骨髓形成和骨髓Leukaemogenesis斑马鱼

文摘

在过去的十年里,使用斑马鱼模型的研究有助于我们对脊椎动物造血作用的理解,骨髓形成和骨髓leukaemogenesis。新颖见解造血的血统的保护和改善我们的能力识别、隔离、文化等造血的细胞继续加强我们使用这个简单的生物体的能力解决疾病生物学。再加上解剖的斑马鱼胚胎发育的优势骨髓形成和不断扩大的髓系恶性血液病的模型,这种多功能生物建立了其成长为一个有价值的工具来解决关键问题领域的骨髓形成和骨髓leukaemogenesis。在本文中,我们解决这一领域的最新进展和未来的发展方向骨髓形成和使用斑马鱼leukaemogenesis系统。

1。介绍

斑马鱼是成为一个强大的模型系统研究造血作用和leukaemogenesis。除了提供的福利的规模和简单的多功能造血作用的遗传模型系统研究发展方面,过去的十年里已经爆炸的分子方法和模型来促进研究通知造血的疾病生物学,特别是leukaemogenesis和癌症。在《盗梦空间》作为一个癌症模型,提出了增殖和血管生成表型属性如读数相关癌症发病机理(1]。然而,这是一代的转基因斑马鱼表达原癌基因致癌基因的控制下rag2子,继续开发t细胞急性淋巴细胞白血病(ALL),这彻底改变了对这个小生物的科学世界观作为癌症疾病模型(2]。在接下来的10年里,许多癌基因诱导癌症已经生成的模型在斑马鱼突变策略来确定新的肿瘤抑制基因或染色体不稳定位点(3- - - - - -5]。此类模型的效用回答关键生物问题还在继续增长。在本文中,我们重点发展领域的骨髓形成斑马鱼,癌症模型影响骨髓血统,这些指示我们如何在这些疾病的生物学知识。

2。斑马鱼骨髓发展

斑马鱼胚胎造血作用发生在两波在发展中,称为原始的和明确的6]。与人类和小鼠造血作用(原始造血作用提升者的发展原始血液中红细胞细胞卵黄囊的岛屿),在斑马鱼,原始波红细胞从尾侧板中胚层细胞发展双边条纹向中线迁移形成一个结构称为中间细胞群(ICM)。原始人口巨噬细胞也出现不同的解剖位置前侧板中胚层(ALPM) 12到24小时后受精(高通滤波器)7,8]。明确的造血作用提升者在24高通滤波器后血岛(PBI)的出现bipotent erythromyeloid祖细胞(emp)。这些细胞被标记为未分化状态的表达相结合gata1和lmo2或表达cd41(6]。这些细胞增殖和分化潜能和数量的增加,达到30-36高通滤波器。这波造血作用产生进一步的红细胞和髓细胞,最近已被证明引起肥大细胞在胚胎发育早期9]。多功能的造血干细胞(hsc)的表达cd41,c-myb,和runx1出现直接从kdrl -表达haemogenic腹主动脉的血管壁内皮的高通滤波器(26—28日左右开始10,11]。这些细胞迁移到尾造血的组织(本),种子和分裂导致所有血统的成人血细胞。这些细胞继续填充在斑马鱼成人造血作用的器官,肾脏和胸腺。波的精确时间从原始造血作用的波生血作用尚未完全建立,但证据球蛋白基因表达和突变体与正常原始波生产表明,血液造血作用的主要贡献来自于权威HSC派生细胞5天左右后受精(12- - - - - -14]。

