有转染培养细胞被用作背景校正控制。Kaluza软件(版本1.2,贝克曼库尔特有限公司美国)被用来分析数据。

2.10。在活的有机体内研究

雌性BALB / C小鼠(6 - 8周大)从广东医学实验动物中心购买和保存在SPF动物生命科学学院中心,中山大学。所有外科手术和术后动物保健委员会按照指南进行控制和监督的目的的实验动物,卫生部和中国政府。通过尾静脉麻醉后的剂量戊巴比妥钠50毫克/公斤,老鼠通过支气管polyplexes管理。肺被切除并受检测defensin基因的表达。分子生物学检测,肺组织在液态氮冷冻后均质。总RNA提取和分析中描述的部分2.8。

2.11。组织学和免疫组织化学

老鼠牺牲,他们的肺部固定在4%多聚甲醛至少24小时获得石蜡切片(2μ(5米)或冻结部分μ米)。石蜡切片沾着他走时,和图像的肺毒性作用的评估不同治疗组。冰冻切片的免疫荧光染色是简要描述为:0.5与5% BSA阻塞后h 37°C,冰冻组织切片与兔多克隆抗体主要孵化β-defensin(1: 100稀释在PBS /渐变;细胞信号技术,丹弗斯,美国)和小鼠单克隆抗体Cas9(英国Abcam)一夜之间在4°C。然后,AF647-labeled二次抗体和AF488-labeled二级抗体(英国Abcam)是用来纪念的β分别-defensin dCas9蛋白质。与DAPI标记细胞核后,组织部分样品形貌进行扫描。

2.12。统计数据

所有实验进行了至少一式三份。所有数据被表示为 (SD)。统计学意义是由两面学生的决定 - - - - - -测试使用Prism 5.0 ( , ,和 )。

3所示。结果

3.1。聚合物的制备和表征和Polyplex

侦破,Phe-modified树枝状分子(图就做好了准备1)。首先,针对板式换热器半个Boc-protected共轭聚合物G4通过酰胺化羧基组Boc-phenylalanine和面部氨基酸组之间的聚合物的摩尔比率0.25和0.5,其次是去中行的组。产品被表示为G4(法)_25%和G4(法)_50%。地塞米松甲磺酸(DET-Mes)被引入到表面的四国集团(Phe-Boc) Traut试剂的存在(盐酸2-iminothiolane)。最后,树形分子G4和社会学)依据得到去除中银集团后,确认的特征峰的消失将在1.2 - -1.4 ppm的中行¹核磁共振谱(图2)。DET-Mes被接合合成磺酰组详细提到产品的特征¹h - nmr、GPC。的共振峰特征G4聚合物支架(CH₂在2.65 - -3.10 ppm)和苯丙氨酸(CH在4.05 - -4.20 ppm, CH₂在3.5 - -3.75 ppm, CH苯环上的苯丙氨酸在7.20 - -7.90 ppm)观察,表明成功的合成聚合物G4(法)。外观特征共振峰(0.9 - -1.3 ppm, CH_3,7.0 - -7.3 ppm, CH地塞米松)表明,侦破和G4共轭(法)。组成产品的计算根据特征峰的积分价值将G4和板式换热器在7.20 - -7.90 ppm,分别。转换G4的氨基(法)_25%和G4(法)_50%分别为22%和47%。GPC色谱,G4(法)_50%修改依据(命名为G4(法)_50%依据)显示一个单峰分子量分布(图2 (f))。

