SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2022/9896444 9896444 研究文章 BMSC-Derived液减轻椎间盘变性调制一种蛋白激酶/ mTOR-Mediated髓核细胞的自噬 肖 全 1 2 赵 哲 3 腾 云 4 吴 Lungang 2 王 金龙 2 徐 Hongjun 5 程ydF4y2Ba Sumei 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9619 - 2187 周 全 2 周 羌族 1 创伤中心 附属省道县人民医院南京医科大学康达学院的 怀安 江苏省223400年 中国 traumacenter.org 2 整形外科学系 徐州医科大学的附属医院怀安 怀安 江苏省223002年 中国 xzmc.edu.cn 3 整形外科学系 Xuyi人民医院 南京医科大学康达学院 怀安 江苏省211700年 中国 njmu.edu.cn 4 矫形外科学系 苏州大学第一附属医院 苏州 江苏 中国 sdfyy.cn 5 整形外科学系 附属省道县人民医院南京医科大学康达学院的 怀安 江苏省223400年 中国 sdfyy.cn 2022年 9 7 2022年 2022年 10 3 2022年 28 4 2022年 6 6 2022年 9 7 2022年 2022年 版权©2022全小et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

椎间盘变性(IDD)的发病机制尚不清楚。它已经表明,IDD最密切相关的病理过程髓核细胞的炎症(npc),炎症因素发挥着重要的作用。液是主要的旁分泌介质和与生物功能类似于微泡的细胞。研究表明,骨髓间充质干细胞(bmsc)可以抑制细胞凋亡的npc发送液抗炎和抗氧化,在IDD已被证明是有效的。然而,npc的抑制细胞凋亡的具体机制尚不清楚。在我们的研究中,BMSC-derived液(BMSC-Exo)从BMSC培养基,分离及其在细胞凋亡效应进行评估和鼠模型探讨可能的机制。我们发现BMSC-Exo促进自噬在npc和il - 1等抑制炎性因子的释放 β和肿瘤坏死因子- α在npc LPS-treated npc,抑制细胞凋亡。进一步的研究表明,BMSC-Exo抑制Akt-mTOR通路。BMSC-Exo减轻椎间盘变性肌内注射的老鼠IDD模型。总之,我们的研究结果表明,BMSC-Exo可以减少人大通过促进自噬通过抑制细胞凋亡,减轻IDD Akt-mTOR通路。我们的研究带来一个有前途的治疗策略,国际直拨电话。 怀安自然科学研究计划 HAB201953 江苏省卫生委员会 M2020103 1。介绍</tgydF4y2Baitle> <p>腰痛的原因有很多,但椎间盘变性(IDD)是主要原因,已成为最常见的一种疾病,严重影响人类健康<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B1"> 1</xgydF4y2Baref>]。目前,IDD的主要治疗方法包括保守治疗和手术治疗,如髓核,这是旨在治疗症状,但没有有效的根治方法IDD [<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B2"> 2</xgydF4y2Baref>),这主要是由于这样的事实,目前发病机理仍缺乏定义,目前最有效的治疗目标是更少。因此,它具有十分重要的意义,进一步探索IDD的调控机制,寻找有效的干预措施预防。自噬,生物学领域的一个热门话题,被认为是参与各种退化性疾病的发生和发展。目前认为,自噬在修复中扮演着重要的角色,椎间盘细胞的退化和死亡(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B3"> 3</xgydF4y2Baref>- - - - - -<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B5"> 5</xgydF4y2Baref>]。相关研究发现自噬发挥作用就像一把双刃剑在退化。一方面,正常的身体有一个基础的自噬水平,具有重要意义的更新和修复细胞自身(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B6"> 6</xgydF4y2Baref>- - - - - -<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B8"> 8</xgydF4y2Baref>]。另一方面,过度自噬可能会导致细胞死亡,和过度自噬在髓核细胞的控制(npc)可以减少细胞凋亡,从而延迟IDD的发展(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B9"> 9</xgydF4y2Baref>]。因此,它是极其有意义的确定如何监管盘自噬和发挥它的好处,以限制其缺点。</gydF4y2Bap> <p>再生医学和干细胞移植为主要治疗近几十年来逐渐浮出水面。骨间充质干细胞(bmsc)可以直接接触npc,促进其增殖通过旁分泌<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B10"> 10</xgydF4y2Baref>]。发现bmsc可以抑制NPC细胞凋亡,减轻IDD交付液作为抗炎和抗氧化剂(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B11"> 11</xgydF4y2Baref>]。然而,骨骼间充质干细胞的具体机制液(BMSC-Exo)抑制鼻咽癌细胞凋亡尚不清楚。人们已经发现,核转录因子的击倒kappa-B (NF -<gydF4y2Baitalic> κ</gydF4y2Baitalic>B)促进细胞自噬通过mTOR / AKT通路和自噬引起的NF -<gydF4y2Baitalic> κ</gydF4y2Baitalic>B抑制具有保护作用的npc变性引起的脂多糖(LPS) [<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</xgydF4y2Baref>]。我们之前的研究还发现,BMSC-Exo抑制NPC细胞凋亡抑制NF -<gydF4y2Baitalic> κ</gydF4y2Baitalic>B信号通路(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B13"> 13</xgydF4y2Baref>]。因此,我们假设BMSC-Exo可能通过mTOR / AKT通路促进自噬的npc随后减少炎症细胞和抑制npc细胞凋亡。本研究拟探讨的可能性BMSC-Exo调节人大自噬抑制细胞凋亡及其特定的机制,以便为IDD的治疗提供新思路。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2"> <title>2。材料和方法</tgydF4y2Baitle> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。化学药品和试剂</tgydF4y2Baitle> <p>化学药品和试剂如下:IMDM细胞培养基,细胞F12培养基(Gibco);成骨的脂肪形成的/ chondrogenic诱导分化培养基(苏州Syagen);ii胶原酶,有限合伙人,3-MA IGF-1Triton, x - 100渐变(σ);兔子兔子II型胶原主要抗体,裂解Caspase-3主要抗体,兔子伯灵顿主要抗体,兔子LC3主要抗体,兔子Beclin-1主要抗体,兔子<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>肌动蛋白主要抗体,兔子p-Akt主要抗体,兔子Akt主要抗体,兔子p-mTOR主要抗体,兔子mTOR主要抗体,HRP-labeled山羊anti-rabbit二级抗体,兔子CD45主要抗体,兔子CD34主要抗体,兔子CD29主要抗体,兔子CD90主要抗体,兔子CD63主要抗体,兔子CD9主要抗体,兔子GAPDH初级抗体和兔TSG101主要抗体(Abcam);TBS缓冲区,PBS缓冲(Biosharp);外来体隔离设备(技术);初级抗体稀释,二级抗体稀释,试剂盒溶解产物,ECL装备,PKH67染色装备,BCA蛋白质定量工具,膜联蛋白V-APC /π凋亡检测装备,DAPI染色方案,里帕溶解产物(媒介),和PMSF (Beyotime、江苏);5一体化RT MasterMix SYBR绿色Supermix (Abm),页面凝胶快速准备工具包(12.5%)(上海Epizyme);肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>ELISA检测试剂盒,il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>ELISA检测装备,和上海酶链接。