3所示。解剖工具骨髓形成

可交叉反应的抗体斑马鱼蛋白质缺乏,更比其他人在血液系统。这种限制意味着造血作用的详细的血统和分化状态分析,所以优雅的理解在小鼠系统,目前正在挑战进行斑马鱼。因此近年来主要努力的一代新工具等血液系统的分析。随着这些工具的发展也更广泛了解骨髓斑马鱼的传承发展。第一个转基因学发达马克髓细胞表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)主要骨髓转录因子pu.1。Tg (spi1 / pu.1: eGFP)动物表达eGFP在原始波髓细胞,而是两天postfertilization (dpf),表达eGFP的髓细胞明显减少pu.1表达下调(15,16]。可视化嗜中性粒细胞在发展,一些转基因线所生成的各种实验室。这些包括Tg (lysc:安全域)和Tg (lysc: eGFP)行17)以及Tg (mpx: eGFP)[18,19)和Tg (myd88: eGFP)[20.]。尽管这些行标签主要是嗜中性粒细胞,值得注意的是,重叠的表达内源性成绩单(通过原位杂交)或蛋白(抗体)以及记者之间基因表达的转基因线并不完全一致,表明略有不同种群是由每个转基因标签根据发展评估的时间点17,21]。其中一些基因和蛋白质表达的微妙之处。L-plastin特别是在一些早期的研究一直建议马克单核/巨噬细胞系的细胞,但有明确的证据表明,这种蛋白质表达(如哺乳动物)在所有白细胞(21]。Tg (lysc:eGFP从22高通滤波器)表达GFP,最初在原始ALPM引发的巨噬细胞。eGFP的表达增加,明显没CHT(可能标签和区分明确的髓细胞)和发育中的大脑和视网膜(更有可能代表巨噬细胞)的比例进行表达。准确地阐明细胞表达eGFP Tg (lysc:eGFP)转基因,大厅等人执行anti-GFP随着荧光染色原位杂化的mpx, l-plastin,fms。双重染色法观察eGFP的这些骨髓成绩单;然而,有一些eGFP (lysc)表达细胞不表达mpx,一些fms表达的细胞不表达eGFP (lysc),和一些l-plastin表达的细胞不表达eGFP。因此,Tg (lysc:eGFP)是原始的巨噬细胞和多数发展中粒细胞但没有标签mpx积极的粒细胞或全部fms巨噬细胞表达(17]。可想而知,这些微妙之处会及时给我们更详细的信息关于族群的骨髓细胞,比如他们的分化阶段。最近转基因线使用mpeg1或fms(csf1r)启动子22,23)被用来区分巨噬细胞的数量和粒细胞性髓细胞,进一步增强先天免疫系统的研究。然而,fms记者动物展览表达神经嵴黄色素细胞以及巨噬细胞,这可能导致一些限制的使用这个系统。相比之下,mpeg1子似乎独家巨噬细胞,但表达在成年鱼只在斑马鱼线路维护使用直接生成转基因方法,,这些诗句中无法察觉mpeg1与一个GAL4 /无人机表达系统。进一步描绘表达模式的巨噬细胞和其他单核吞噬细胞在成年斑马鱼,MHC II级β基因的启动子片段,mhc2dab,是孤立的。由于合并后的转基因表达,Tg (mhc2dab: eGFP)转基因线结合Tg (CD45:安全域)(标签所有白细胞B细胞除外)已经允许识别巨噬细胞和树突细胞以及B淋巴细胞在成年斑马鱼组织(24]。

最近的一些研究也划定额外粒细胞的亚种。斑马鱼的肥大细胞可以被表达cpa5成绩单,像他们的哺乳动物同行积极对甲苯胺蓝,表达肥大细胞类胰蛋白酶和Cd117在蛋白质水平(25),以及元素Tol-like受体(TLR)通路的coexpression就证明了这一点cpa5和绿色荧光蛋白在Tg (myd88: eGFP)转基因线26]。这些细胞也被隔离后固定的流式细胞术快红染色原位杂化的cpa5(27]。斑马鱼的区别从斑马鱼嗜酸性粒细胞肥大细胞也被解决使用BAC-engineered转基因表达GFP的线gata2启动子。本研究证实了的存在,详细描述了斑马鱼嗜酸性粒细胞的特点。在Tg (gata2:eGFP),嗜酸性粒细胞表达eGFP的高水平和高转发并通过流式细胞术侧散射特性。这些细胞也被证明是功能同源人类嗜酸性粒细胞(28]。摘要转基因线和促进髓系标记数量如图1。

以及促进评估个体发生和频谱斑马鱼免疫造血系统,这个数组的转基因动物的工具扩展更多的功能分析斑马鱼造血作用,这将特别有用在斑马鱼疾病模型。再一次利用细胞排序通过流式细胞术,Stachura等人建立了一个分析系统,单独使用来评估髓样造血的各亚群细胞的能力(29日]。最近的研究利用传统的单独使用技术,常用的甲基纤维素在哺乳动物血液细胞分析,通过斑马鱼重组生长因子、红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子和血清来源于鲤鱼。这样的研究还在起步阶段在斑马鱼系统但应该带头进一步能力评估单独使用和血统的单个细胞的潜力和人口。至关重要的是,这将允许更详细的生物分析造血的人口目前缺乏。

