泰爱泰党 结核病研究和治疗 2090 - 1518 2090 - 150 x Hindawi出版公司 834836年 10.1155 / 2012/834836 834836年 临床研究 评估的状态 rpoB基因FNAC样品实时PCR的结核性淋巴腺炎 Raoot Amita 1、2 Dev 吉塔 1 罗 w . N。 1 病理学系 大学医学科学 Shahdara,德里110095 印度 ucms.ac.in 2 理事会的卫生服务 NCT德里政府Karkardoma,德里110032 印度 delhi.gov.in 2012年 15 8 2012年 2012年 05年 02 2012年 13 05年 2012年 14 05年 2012年 2012年 版权©2012 Amita Raoot和自己开发。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

介绍。多药耐药性结核病(MDR结核)、阻力的总和 结核分枝杆菌异烟肼(INH)和利福平(RFM)是印度的一个主要公共卫生问题,因为它全球耐多药结核病高负担国家中排名第二。世卫组织建议RFM电阻作为检测MDR的“代理标记”。FNAC是应用最广泛的调查技术对结核淋巴腺炎。实时聚合酶链反应,一种多功能技术可用于耐多药结核病的及时发现和治疗评估RFM FNAC样品的电阻状态结核病淋巴腺炎。 的目标。评估的状态 rpoB实时PCR基因的FNAC的样本结核病淋巴腺炎。 材料和方法。三十FNAC样本患者持续圈或出现新的圈后5个月或更多的抗结核的治疗状况的评估 rpoB基因通过实时PCR探针覆盖的“热点抵抗”地区 rpoB基因。 结果。通过使用探针覆盖密码子531年和526年 rpoB的基因,我们可以检测到17 30(56.7%)利福平耐药隔离。PCR检测 快艇DNA在100%的情况下。 结论。使用的分子方法像实时PCR检测耐多药结核病的FNAC样本是节约时间,逻辑方法”为基础的企业文化和经济的方法。

 1。介绍

耐药结核病(mdr - tb)是一个重大的公共卫生问题在印度它全球耐多药结核病高负担国家中排名第二 1]。耐多药结核病是定义为阻力的总和 结核分枝杆菌( 快艇)异烟肼(INH)和利福平(RFM)。然而,RFM阻力,对公开一线药物被认为是更重要的,因为它通常发生在结合其他药物异烟肼。因此,世卫组织建议RFM电阻作为检测MDR的“代理标记”( 2]。百分之九十六的RFM-resistant 快艇菌株具有基因改变在一个81个基点”利福平resistance-determining地区”(RRDR) rpoB基因( 3, 4),相应的密码子507至533。实时聚合酶链反应(PCR)是一种快速、可靠的方法,使放大和检测突变通过使用荧光标记DNA探针( 5]。RFM耐药性结核病例的评估淋巴腺炎(圈),最常见的(30 - 52%)的圈在发展中国家( 6),重要的是及时发现和有效治疗这种情况下。良好的针吸细胞学(FNAC)被广泛的采用非侵入性、安全、简单、快速的方法调查的大腿上,可以结合快速可靠的技术像实时PCR MDR病例的早期诊断和有效的管理。

在目前的研究中,地位 rpoBFNAC样本中基因被实时PCR评估患者30持久圈或出现新的圈后5个月或更多的抗结核的治疗(“失败”,因为每个世界的耐药性,世卫组织全球报告没有。3 2004)。

 2。这项研究的目的

这项研究的目的是检测的状态 rpoBFNAC实时PCR基因样本失败的结核病的大腿上。

 3所示。材料和方法 3.1。病人和标本

本研究进行了前瞻性超过一年的病人接受标准化ATT下直接观察短疗程治疗(点)养生大师的羊毛阁下医院,三级医疗中心主要在东德里,印度。三十clinico-cytologically结核病的确诊病例的腿上已经5个月或更多的攻击力和持久性的初始圈或出现新的圈(失败( 2])都包括在这项研究。十箱non-TB圈组成的4淋巴瘤,3与坏死(组织学证实),转移性癌3例,化脓性脓肿(革兰氏染色阳性球菌)作为消极的控制。相关的病历和检查结果记录。FNAC材料获得用于细胞学诊断(染色涂片),演示 结核分枝杆菌(Ziehl Neelsen方法)、文化(Lowenstein-Jensen偏),和分子诊断 。

DNA提取

分枝杆菌基因组DNA提取如前所述,Van Sooligen et al。 7与一些细微的修改。DNA的质量和数量进行评估通过测量吸光度比值在260/280 nm。一个吸光度比值在1.8到2.0建议质量好的提取。