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。实验动物</tgydF4y2Baitle> <p>八SD雄性老鼠SPF(年龄在6 - 8周)重<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mn> 200年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ±</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 20.</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>g,买来Zhaoyan(苏州)新药研究中心有限公司有限公司许可。SCXK(苏州)2018 - 0016,资格证书没有。202008469。协议是动物委员会批准的苏州大学第一附属医院(批准号353/2020)。实验老鼠美联储自适应模式的光和天交替(光时间:07:00-18:00),温度约25°C,湿度50%左右,和良好的通风,以及免费的饮食和饮水。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。细胞隔离和文化</tgydF4y2Baitle> <p>bmsc 6-8-week-old SD雄性大鼠中分离培养如下描述。短暂,骨髓分离大鼠的股骨和胫骨冲洗无血清培养基(IMDM;美国Gibco)。细胞细胞溶解的红细胞溶解产物和培养IMDM(含10%的边后卫)37°C,湿度95% -100% 5%股份有限公司<gydF4y2Basub>2</gydF4y2Basub>。首先改变的媒介执行后24 - 48 h,以后每隔2 - 3 d的频率。细胞通道和分裂增长约80% -90%时填写的孵化器。综合本研究中使用P4代细胞。</gydF4y2Bap> <p>髓核组织分散,II型胶原酶消化180分钟;100年组织残留是过滤<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>在4°C m过滤和离心5分钟,半径1000 r / min;和上层的移除。F12培养基被混合均匀,重复3次,接种<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 6</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞每孵化器静态文化,通过在正确的时间。在这个实验中使用的npc都P3-generation细胞。发现的细胞甲苯胺蓝染色和II型胶原蛋白采用免疫染色。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>2.4。评估Mutipotency bmsc的</tgydF4y2Baitle> <p>P4-generation bmsc注射6-orifice板块<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mn> 2</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/密度,分为脂肪形成的感应,成骨诱导,分别和chondrogenic感应。bmsc培养在以下介质类型:(1)脂肪形成的分化培养基含有high-glucose DMEM, 10%的边后卫,更易与0.1 L 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml胰岛素,10 nM地塞米松,50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml吲哚美辛,100 U /毫升链霉素,和100 U /毫升青霉素;(2)成骨分化培养基含有high-glucose DMEM, 10%的边后卫,50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml抗坏血酸,10毫米<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>甘油磷酸盐,10 nM地塞米松,100 U /毫升链霉素,和100 U /毫升青霉素;和(3)chondrogenic分化培养基含有high-glucose DMEM, 50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml抗坏血酸,100 nM地塞米松,1毫米丙酮酸钠,40岁<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml脯氨酸,100 U /毫升链霉素,100 U /毫升青霉素,10 ng / ml TGF<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>3、6.25 +预混料(最终浓度<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>6.25 g / ml牛胰岛素<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>6.25 g / ml转铁蛋白,<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>5.33 g / ml亚硒酸<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml亚油酸和1.25毫克/毫升牛血清白蛋白)。感应介质改变每3天。14天,细胞被固定和沾油红O脂肪细胞,茜素红的骨细胞、软骨细胞的阿尔新蓝。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。描述bmsc的流式细胞术</tgydF4y2Baitle> <p>流式细胞仪是用来确定bmsc的具备干细胞特性的分析特定的细胞表面标记。使胰蛋白酶化后,细胞在0.5毫升resuspended磷酸盐(PBS)和孵化30 - 40分钟在4°C与荧光标记抗体(空白控制管没有抗体)和0.3毫升resuspended PBS,然后分析。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。BMSC-Exo的提取和识别</tgydF4y2Baitle> <p>当P4-generation bmsc成长80%,血清IMDM是培养48 h,收集上清液后,外分泌被超高速离心提取。