4所示。研究发展骨髓形成

的许多方面使用斑马鱼胚胎骨髓形成被审问。最重要的是,提出的遗传屏幕被用来确认小说原始的或明确的骨髓形成所需的基因。转录因子的重要作用和发展微环境在决定造血的家族命运的选择也被优雅地解决使用这个模型,利用反向遗传学和移植技术。最近瞬态不同的变异人类致癌基因的超表达提供了一些机械的见解这类基因在正常发育的潜在发病的影响造血作用和恶性转化。除了功能研究也解决方面的先天免疫系统使用斑马鱼(AIH还回顾了在这个问题上)。下面是一个总结的选择对斑马鱼的研究强调其多样化和独特能力,回答有关骨髓形成一系列生物问题。

4.1。骨髓向前的遗传变异发现屏幕

斑马鱼的一些研究已经确定了小说在骨髓形成有关的基因。Bolli等人发现了grechetto突变体中的突变cpsf1基因早期压力基因筛选基因的骨髓形成dpf 5点。在进一步调查,grechetto突变体显示pan-haematopoietic缺陷,引起的凋亡细胞死亡的造血干细胞和祖细胞(公司)。CPSF1蛋白是一个复杂的基因处理所需的3′UTR和保利(a)的尾巴pre-mRNAs的子集。CPSF1专门识别规范在这些pre-mRNAs聚腺苷酸化信号。Bolli et al .,显示grechetto突变体记录编码snRNP70缺乏一个保利(a)尾(13]。也确认了这个基因从一个屏幕异常HSC生产(30.),是值得人们特别注意的,因为它的作用在正常pre-mRNA拼接。自出版这个报告在斑马鱼,损失函数和获得所需的功能基因突变在几个正常剪接已经被确定为导致人类骨髓增生异常综合征(MDS)的发病机理31日,32]。

4.2。家族命运的选择研究

斑马鱼胚胎的研究也揭示了家族的命运决定在发展造血作用。优雅的罗兹和洛韦的研究显示主要的骨髓和红细胞转录因子之间的相互作用pu.1和gata-1分别在调节红细胞生成和骨髓形成之间的命运的选择33,34]。基于这些研究蒙泰罗等人研究了“不流血的月光突变携带删除突变转录的中间()基因。而先前的研究已经证明要求在维护原始红细胞生成(35),明确的造血作用尚未研究。蒙泰罗等人的研究表明,公司指定,通常出现在月光从主动脉突变体。随后需要正常红细胞分化在本契约4 dpf,虽然表达分化髓系标记(mpx和l-plastin)在同一地区扩展。月光突变体也表现出水平的提高pu.1和减少的水平gata-1这个时候CHT暗示可能与这些转录因子相互作用的规定在祖细胞来源于骨髓和红色的命运最终肝星状细胞。确定这些发现也可能与其他阶段的造血的相关发展,表达红细胞和粒细胞谱系标记在月光突变体以及评估gata-1和pu.1在发展造血作用[morphants在不同时间点36]。作者得出结论,通过调节调节erythro-myeloid命运选择的表达gata-1和pu.1,本条例和显示不同的模式在特定的阶段发展造血作用。这项研究展示了小说的作用作为管理者的细胞命运的决定,还强调了在水平动态变化的转录因子及其交互时产生的发展造血作用。

由李et al。最近的一项研究还涉及家族命运的决定之间的巨噬细胞和粒细胞血统。在这项研究中干扰素调节因子8 (irf8)被认定为小说调节器骨髓分化的下游的终端pu.1,促进巨噬细胞的发展谱系的中性粒细胞在原始的和明确的造血作用[37]。吗啉代击倒的irf8耗尽胚胎巨噬细胞的数量和人口扩大了嗜中性粒细胞与底层机制决定细胞命运的开关。没有明确的证据,减少中性粒细胞凋亡或增加扩散占的中性粒细胞数量和double-labelling增加l-plastin和mpx或fms在irf8morphants显示的优势l-plastin和mpx阳性细胞。转基因的超irf8通过Tg的一代(hsp70: irf8myc)转基因线,促进了巨噬细胞发展为代价的中性粒细胞(37),但不能拯救后巨噬细胞的发展pu.1吗啉代注入。有趣的是,Irf8突变小鼠建立慢性髓细胞性白血病(CML)和数量的中性粒细胞升高综合症(38,39]。在这种背景下,本研究不仅确定了小说的作用irf8在正常骨髓形成,但也强调了机制可以在leukaemogenesis可能被劫持。