络合的质粒与不同的树枝状分子被凝胶阻滞实验评估。失踪的DNA带琼脂糖显示完整的负电荷中和质粒(20.,21]。如图3G4(法)_25%完全迟钝DNA迁移N / P比值6以上,但聚合物G4(法)_50%实现完整的缺陷高于8 N / P比值,表明板式换热器改造降低了DNA树形分子的络合能力由于电荷屏蔽效应的板式换热器疏水性苯环和表面电荷密度低(17,22]。精细的修改对DNA的络合能力没有显著影响聚合物G4(法)_50%侦破。此外,大小和zeta电位polyplexes在不同N / P比值进行了动态光散射(DLS)。如图3 (b)ζ电位的树枝状分子/ EGFP复合物被转换为积极从消极N / P比值高于6时,和大小保持不变。在8 N / P比值,G4的ζ电位(法)_25%/ EGFP复合物,G4(法)_50%/ EGFP复合物,G4(法)_50%依据/ EGFP复合物在+ 23 + 16,和+ 10 mV。在8 N / P比值,G4(法)_50%依据/ EGFP复合物比其他复合物有尺寸小一点的。与聚合物的过度输入(N / P比值较高),复合物举行更多的正电荷和膨胀可能由于带正电荷之间的静电排斥作用链。因此,G4的大小(法)_50%依据/ EGFP复合物增加到93.9 nm的N / P 12。G4的大小和zeta电位(法)_50%/ EGFP和G4(法)_25%/ EGFP复合物表现出类似的趋势。TEM图像显示三个配合物球体均匀大小约为70 - 80纳米(图3 (c)),这符合由动态光散射(DLS)(图3 (d))。

3.2。细胞毒性和细胞吸收

虽然高积极polyplexes表面电荷是有利于细胞吸收,它还会导致明显的细胞毒性细胞。因此,有必要对这两个因素的平衡。引入疏水性表面的一部分,如苯丙氨酸聚合物能有效降低其细胞毒性和增加其亲和细胞(17]。正如所料,板式换热器修改显著减少G4树枝状分子的细胞毒性293 t, N₂一个,A549细胞(图4)。聚合物改性法和侦破略微增加细胞的生存能力与Phe-modified树枝状分子相比。值得注意的是,单一和双改性法和侦破增强各级转染效率。在这项研究中,各种各样的树枝状分子的转染效率是评价在293 t, N₂a, A549细胞利用EGFP -(增强型绿色荧光蛋白)编码质粒作为记者(图5)。转染效率的增强是由于两个原因:(1)之间的交互疏水性苯丙氨酸和细胞膜的疏水区域的扰动导致细胞膜,从而促进跨细胞膜质粒的易位,(2)依据质粒领进细胞核(18]。细胞的转染效率最高记录接收聚合物改性法和侦破,表明双重协同改性提高转染效率。

3.3。杀毒效果CRIPSR / dCas9上调β-Defensin

几个质粒携带序列编码sgRNA瞄准β-defensin启动子区域设计并交付给人类细胞(A549、293 t和16 hbe)和老鼠细胞(N₂一个)的mRNA水平β-defensin均通过实时定量PCR,结果如图所示6和S1。A549人类细胞,治疗与sg5 sg7, sg9 sgRNA包裹着G4(法)_50%精细调节β-defensin 10、15和40倍相比,争夺sgRNA质粒(scr sgRNA质粒)治疗,分别。重要的是,结合三个sgRNA质粒(sg5 + sg7 + sg9)有更高的mRNA的副本β-defensin比其他治疗方法。sgRNA (sg5 + sg7 + sg9)治疗10基因表达增强,3和1.5倍,相比之下,两个sgRNA治疗(sg5 + sg7、sg5 + sg9 sg7 + sg9)。此外,293年,t细胞识别sgRNA治疗提出了一个更大的增强效应约45000倍比可控硅sgRNA治疗(图6 (b))。类似的结果也证实在小鼠N₂一个细胞。如图6 (c)和S1,结合sg2 sg3 sgRNA (sgMBD4)增加β-defensin基因表达了25倍。

病毒的抗病毒效果CRISPR / dCas9瞄准β-defensin被斑块形成和流式细胞术检测评估。监控病毒感染,A549细胞coincubated水泡性口炎病毒将GFP基因作为一名记者(VSV-GFP)。如图7,治疗仅dCas9和dCas9-scr sgRNA显示GFP-positive细胞的86.1%和78.6%,分别表明dCas9没有sgRNA瞄准β-defensin不能阻止病毒入侵。然而,dCas9-sgHBD1治疗显著降低GFP-positive细胞的百分比从86.1%降至42.9%。结果病毒效价与流式细胞术是一致的。细胞接受dCas9-sgHBD1治疗的效价值下降了约100倍比细胞接收空向量和dCas9-scr sgRNA治疗(数字7(一)和7 (b))。这些结果表明,dCas9-sgHBD1交付的板式换热器,DET-modified树枝状分子阻止病毒感染和复制。