简单地说,文化上层清液的收集和离心机<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 300年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> g</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>10分钟在4°C和保留上层清液,继续<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mn> 2000年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> g</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>离心20分钟在同一温度和保留上层清液,继续<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mn> 10000年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> g</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>在同一温度为30分钟和离心保留上层清液,并继续<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mn> 100000年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> g</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>离心分离在同一温度为70分钟;获得的沉淀液,稀释<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>,并存储在一个冰箱在-80°C。BMSC-Exo形态由透射电子显微镜观察。少量的外来体样品被稀释的三个部分,1、3、7倍量<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>分别添加。然后,减少20<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l每个稀释样品表面上的铜网覆盖着碳膜,让它代表60 - 90年代,用滤纸吸收多余的样品,让它干燥。然后,10<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l醋酸铀被添加到每个样本在黑暗条件下染色。1分钟后,残余染料被滤纸吸收,在室温下干燥。透射电镜下观察染色和拍照。外来体粒子直径分布的数据是由纳米粒子跟踪检测分析仪。液离心后得到稀释<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>(1:500)。200年移液枪吸收<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l,仪器是用于相应predetection,调整到适当的浓度范围。液稀释到适当的浓度检测的计算机,和数据分布图表的外来体粒径。bmsc和外来体表面标记蛋白质被免疫印迹检测和识别。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。外来体标记和细胞吸收</tgydF4y2Baitle> <p>后的母液PKH67染色装备在室温下,包含100年的液<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g蛋白添加和孵化在室温下15分钟。10毫升<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>添加之前添加一半的试剂的外来体提取设备,混合和休息在4°C 1 h,然后离心<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:mn> 10000年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> g</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>30分钟,与200年降水量resuspended<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l 1×PBS;然后,PKH67-labeled液。他们孵化与附着npc 48 h,固定在多聚甲醛(4%),和洗了三次PBST (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> +</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.1</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>% Triton x - 100) 10分钟。添加了3毫升的1% BSA孵化与PBST(30分钟,洗<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> +</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.1</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>%渐变)3次,每次10分钟。3毫升DAPI染色溶液为0.5<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml添加和孵化10分钟,洗3次PBST (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:mn> 1</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 美国公共电视台</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> +</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.1</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>%渐变)或10分钟,然后拍摄荧光倒置显微镜下观察到。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。检测CCK-8人大可行性的</tgydF4y2Baitle> <p>消化的npc在96孔板接种<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:mn> 2</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/孔。24小时后,细胞在含有不同浓度的培养基培养有限合伙人(0、100、200、500和1000<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml) 24小时,每个浓度六个复制。每个孔与10孵化<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>l CCK-8试剂60分钟。的<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:mi> 一个</gydF4y2Bamml:mi> </mml:math> </inline-formula>每个孔的价值衡量标仪波长450 nm,显示npc的活力。细胞存活率计算如下:<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:mtext> 细胞</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 生存能力</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mfenced open="[" close="]"> <mml:mrow> <mml:mfenced open="(" close=")"> <mml:mrow> <mml:mtext> 作为</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> −</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> Ab</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:mfenced> <mml:mo> /</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mfenced open="(" close=")"> <mml:mrow> <mml:mtext> 交流</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> −</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> Ab</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:mfenced> </mml:mrow> </mml:mfenced> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> One hundred.