4.3。使用发展骨髓形成功能评估人类白血病的基因突变

新颖的见解造血的恶性肿瘤的生物学也已获得使用斑马鱼模型表达造血的致癌基因作为后续部分中详细说明。然而,最近的一项研究利用发展骨髓斑马鱼突变体的表型功能询问人类产生的序列变异的影响(NSVs)发现在人类急性髓系白血病(AML)。在这项研究中ddx18突变斑马鱼也异常骨髓形成造成p53-dependent细胞周期阻滞。桑格的测序DDX18基因识别4 NSVs AML患者样本。救援实验被进行使用ddx18突变斑马鱼和识别的一个NSVs似乎发挥主导发展骨髓形成负面影响(40]。尽管这项研究是基于Sanger测序目标DDX18基因,它铺平了道路利用斑马鱼等其他策略来审问小说NSVs目前确定成千上万从全基因组和全外显子组测序的努力,对功能的相关性。而且这种策略的价值将成为更强大的额外的模型现有已知的进展期变异和致癌基因变得更加普遍,促进联合击倒/使用现有的模型来测试NSVs超表达研究。

4.4。不同的超表达研究

超表达和击倒研究骨髓癌基因和肿瘤抑制基因,分别也一直在信息使用斑马鱼胚胎研究。nucleophosmin 1 (NPM1)基因编码无处不在的核仁的磷蛋白质nucleophosmin丢失超过三分之一的AML患者或MDS与损失有关的染色体5问[41]。除杂合的功能变异NPM1是最常见的突变中发现AML占三分之一的病例与正常核型(42]。结构,这些突变导致小说的一代核出口信号和核仁的定位信号损失,因此,相比正常专门NPM的核仁的本地化,突变NPM位于核仁,核浆和细胞质43]。此外,由于NPM包含一个oligomerisation域,NPM突变体安置至少有一些剩余的野生型NPM细胞质和核浆。这样NPM突变体因此被评为NPMc +表示他们的细胞质本地化。不同的超表达最常见的NPM1突变导致NPMc + (NPM突变)在一项由Bolli et al .过度NPMc +导致斑马鱼orthologues的定位错觉NPM1(npm1a和npm1b)细胞质表明人类NPM可以用斑马鱼oligomerize NPM基因。此外,原始的骨髓细胞数量增加,c-myb表达细胞在主动脉和腹侧墙gata1 / lmo2表达、细胞的两倍。这些数据表明NPMc +突变蛋白导致公司的扩张发展中原始的骨髓和erytho-myeloid祖细胞(44]。有趣的是,这种扩张的髓系祖细胞随后也被证明在一个老鼠兄弟NPMc +介导白血病模型(45]。

4.5。先天免疫系统

骨髓细胞谱系形式原则的先天免疫系统和组件,因此,生产和开发这样的细胞暴露于病原体刺激。CSF3R, g - csf / CSF3及其受体在造血作用的角色,指挥骨髓祖细胞的肝星状细胞的分化和增殖46]。特别是CSF3强烈表达微生物毒素在血液里,如细菌脂多糖(LPS),促进骨髓形成感染(尤其是粒细胞)和细胞迁移到网站(47]。斑马鱼具有同源csf3 / csf3r信号轴,功能类似于哺乳动物的同行(48]。过度的csf3信使rna扩大胚胎骨髓形成,但斑马鱼的损失csf3r块骨髓形成完全的损失fms -,lyz -,mpx表达数量。此外,使胚胎暴露于LPS刺激csf3和csf3r表达式,并导致一个“紧急”增加lyz表达中粒细胞csf3r端依赖的方式。

诱导一氧化氮(伊诺/ NOS2)信号还参与炎症反应的感染。斑马鱼同系物,nos2a,似乎是可有可无的正常形成公司(49]。然而,使用吗啉代和L-NAME L-NMMA (pan-NOS药理抑制剂),大厅等人确定Nos2a蛋白质C / ebp的下游是必需的扩大公司人口增加(就是明证c-myb和runx1表达式),促进骨髓分化来响应沙门氏菌感染(50]。在这项研究中,斑马鱼nos2a似乎主要是增加生产的嗜中性粒细胞(证明了这一点lyz表达式)。霍尔等人进一步确认的重要性csf3r信号为“紧急”在感染,骨髓形成csf3rmorphants不能挂载骨髓反应接触沙门氏菌。

5。教训转基因斑马鱼模型的髓系恶性血液病

在野生型斑马鱼(24 +个月)易受光谱的发展的肿瘤发病率约11% (3),然而造血的恶性肿瘤的发生率是罕见的。转基因斑马鱼的研究,组织特定的或无处不在的启动子驱动人类或小鼠致癌基因,然而有了忠实的髓系白血病模型特征的人类疾病。下面是总结现有的髓系白血病模型,这部小说发现这些模型有助于我们理解人类髓系恶性血液病和批判现有和新兴的技术在这一领域。