 3.2。实时聚合酶链反应

所有的30个DNA样本被实时PCR分析评估的状态 rpoB基因。一组烦恼的调查覆盖了最常见的突变的网站 rpoB基因密码子使用地区526年到531年(Genosen的实时PCR装备,基因诊断分公司)。这种“阻力确定地区” rpoB基因扩增和融化的温度( T 米 探测器获得的实时Rotor-gene 6000扶轮分析器使用担心化学(Corbett研究澳大利亚)。化学是一个开放的平台,有4 - 6通道多路复用功能和使用多个激励源结合几种检测过滤器来检测几乎所有已知的荧光团。的变化 T 米 被认为是一个突变的指标,和隔离的探测器 T 米 其他比 结核分枝杆菌H37Rv被认为是对RFM [ 5]。的 T 米 的野生 rpoB73.8 - -74.8°C的突变 rpoB69.8 - -70.8°C。总共25毫升的PCR混合物制备。它包括现成的反应混合物Genosens的 rpoB实时PCR工具包,PCR缓冲,热启动Taq MgCl deoxynucleotide三磷酸2,具体的引物和探针。5毫升每个孤立的DNA随后补充道。实时PCR改革于6000年Rotor-gene实时旋转分析器(Corbett研究澳大利亚)。自行车在95°C条件变性10分钟(1),紧随其后的是45周期放大在95°C的15秒,20秒58°C, 72°C,持续20秒。融化曲线的条件如下:Hold2 95°C, 1分钟0秒,Hold3 @ 40°C, 0分钟30秒,Hold4 @ 50°C, 0分钟30秒。熔体从50°C到90°C和数据获得家人/绿色和CY5 /红色通道。积极的控制、消极的控制,nontemplate控制(NTC)也跑了。所有10控制实时PCR分析类似。

 3.3。结果

患者的年龄介于11到50年平均年龄为24.20岁,是发病高峰出现在第二和第三年的生活。男:男女比例为0.76:1,轻微的女性的优势。宫颈区域圈是最常见(54.5%)。多点的大腿上被认为在24%的情况下。最常见的主诉是发热圈在48%的患者中,26.7%无症状的大腿上紧随其后。BCG疫苗接种记录在40%的病人。薄脓(描述的一致性的基础上,吸气材料)被认为在47%其次是厚脓在43.3%的情况下。FNA)材料的体积变化从0.5毫升到2.5毫升。与中性粒细胞坏死渗透和偶尔的上皮样细胞肉芽肿主要cytomorphological模式。百分之九十病例(空军基地)抗酸的杆菌阳性。 快艇可以在文化孤立6(20%)例。

 3.4。实时PCR结果

十七岁的30个样品(56.7%)显示突变 rpoB基因,其余13例(43.3%)有野生 rpoB基因(表 1)。我们能够检测17例(56.7%)RFM-resistant隔离的探针覆盖密码子531年和526年的 rpoB基因(图 1)。的 T 米 探针的 快艇H37v 73.8 - -74.8°C,突变体 rpoB探针是69.8 - -70.8°C。的 T 米 为RFM-resistant隔离创造了一滴4.0°C T 米 的调查。

实时PCR结果显示下降 T 米 。(野生/突变 rpob基因与不同的 T 米 ,本:野生,本B:突变)。

不。 颜色 的名字 基因型 峰1 峰2
1 MTB h37房车野生 野生 74.7(本)
2 001 DEL / 07年 野生 74.0(本)
3 002 DEL / 07年 突变体 70.3 B(本) 75.5
4 003 DEL / 07年 突变体 70.3 B(本) 75.3
5 004 DEL / 07年 野生 74.5(本)
6 005 DEL / 07年 野生 74.3(本)
7 006 DEL / 07年 野生 74.5(本)
8 007 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本)
9 008 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.2
10 009 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.8
11 0010 DEL / 07年 突变体 70.7 B(本) 75.5
12 0011 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本)
13 0012 DEL / 07年 野生 74.5(本)
14 0013 DEL / 07年 野生 74.5(本)
15 0014 DEL / 07年 野生 74.5(本)
16 0015 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.5
17 0016 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本)
18 0017 DEL / 07年 野生 74.2(本)
19 0018 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.0
20. 0019 DEL / 07年 野生 74.5(本)
21 0020 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.5
22 0021 DEL / 07年 突变体 70.3 B(本) 76.0
23 0022 DEL / 07年 野生 74.5(本)
24 0023 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.5
25 0024 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.8
26 0025 DEL / 07年 野生 74.7(本)
27 0026 DEL / 07年 突变体 70.2 B(本)
28 0027 DEL / 07年 野生 74.8(本)
29日 0028 DEL / 07年 突变体 70.3 B(本) 75.5
30. 0029 DEL / 07年 突变体 70.5 B(本) 75.5
31日 0030 DEL / 07年 野生 74.5(本)
32 0031 DEL / 07年 Mtb neg样本
33 数控

这份报告由Rotor-Gene 6000系列软件1.7(87年建立)2000 - 2006版权Corbett研究Corbett生命科学的一个分支。保留所有权利。ISO 9001: 2000 (Reg。不。QEC21313)。