</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mi> %</gydF4y2Bamml:mi> </mml:math> </inline-formula>,是一个值的实验孔(包含髓核细胞培养基、CCK-8和有限合伙人);交流是<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:mtext> 有限合伙人</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 浓度</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 一个</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 价值</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 的</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 细胞</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 孔板</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>在0<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml;Ab是一个值的空白孔(中没有髓核细胞有限合伙人,和CCK-8);和<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:mtext> Ab</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.002</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>在这个实验中。适当浓度的有限合伙人选择结果显示诱导细胞凋亡的npc。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.9"> <title>2.9。在npc液对细胞凋亡和自噬的影响</tgydF4y2Baitle> <sec id="sec2.9.1"> <title>2.9.1。人大炎症模型的建立</tgydF4y2Baitle> <p>具体组织如下:对照组:正常培养npc;模型组:正常情况下培养的npc孵化2毫升的F12包含500的完全培养基<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>48 h g / ml LPS建立npc的炎症模型;外来体治疗组:正常情况下培养的npc孵化2毫升的F12完全培养基包含500年的有限合伙人<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>20 g / ml BMSC-Exo一样<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g 48 h;自噬抑制组:正常培养npc被孵化2毫升的F12完全培养基包含500年的有限合伙人<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml和自噬抑制剂3-methyladenine 10毫米(3-MA)以及BMSC-Exo 20<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g 48 h。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.9.2"> <title>2.9.2。一</tgydF4y2Baitle> <p>收集细胞,提取RNA检测提取RNA的浓度。RNA是反向转录产生互补和放大使用这个模板。扩展的参数设置为95°C, 40年代,95°C, 10年代,60°C,和35个年代,总共30个周期。结果数据分析使用7300系统SDS软件和II型胶原蛋白的相对表达水平(COL2A1) Beclin-1, il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>在髓核细胞为每个组使用参考GAPDH作为控制,即。,2<gydF4y2Basup>- - - - - -△△Ct</gydF4y2Basup>价值。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 2</gydF4y2Bamml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> −</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mo> △</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mo> △</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> Ct</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mfenced open="(" close=")"> <mml:mrow> <mml:mtext> C</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:msub> <mml:mrow> <mml:mtext> T</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mtext> 目标</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 基因</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 的</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 实验</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 集团</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:msub> <mml:mo> −</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> C</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:msub> <mml:mrow> <mml:mtext> T</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mtext> GAPDH</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 的</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 实验</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 集团</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:msub> </mml:mrow> </mml:mfenced> <mml:mo> −</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mfenced