5.1。k -

勒等人开发了一个模型,通过生成一个Cre / K-RAS-mediated恶性疾病液态氧诱导等位基因的肌动蛋白启动子。Tg (肌动蛋白:loxP-eGFP-loxP:斑马鱼)交叉斑马鱼携带热休克启动子(hsp70开车)cre表达导致骨髓增殖性肿瘤的发展(或然数)34 66天的生活,增加myelomonocytes和肾脏骨髓,骨髓前体细胞和成熟红细胞的重大损失51]。特别是这些恶性肿瘤发生在没有任何热休克和稀有动物已经被暴露在热休克。兄弟动物暴露在热休克发达更激进,nonhaematopoietic肿瘤,如横纹肌肉瘤和死于这些在生命早期,建议只需要变换低剂量的k - ras基因激活造血的细胞,或者表达cre从hsp70启动子在造血的血统比其他组织更大或更多的渗漏。

5.2。MOZ-TIF2

使用pu.1在骨髓细胞启动子驱动转基因表达,Tg (pu.1: MOZ-TIF2-eGFP鱼)是第一个展示公开AML在斑马鱼14到26个月的生活,表现出不成熟的肾脏myelomonocytes骨髓的积累和减少血液细胞脾内(52]。然而值得注意的是,Tg (- - - - - -肌动蛋白:k -)和Tg (pu.1: MOZ-TIF2-EGFP)鱼显示低外显率的疾病,其内在的分子机制仍然未知。

5.3。Tel-jak2a

少数的研究提供了更多的机械的见解在斑马鱼骨髓形成致癌活性。在这样的研究中,Tg (pu.1: FLAG-tel-jak2a)鱼利用融合致癌基因的斑马鱼orthologues创建电话和JAK2,而不是使用人类的互补脱氧核糖核酸(53]。在胚胎,tel-jak2a表达会导致大的髓细胞的积累在血涂片,诱导细胞周期,细胞中获得表达髓系标记pu.1和l-plastin在24高通滤波器。有趣的是,尽管损失循环成熟红细胞的48个高通滤波器,Tg (pu.1: FLAG-tel-jak2a)鱼还显示扩展分布的红色的标记gata1和e3-globin在24高通滤波器和48高通滤波器。这是为了与其他研究Janus激酶/信号传感器和转录激活(JAK / STAT)信号在斑马鱼胚胎造血作用产生广泛的影响。例如,突变体chordin斑马鱼的过表达jak2a也显示upregulation红细胞和粒细胞遗传标记(54]。这种表型chordin突变体可以通过注入获救jak2a吗啉代或药物治疗Jak2抑制剂,AG490,拟表型在野生型注射胚胎持续活跃jak2a信使rna。本研究还表明造血的表现型的可能机制是hyperphosphorylation Stat5因为斑马鱼的注入stat5信使rna携带活跃H298R / N714F突变导致红细胞增加,骨髓,和B细胞数量55]。类似的研究结果中观察到的斑马鱼模型骨髓增殖性疾病、真性红细胞增多(PCV),在红色的失调信使rna可能获救的注入stat5吗啉代(56]。然而,尽管有这些有前途的胚胎发现没有Tg (pu.1: FLAG-tel-jak2a)转基因胚胎存活到成年53]。

5.4。NUP98-HOXA9

最近,我们的团队描述了myeloid-specific Cre /液态氧诱导Tg (pu.1: NUP98-HOXA9)在23%的鱼鱼,展品或然数19和23个月的生活57]。尽管证据骨髓增殖和延迟细胞成熟的肾脏骨髓,没有动物和公开的AML确认。然而,机械的见解在胚胎级别。能损伤dna的辐照后,Tg (pu.1: NUP98-HOXA9)胚胎的细胞数量增加的表现相比G2-M过渡控制和没有一个正常的凋亡反应,这可能upregulation的结果bcl2。此外,胚胎显示改变造血作用在28高通滤波器,增加骨髓发展的标志pu.1,l-plastin,lysc为代价,红色的发展特点gata1NUP98-HOXA9融合的,这表明表达肿瘤蛋白能够改变细胞命运和骨髓细胞分化。这些早期的Tg的表型(pu.1: NUP98-HOXA9)胚胎突出一个潜在机制公司携带这种致癌基因的可能性增加了额外获得突变由于他们受损的DNA损伤反应,还携带一个异常的人口更少的有区别的骨髓细胞,从力学上看可能是优先目标,因此可能占这些鱼的倾向发展公开或然数(57]。