真正time-PCR结果显示两种不同的山峰( T 米 野生和突变 rpoB基因。融化融化A.green数据。

 4所示。讨论

从FNAC获得的材料,这已成为一个安全、有效的一线调查技术评估的外围一圈,可用于各种临床和辅助测试像PCR ( 8, 9],提供广泛的信息关于诊断、治疗和后续。实时PCR已经成功应用在临床样品直接( 10, 11等各种微生物的检测 结核分枝杆菌( 12]。一些研究已发表的文献中直接检测的抵抗 快艇临床样本使用这种方法( 10]。实时PCR技术的主要优点是快速检测DNA提取)(1.5 - -2.0小时后,定量分析的能力非常微小的DNA数量及降低污染的风险。敏感性与特异性范围从71%到98%接近100% ( 13]。分析的方法是更重要的在病人已经在治疗耐药性是独立存在的细菌生活在所有培养方法是至关重要的。主要的障碍是要求昂贵的设备和试剂,标准化的技术,需要熟练的技术人员。因此实时PCR时间有效、敏感和特定的基因突变检测方法技术在临床样本。

根据世界卫生组织的指导方针( 2MDR的定义是耐异烟肼和RFM有或没有抵抗其他药物。利福平是最有效的杀菌药物 快艇、绑定和抑制转录的RNA聚合酶伸长的RNA ( 14, 15]。4单元的RNA聚合酶, rpoBgene-coded亚基基因突变是最重要的,因为在这个单位,RFM无法结合( 14)使细菌耐药性。抵抗RFM在 快艇通过遗传机制,通过随机发生,单步自发突变。错义突变在密码子526年到531年一直在报道至关重要对RFM[提供高度的抵抗 16]。

报告的频率的突变 rpoB在密码子531年是41%,32 - 36%密码子526,7 - 9%在密码子516 4, 17]。在 快艇monoresistance RFM罕见,至少90%的RFM-resistant临床分离株也耐异烟肼。因此,一个积极的结果RFM阻力代孕的耐多药结核病[一样有用 2]。因此使用耐多药结核病的分子检测方法是一个非常合乎逻辑的,经济、传统non-molecular培养方法和节省时间的方法。

在目前的研究中,FNAC的样本结核病大腿上的地位进行了研究 rpoB实时PCR基因。通过使用 rpoB调查覆盖了密码子531年和526年 rpoB基因,我们能够发现17 30 (56.7%)rifampin-resistant隔离。来自南印度早期的研究也表明,密码子531密码子526最常参与的突变 18, 19]。在剩余的13个样品不能检测到突变,因此他们被贴上野生。众所周知,3 - 5%的RFM-resistant隔离不拥有任何突变 rpoB基因( 4]。存在额外的机制包括RFM渗透率和小说在替代突变子单元的RNA聚合酶( 16]已知参与赋予耐药表型。这些突变的 rpoB基因可能已经错过了在这项研究中,因为我们使用的探针来检测突变电阻赋予区域的“热点” rpoB基因。

PCR检测 快艇DNA在100%的情况下同时积极通过锌90%是空军基地,从而证明实时PCR是一种更敏感的诊断结核病重叠染色技术。我们可以在两种情况下,即使检测DNA样本非常小(小于0.5毫升)。它建立了实用的实时PCR检测较小数量的DNA存在于临床样本,是很难获得的。

大多数的其他研究[ 20., 21)进行FNAC结核病圈样品显示文化积极率从17 - 55.5%不等。在目前的研究中,文化积极性较低的一侧(20%)。文化低积极性在这项研究可能是因为几个原因,包括缺乏细菌的存在,存在的杀菌物质,大多数患者治疗,和严厉的去污过程( 22]。PCR积极性culture-negative情况下突出的重要性,这种技术在检测耐药情况下,不能使用方法”为基础的企业文化。

与耐多药结核病,RFM耐药性的早期检测 快艇来华的患者是非常重要的不仅对病人管理,同时也对预防耐多药菌株的传播,如果不控制会有灾难性的影响结核病控制项目也非常依赖RFM ATT的一线药物。药敏测试的标准方法(DST) 快艇可能需要数周甚至数月提供结果。的结合使用一个简单、安全、快速程序像FNAC与实时PCR等分子技术是一种快速、准确、敏感会给一个额外的优势报告临床分离株的耐药性在很短的时间。

限制的研究

我们想要提到测序并不是我们研究的一部分。我们试图评估的可行性,利用相对更容易和简单的实时PCR技术可在较小的设置。测序是昂贵的,不容易在较小的设置。在发展中国家像我们这样的方便方法可能更重要的早期患者的有效管理。然而测序13例中可能是有用的 rpoB突变不能被使用的探针。

 承认

作者感谢收到的财政援助从德里Tapedik Unmulan Samiti, Gulabi花园,德里功能根据总局卫生服务,卫生和家庭福利,Nirman餐馆,新德里携带我们的研究。

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