open="(" close=")"> <mml:mrow> <mml:mtext> C</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:msub> <mml:mrow> <mml:mtext> T</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mtext> 目标</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 基因</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 的</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 控制</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 集团</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:msub> <mml:mo> −</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> C</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:msub> <mml:mrow> <mml:mtext> T</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mtext> GAPDH</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 的</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 控制</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 集团</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:mrow> </mml:msub> </mml:mrow> </mml:mfenced> </mml:math> </inline-formula>。II型胶原蛋白的表达水平,Beclin-1, il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>被发现与GAPDH内部参考。引物序列见表<xgydF4y2Baref rid="tab1" ref-type="table"> 1</xgydF4y2Baref>。</gydF4y2Bap> <table-wrap id="tab1"> <label>表1</gydF4y2Balabel> <p>寡核苷酸引物用于RT-qPCR。</gydF4y2Bap> <table> <thead> <tr> <th align="left">基因</tgydF4y2Bah> <th align="center">正向引物</tgydF4y2Bah> <th align="center">反向引物</tgydF4y2Bah> <th align="center">退火(°C)</tgydF4y2Bah> </tr> </thead> <tbody> <tr> <td align="left">GAPDH</tgydF4y2Bad> <td align="center">CTTCTCTTGTGACAAAGTGGA</tgydF4y2Bad> <td align="center">TTAGCGGGATCTCGCTC</tgydF4y2Bad> <td align="center">60</tgydF4y2Bad> </tr> <tr> <td align="left">COL2A1</tgydF4y2Bad> <td align="center">CCTGAAACTCTGCCACCCAG</tgydF4y2Bad> <td align="center">GTTCTTCCGAGGCACAGTCG</tgydF4y2Bad> <td align="center">60</tgydF4y2Bad> </tr> <tr> <td align="left">Beclin-1</tgydF4y2Bad> <td align="center">GTTCTCTCAGTTGCCTTTC</tgydF4y2Bad> <td align="center">AGCTGTAACCTGTCGCCGAGTCCC</tgydF4y2Bad> <td align="center">60</tgydF4y2Bad> </tr> <tr> <td align="left">il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic></td> <td align="center">CCGGAGTCTGACTGGAAAGCC</tgydF4y2Bad> <td align="center">GCATACAGGAAGTCGGCCTCC</tgydF4y2Bad> <td align="center">60</tgydF4y2Bad> </tr> </tbody> </table> </table-wrap> </sec> <sec id="sec2.9.3"> <title>2.9.3。免疫印迹分析</tgydF4y2Baitle> <p>髓核细胞的蛋白质在每组由BCA法提取并量化。电泳分离后30<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g蛋白样品,转移膜、膜切割、密封,以及孵化与初级和二级抗体,抗体进行了然后暴露和拍照。使用肌动蛋白作为内部参考,每个波段的灰度值计算得到相对每个组蛋白的表达。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.9.4"> <title>2.9.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)</tgydF4y2Baitle> <p>每个小组收集的上清液;离心机在室温下,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:mn> 500年</gydF4y2Bamml:mn> <mml:mo> ×</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> g</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>,5分钟;轻轻地用吸管枪吸收,和il - 1的内容<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>和肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>测量根据il - 1的说明吗<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>和肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>ELISA试剂盒。</gydF4y2Bap> </sec> </sec> <sec id="sec2.10"> <title>2.10。BMSC-Exo促进自噬通过抑制Akt-mTOR通路</tgydF4y2Baitle> <p>npc被分成以下组:变性组:正常培养npc和2毫升的F12孵化中包含500年完成<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>为48 h g / ml有限合伙人;外来体组:正常培养npc被孵化2毫升的F12完全培养基包含500年的有限合伙人<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>20 g / ml BMSC-Exo一样<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g 48 h;正常途径激活组:培养npc孵化了F12完全培养基在20 500 ng / ml包含有限合伙人<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml和Akt-mTOR通路胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)以及BMSC-Exo 20<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g 48 h。