5.5。AML1-ETO

的表达AML1-ETO致癌基因,由热休克蛋白70 (hsp70)启动子也导致斑马鱼胚胎发育骨髓形成的破坏58]。在这项研究中,胚胎细胞与爆炸之类的外观形态,以及upregulationpu.1的差别,对这些gata1-高通滤波器。有趣的是,有一个微分的影响更加成熟的髓系血统,粒细胞明显增加了mpx,但减少数量的细胞表达l-plastin。的差别被认定为对这些基因的转化机制sci,主转录因子之一,胚胎造血作用。所有表型获救注射Tg (hsp70: AML1-ETO)胚胎与sci信使rna或pu.1吗啉代。

到目前为止,Tg (hsp70: AML1-ETO)线表示最成功的利用斑马鱼研究髓系白血病的分子生物学。尽管没有一个公开的成人疾病表型,Tg (hsp70: AML1-ETO)胚胎的仪器研究工具识别骨髓肿瘤形成的基因和化学修饰符。人类的一个子集AML案件表明删除9号染色体上q,专门与t(8; 21)易位产生AML1-ETO。德尔(9问)的影响源于两个基因的损失,transducin-like增强剂的分裂1 (TLE1),TLE4在信号通路。反向遗传学的方法使用斑马鱼的吗啉代击倒框架同族体,groucho3在Tg (hsp70: AML1-ETO)胚胎对加速造血的表现型,即爆炸之类的细胞的外观,增加mpx表情,和循环红细胞的丧失59]。在人类AML, AML1-ETO癌蛋白破坏表观遗传编程通过招聘组蛋白脱乙酰酶复合物(HDAC),这可以从药理学上的目标HDAC抑制剂如trichostatin (TSA)。利用这种表型,叶和他的同事使用的救援gata1表达式由TSA的证据原则的跳板化学修饰符屏幕和声音库中已知的生物活性化合物(60]。有趣的是,他们发现了COX2抑制剂,如ns - 398和吲哚美辛,小说对AML1-ETO治疗药物,随后展示了COX2-prostaglandin E具有至关重要的作用₂通过Wnt信号/连环蛋白通路(61年]Tg的造血作用改变(hsp70: AML1-ETO)鱼。这被证明是一个重要的discovery-soon之后,同样的途径和治疗策略是确定的小鼠模型Hoxa9; Meis1全身的AML [62年]。

5.6。技术挑战和进步

背后的原因的长延迟和低外显率明显的髓系白血病在斑马鱼模型的这种疾病可能在于缺少一部分可用myeloid-targeted推动者活跃在早期血细胞。即使成功的pu.1启动子中使用的一些研究,内生斑马鱼pu.1在终端骨髓分化表达下调,只有被发现是活跃在~ 2%的成年肾脏造血的骨髓细胞(16]。这可能占Tg (AML的发生率较低pu.1: MOZ-TIF2-eGFP)鱼和缺乏发展为公开的AML Tg (pu.1: NUP98-HOXA9)鱼。有针对性的发起人也证明鱼白血病的麻烦在其他模型。Sabaawy等人表明,癌基因的表达电话:AML1从无处不在的斑马鱼肌动蛋白和非洲爪蟾蜍延长因子1 (Xef1)促进者而不是早期淋巴靶向鱼使用rag2启动子可以生产前b(全部)63年]。这样的教训表明,使用积极的推动者在斑马鱼血液发展可能更健壮的驱动转换的进展。然而,无处不在的使用推广者的警告脱靶效应,如Tg (肌动蛋白:K-RASG12D)鱼或然数是一系列的疾病表型之一,包括横纹肌肉瘤、肠道增生和恶性周边神经鞘肿瘤51]。

效力致癌信号的另一个障碍是成功造型白血病鱼。例如,Tg (pu.1:国旗- - - - - -tel-jak2a)鱼以及Tg的早期模型(rag2: eGFP-Myc)鱼2]显示这样的严重异常的动物无法存活到繁殖年龄,所以必须注入的为每一个研究胚胎。Cre /液态氧诱导策略可以帮助建立生殖系传播的致癌基因,但历史上最可靠的方法来控制Cre活动使用hsp70子,这是已知漏水的表达式(51,57]。这反过来也表明致癌基因剂量可能会直接影响的外显率和类型恶性肿瘤诱导如上所述Tg (肌动蛋白:loxP-eGFP-loxP:K-RASG12D)[51]。直接使用的hsp70启动子驱动致癌基因表达研究中被证明是卓有成效的AML1-ETO,但没有一个成年人表型可能反映了无常同时激活后的推广活动。Tamoxifen-inducible Cre重组酶(Cre-ERT2)可能允许转基因表达的更严格的时间控制(64年),可以显著改善Tg的漏水的表达式(hsp70: Cre)动物65年]。汉斯等人表明,即使在温度范围37-42°C,重组事件完全可以阻止在Tg (hsp70: Cre-ERT2)动物热休克后如果不应用它莫西芬。