3.4。体内研究

首先,在活的有机体内upregulation的β-defensin CRISPRa系统的交付使用后评估法和侦破dual-modified树枝状分子。包含5的纳米粒子μ克/μL dCas9质粒和5μ克/μL sgRNA质粒的N / P准备8和气管内的管理到鼠标呼吸道根据方法(23]。两天后吸入管理、肺和呼吸道被切除,受到分子生物学和组织学分析24]。dCas9-sgMBD4诱导治疗β-defensin基因表达了约40倍,相比之下dCas9-scr sgRNA治疗(图6)。如图8,明显dCas9和β-defensin蛋白在小鼠的肺组织切片观察与dCas9-sgMBD4接受治疗。没有β-defensin蛋白质观察肺组织的老鼠接受没有sgRNA或可控硅sgRNA治疗。此外,纳米颗粒没有明显对肺组织产生不利影响。

4所示。讨论

PAMAM树枝状分子和球状结构和带正电的表面已经被广泛地应用于基因转染试剂浓缩DNA和因为他们的能力与细胞膜相互作用[25]。然而,膜障碍包括外层细胞膜和核膜内有限的聚合物载体的基因传递效率。因此,开发了多种方法来克服这些障碍通过共扼聚合物疏水和物质相关的核本地化(半个15- - - - - -18]。首先,疏水性苯丙氨酸是改性的壳侧基来提高转染活动。苯丙氨酸残基之间的相互作用和疏水区域细胞膜膜的不稳定和增强的易位polyplexes穿过细胞膜。此外,苯丙氨酸在聚合物的表面密度也会影响转染效率。高密度的聚合物改性疏水性苯丙氨酸(50%)显示更高的转染效率(图5),这符合的结果替代50%的聚合物苯丙氨酸表现出比其他更好的转染活性替换10%和20% [17]。第二,一些核本地化信号肽和小分子(如检波器)被用来把polyplexes进入细胞核。例如,dexamethasone-modified树枝状分子或DNA增强核由于易位的积累和扩张的核孔检波器的受体(18,19]。因此,双重改性法和侦破可能表现为协同作用提高转染效率克服等离子体和核细胞膜。

人类的资源有限β-defensin阻碍了其临床应用。CRISPRa技术提供了一个强大的和可行的方法禁止通过移植人类病毒入侵β-defensin。CRISPRa系统采用识别宿主因素,beta 1, 4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2 (B4GALNT2),也可以废除感染通过抑制流感病毒结合唾液酸受体(26]。然而,这种策略很少探讨阻止病毒感染在活的有机体内。众所周知,一个高水平的β-defensin在气道上皮细胞能有效抑制病毒感染和复制(9,10]。在这项研究中,我们利用板式换热器和侦破dual-modified聚合物提供CRISPRa系统目标β-defensin基因,大大减少VSV病毒效价100倍。CRISPR-Cas9 / dCas9引起的非标靶基因编辑,但理性设计Cas9或dCas9可以显著增强特异性基因编辑(27]。此外,没有基因中断dCas9-mediated CRISPRa也改善其生物安全。除了nuclear-localizing效果,地塞米松可以提高治疗效果的抗病毒药物通过降低炎症的糖皮质激素。

5。结论

合成了苯丙氨酸和地塞米松dual-modified树形分子运输CRISPR / dCas9-sgRNA瞄准β-defensin对抗病毒感染。苯丙氨酸和地塞米松协同提高转染效率,导致明显的抗病毒活性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Mingxiang左和李庐山逍夏的贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了中国国家重点研发项目(2016 yfe0117100),中国国家自然科学基金(21875289和U1501243),粤港商帮联合创新项目(2016 a050503026),主要项目的整合产业,教育和研究的广州市(201704030123)、广州(201704020016)的科技项目,广东省创新与创业研究小组计划(2013 s086),和广东省科技创新专项基金(a050506035国际科学合作,2018年)。

补充材料

包括图S1和表S1的补充文件。相对mRNA表达细胞接收dCas9 sgRNA质粒图S1与Lipofectamine 2000年交付报告;和sgRNAs和引物序列表中描述S1。(补充材料)

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