免疫印迹检测Akt-mTOR通路蛋白表达在npc。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.11"> <title>2.11。建立动物模型</tgydF4y2Baitle> <sec id="sec2.11.1"> <title>2.11.1。动物被分成三组</tgydF4y2Baitle> <p> <italic> 对照组</gydF4y2Baitalic>:IDD的老鼠的动物模型建立了纤维环的针穿刺。具体方法如下:健康SPF雄性SD大鼠腹腔内注射麻醉的1%戊巴比妥钠溶液为0.4毫升/公斤;他们被放置在一个卧姿消毒骨架和尾巴。21号使用注射针穿刺椎间空间垂直通过背中心约5毫米;针旋转了360度,呆了30年代。消毒后,老鼠被自由移动,然后,椎间盘退变动物模型的建立。那时一点盐水注入的磁盘空间。</gydF4y2Bap> <p> <italic> 外来体治疗组(外来体)</gydF4y2Baitalic>:液注射30<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g到暴露出老鼠IDD盘空间模型。</gydF4y2Bap> <p> <italic> 途径激活组(igf - 1)</gydF4y2Baitalic>:igf - 1 60 ng以及30<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g液的注入的暴露出老鼠IDD盘空间模型。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.11.2"> <title>2.11.2。组织学检查</tgydF4y2Baitle> <p>8周后老鼠牺牲;Co9/10椎间盘组织拍摄和10%中性甲醛固定,石蜡包埋与10% EDTA脱钙作用后4周,然后分段,紧随其后的是他为II型胶原染色和免疫组织化学染色;然后,在显微镜下观察髓核组织损伤。获得的图像采集的图像分析系统和分析Image-Pro + 6.0软件。</gydF4y2Bap> </sec> <sec id="sec2.11.3"> <title>14。检查</tgydF4y2Baitle> <p>MRI检查进行4周和8周后注入椎间盘变性的程度进行评估。1.5 T MRI(美国通用电气HDx,密尔沃基,WI)被用来获得t2加权像矢状,三组的成绩我到V模型动物的分类根据修改后的汤普森得分(我指的是正常的;II意味着略微降低了信号,但高信号区显著下降;三世意味着适度降低信号;和第四意味着显著降低信号强度)。</gydF4y2Bap> </sec> </sec> <sec id="sec2.12"> <title>2.12。统计分析</tgydF4y2Baitle> <p>测量数据所表达的<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:mtext> 的意思是</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> ±</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> 标准</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> 偏差</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:mover accent="false"> <mml:mrow> <mml:mi> x</gydF4y2Bamml:mi> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ¯</gydF4y2Bamml:mo> </mml:mrow> </mml:mover> <mml:mo> ±</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mi> 年代</gydF4y2Bamml:mi> </mml:math> </inline-formula>),比较分析了多个组间方差分析分析<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M25"> <mml:mi> t</gydF4y2Bamml:mi> </mml:math> </inline-formula>以及用于两组之间的比较,和SPSS 20.0软件被用于实验数据的统计分析,和<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M26"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.05</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>被认为是具有统计学意义。</gydF4y2Bap> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3所示。结果</tgydF4y2Baitle> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。老鼠bmsc的识别,npc, BMSC-Exo</tgydF4y2Baitle> <p>的bmsc生长均匀spindle-like形态(图<xgydF4y2Baref rid="fig1a" ref-type="fig"> 1(一)</xgydF4y2Baref>光学显微镜下)(×100)。油红O染色(图<xgydF4y2Baref rid="fig1b" ref-type="fig"> 1 (b)</xgydF4y2Baref>),茜素红染色(图<xgydF4y2Baref rid="fig1c" ref-type="fig"> 1 (c)</xgydF4y2Baref>),阿尔新蓝染色(图<xgydF4y2Baref rid="fig1d" ref-type="fig"> 1 (d)</xgydF4y2Baref>)表明,bmsc可以分化成脂肪细胞,成骨细胞、软骨细胞。流式细胞仪是用来检测的具体表达式CD90、CD29 bmsc的膜表面,而CD34的表达和CD45没有发现(图<xgydF4y2Baref rid="fig1e" ref-type="fig"> 1 (e)</xgydF4y2Baref>)。主要npc培养了14 d和形态学改变包含分泌颗粒长轴(图<xgydF4y2Baref rid="fig1f" ref-type="fig"> 1 (f)</xgydF4y2Baref>)。甲苯胺中核是蓝色和显示细胞外基质稍浅,表明细胞可以分泌粘多糖(图<xgydF4y2Baref rid="fig1g" ref-type="fig"> 1 (g)</xgydF4y2Baref>)。II型胶原蛋白采用免疫染色表明,细胞质染色在褐黄色,表明II型胶原蛋白表达在细胞质内(图<xgydF4y2Baref rid="fig1h" ref-type="fig"> 1 (h)</xgydF4y2Baref>)。BMSC-Exo的特点是通过TEM、NTA和免疫印迹。TEM数据显示液的杯状容器结构的直径约100海里(×50000)(图<xgydF4y2Baref rid="fig1i" ref-type="fig"> 1(我)</xgydF4y2Baref>)。NTA显示液的直径是100纳米(图<xgydF4y2Baref rid="fig1j" ref-type="fig"> 1 (j)</xgydF4y2Baref>)。