其他有趣的发展包括斑马鱼的生成致癌转基因的马赛克表达式(66年,67年)允许更多详细的分析对在单个细胞癌蛋白表达的影响。在老鼠身上,谱系限制性骨髓促进剂的使用,例如,CathepsinG(68年,69年),Mrp8(69年,70年),没有致癌的成功转换和有限,事实上,承诺骨髓祖细胞被确认为leukaemia-initiating细胞(LIC)在AML的许多分析(69年- - - - - -73年]。在斑马鱼中,使用更多的谱系限制性骨髓推动者(例如,lysc,mpx,mpeg, fms)白细胞交易领域的蓬勃发展17,22,23,74年)这可能最终提供未来的鱼模型骨髓leukaemogenesis替代工具。

最后,鉴于公开AML取得了迄今为止在只有一个斑马鱼模型表明,收购在合作原癌基因突变和/或肿瘤抑制基因的失活可能更容易发生在斑马鱼的预期寿命较短。另外,收购疾病促进合作突变可能是蒙面的遗传冗余导致增加额外的基因重复经历了在硬骨鱼类的基因组中。然而,斑马鱼是适合测试具体合作致癌基因之间的相互作用由于其繁殖力高能力,从而产生大量的动物基因型的,最近在神经母细胞瘤的朱et al。75年]。转基因鱼窝藏多个癌基因也被成功策略调节斑马鱼的发病率(76年]。因此未来战略评估合作的贡献突变可能是针对超表达/降价策略的两个,三个或四个基因。

直到最近,稳定的基因敲除研究肿瘤抑制基因在大多数斑马鱼实验室一直难以实现。此类模型的临床意义是明显的突变等位基因来源于针对诱导局部病变的基因组(耕作),如p53突变动物(77年- - - - - -79年),有针对性的,遗传基因击倒在斑马鱼社区在过去十年的一个主要挑战。过去的几年里看到过海里的一个主要变化的滚雪球式的技术在这方面的进步。最初的报道的锌指核酸酶(ZFN)诱导乳沟和修复导致基因淘汰赛中从两组80年,81年)》出版后不久,oligomerized池工程(打开)系统在体外识别和验证的潜在基因打靶锌指基思Joung的实验室82年,83年)强调了甚至可能利用这一技术在小型实验室。不到两年后,同一组进一步完善他们在体外在计算机系统允许在识别精度目标站点单独使用生物信息学(84年]。最近的证据表明,转录activator-like核酸酶(取得),工程植物细菌DNA结合蛋白质的功能更加忠实地在斑马鱼系统目标的酶乳沟组件FOK1核酸内切酶在几个基地所需的双链DNA断裂(85年,86年]。当然我们继续贪婪地预测同源重组方法的优化最终允许有条件的兄弟疾病模型。

6。利用斑马鱼作为异种移植模型对髓系白血病

淋巴肿瘤相比,总体而言,模型相对较少的渗透与白血病骨髓性白血病的利率从25% (51)< 1% (52]。代的小说可能促进更多忠实的倡导者在斑马鱼模型的人类骨髓疾病。特别是,斑马鱼的解剖runx1发起人提供了洞察这个基因在斑马鱼的规定,但也可能被证明是一个更好的车手oncogene-induced恶性骨髓疾病(87年]。一个潜在的免费策略是最近的兴趣为异种移植的人类开发方法或鼠标癌细胞在斑马鱼和将这种方法应用于骨髓疾病(88年]。组织培养实验和动物模型在确定癌症和新型药物研发的关键分子通路。然而,在体外化验缺乏关键的肿瘤微环境,而老鼠异种移植的成本是高昂的,需要广泛移植时间。相比之下,斑马鱼的使用促进了可伸缩性,大量的快速发展,可以使用外部受精胚胎透明屏幕化合物高通量的方式。利用胚胎在48高通滤波器,异种移植排斥是最小化,由于他们缺乏一种自适应免疫系统在第一周的生活(89年]。