蛋白质免疫印迹结果表明制造商的外来体膜,CD9、CD63,和TSG101表示液和CD29 bmsc(图<xgydF4y2Baref rid="fig1k" ref-type="fig"> 1 (k)</xgydF4y2Baref>)。由PKH67染色液染色显示绿色荧光,细胞核在npc DAPI染色的染色显示蓝色荧光,通过codisplayed;液在npc在髓核胞浆显示绿色荧光,表明液膜融合的能力,可以摄取npc(图<xgydF4y2Baref rid="fig1l" ref-type="fig"> 1(左)</xgydF4y2Baref>)。</gydF4y2Bap> <fig-group id="fig1"> <label>图1</gydF4y2Balabel> <p>形态和特征的BMSC, npc, BMSC-Exos:(一)P0-generation BMSC形态(比例尺:200<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米);(b)油红O染色(比例尺:100<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米);(c)茜素红染色(比例尺:100<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米);(d)阿尔新蓝染色(比例尺:50<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米),<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M27"> <mml:mi> n</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 3</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>;(e)流仪分析表面标记BMSC (CD29, CD90、CD34、CD45);(f)人大形态(比例尺:200<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米);(g)甲苯胺蓝染色的npc(比例尺:100<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米);(h) II型胶原免疫化学染色的npc(比例尺:100<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>米);(我)透射电子显微镜(TEM)的形象BMSC-Exo(比例尺:200 nm);(j) NanoSight跟踪分析(NTA) BMSC-Exo的直径;(k)免疫印迹分析CD9、CD63, TSG101,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M28"> <mml:mi> n</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 3</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>;(l)的分析由npc细胞外来体吸收。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M29"> <mml:mi> n</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 3</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>。比例尺:25<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>m。</gydF4y2Bap> <fig id="fig1a"> <label>(一)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001a"></graphic> </fig> <fig id="fig1b"> <label>(b)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001b"></graphic> </fig> <fig id="fig1c"> <label>(c)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001c"></graphic> </fig> <fig id="fig1d"> <label>(d)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001d"></graphic> </fig> <fig id="fig1e"> <label>(e)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001e"></graphic> </fig> <fig id="fig1f"> <label>(f)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001f"></graphic> </fig> <fig id="fig1g"> <label>(g)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001g"></graphic> </fig> <fig id="fig1h"> <label>(h)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001h"></graphic> </fig> <fig id="fig1i"> <label>(我)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001i"></graphic> </fig> <fig id="fig1j"> <label>(j)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001j"></graphic> </fig> <fig id="fig1k"> <label>(k)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001k"></graphic> </fig> <fig id="fig1l"> <label>(左)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.001l"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。BMSC-Exo抑制人大通过促进自噬细胞凋亡</tgydF4y2Baitle> <p>诱导细胞凋亡的npc,我们培养的npc有限合伙人梯度浓度(0、100、200、500和1000<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml)。CCK-8结果表明,处理后500年<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml有限合伙人,集成光密度(IOD)值显著降低(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M30"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<xgydF4y2Baref rid="fig2a" ref-type="fig"> 2(一个)</xgydF4y2Baref>);因此,我们建立了500年治疗npc细胞凋亡模型<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>克/毫升有限合伙人。处理后BMSC-Exo梯度浓度(12、16、20和30<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml) 48 h, npc逐渐增加(图的可行性<xgydF4y2Baref rid="fig2b" ref-type="fig"> 2 (b)</xgydF4y2Baref>)。