许多解剖网站在异种移植的胚胎已经试用过,但卵黄囊通常被认为是理想的解剖位置和被用于白血病异种移植研究迄今为止(90年,91年]。异种移植胚胎的孵化35°C使注入人类细胞系的生长完全构成,3 d,在活的有机体内微环境,在不影响斑马鱼胚胎发生(89年,90年,92年]。两组,包括我们,利用研究异种移植骨髓白血病(90年,93年]。两组展示了成功的移植和扩散CM-DiI荧光标记的K562白血病,急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4卵黄囊注射后48高通滤波器斑马鱼胚胎。此外,反应与甲磺酸伊马替尼在K562细胞靶向治疗窝藏bcr - abl1癌蛋白或与所有反式维甲酸(ATRA),有针对性的白血病的抑制剂α肿瘤蛋白发现NB4细胞中观察到的这些化合物的水异种移植的胚胎。Pruvot等。观察异种移植的数量的减少K562细胞暴露于伊马替尼和致畸效应存在剂量依赖的相关性和死亡NB4细胞异种移植的胚胎与ATRA治疗。我们的团队已经开发出一种健壮体外细胞增殖试验量化后,细胞的数量随着时间的推移,异种移植(图2),表明异种移植K562细胞专门对伊马替尼,导致细胞数量下降,但没有胚胎毒性。类似的结果与ATRA异种移植NB4细胞。重要的是,当治疗特工被交换和应用对相反的细胞类型,白血病细胞继续增殖证明人类癌症细胞可以专门针对斑马鱼异种移植模型。这些研究使用斑马鱼的开门异种移植平台快速评估新化合物的功效在人类白血病细胞的增殖在活的有机体内。异种移植也会使屏幕目前抗癌制剂药品核准标示外,在活的有机体内对人类白血病细胞活动。最近,已经证明了一些胃肠道肿瘤(94年],我们开展的研究主要使用骨髓白血病patient-derived (Tugce Balci,戴尔科尔凯利,格雷厄姆Dellaire和杰森·伯曼,未发表的结果)。我们已经看到类似的健壮的移植、扩散和循环主要白血病样本和确认这个过程是一个主动的过程,要求功能活细胞,固定控制细胞留在蛋黄。其他组织进一步证明了微分移植人类白血病的亚种群,CD34 +假定的白血病干细胞的移植,但不是从CD34−细胞,表明斑马鱼模型可能反映了疾病的生物学以类似的方式在小鼠模型,使致瘤性和肿瘤干细胞的研究93年,95年,96年]。同时,与其他工具,如同源的鱼行(CG1)的发展76年)和卡斯珀变异鱼行,永久保持透明度到成年97年),异种移植将使斑马鱼探索白血病原始细胞频率的问题,clonogenicity,连续移植的疾病的能力。遗传损伤的复杂性,可以在AML和固有的治疗反应的异质性疾病,异种移植模型最终可能被用于实时分析原发性患者活检作为一个有用的诊断工具来预测有效的治疗方案和/或通知后续临床前小鼠研究前途的新颖的特工,最终导致I期临床试验。

7所示。结论和未来的研究

斑马鱼胚胎发育生物学的理解做出了巨大贡献,但过去十年的造血作用和骨髓形成。我们解剖的能力的指数上升的髓细胞生物学这个小脊椎动物无疑会进一步见解和扩大髓系白血病的范围为当前的模型。取得的出现和锌指核酸酶以及斑马鱼突变项目桑格中心(http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/zmp/)承诺要救我们淘汰赛中所有基因在斑马鱼基因组中,将极大地提高未来的研究,尤其是肿瘤抑制基因的骨髓疾病。

提出的遗传屏幕,发现很多小说在90年代后期(造血作用的介质98年,99年),包括识别一个新人类疾病基因(One hundred.]近年来一直有些已不流行。然而,斑马鱼的基因组测序的完成和迅速降低成本和提高技术深度测序方法可能会增强我们的地图这种突变的能力,甚至在更复杂的遗传背景。因此遗传修饰符的表型观察屏幕髓系恶性血液病或开发在未来可能富有成效。

最伟大的承诺之一的未来斑马鱼模型的能力做出重大贡献的领域骨髓leukaemogenesis通过确定新的治疗目标化合物通过化学屏幕发展或早期幼虫表型。能够进行大规模筛查项目即使在学术界的环境变得更容易在斑马鱼社区和被这个平台的应用增强异基因的细胞以及最新进展在自动图像采集和分析功能101年]。越来越多的认可和接受的斑马鱼研究骨髓生物学将使它安全的一个地方在其他模型系统包括鼠标和细胞培养、临床前的组件在一个管道工具更好地审问分子途径和快速识别新的治疗方法与守恒的效应在生物可能影响患者骨髓疾病的结果。

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