与对照组相比,COL2A1的mRNA表达显著降低,而Beclin-1和il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>模型组显著增加(处理500<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml LPS) (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M31"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>);与模型组相比,mRNA的表达COL2A1 Beclin-1显著增加,而il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>减少外来体治疗组(治疗500<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>20 g / ml有限合伙人和<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml BMSC-Exo) (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M32"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>);与外来体治疗组相比,COL2A1 mRNA表达和Beclin-1显著降低,而il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>自噬抑制组显著增加(处理500<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>20 g / ml有限合伙人,<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>g / ml BMSC-Exo, 10毫米3-MA) (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M33"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>)(图<xgydF4y2Baref rid="fig2c" ref-type="fig"> 2 (c)</xgydF4y2Baref>)。此外,我们发现自噬和apoptosis-related蛋白质(Col2a1,巴克斯特,LC3、Beclin-1和裂解Caspase-3)表达与免疫印迹分析和il - 1的释放<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>和肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>与ELISA与mRNA表达(数据是相一致的<xgydF4y2Baref rid="fig2d" ref-type="fig"> 2 (d)</xgydF4y2Baref>- - - - - -<xgydF4y2Baref rid="fig2g" ref-type="fig"> 2 (g)</xgydF4y2Baref>)。总之,这些结果表明,BMSC-Exo抑制人大通过促进自噬细胞凋亡。</gydF4y2Bap> <fig-group id="fig2"> <label>图2</gydF4y2Balabel> <p>BMSC-Exo抑制NPC细胞凋亡促进自噬:(a)集成光密度(IOD) NPC LPS浓度梯度处理;(b) IOD的npc治疗BMSC-Exo梯度浓度;(c)的mRNA表达npc与LPS孵化后,BMSC-Exo,或3-MA;(d)蛋白质水平的自噬和apoptosis-related (Col2a1,巴克斯特,LC3、Beclin-1和裂解Caspase-3)在npc与有限合伙人接受治疗后,BMSC-Exo或3-MA。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M34"> <mml:mi> n</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 6</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>。数据了<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M35"> <mml:mtext> 的意思是</gydF4y2Bamml:mtext> <mml:mo> ±</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mtext> SD</gydF4y2Bamml:mtext> </mml:math> </inline-formula>。统计分析与学生的表现<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M36"> <mml:mi> t</gydF4y2Bamml:mi> </mml:math> </inline-formula>以及和单向方差分析之后,图基的多重比较测试。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M37"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.05</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>;<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M38"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</gydF4y2Bap> <fig id="fig2a"> <label>(一)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>(b)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002b"></graphic> </fig> <fig id="fig2c"> <label>(c)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002c"></graphic> </fig> <fig id="fig2d"> <label>(d)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002d"></graphic> </fig> <fig id="fig2e"> <label>(e)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002e"></graphic> </fig> <fig id="fig2f"> <label>(f)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002f"></graphic> </fig> <fig id="fig2g"> <label>(g)</gydF4y2Balabel> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.002g"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。BMSC-Exo促进自噬通过抑制Akt-mTOR通路</tgydF4y2Baitle> <p>阐明液促进自噬的机制,npc被分为三组:变性组、外来体组和途径激活组。自噬的相对表达pathway-related蛋白质像p-Akt p-mTOR, LC3 II /我在npc被免疫印迹检测。结果表明,与变性组相比,p-Akt / Akt和p-mTOR / mTOR显著降低,和LC3 II /我在外来体组显著增加。与外来体组相比,p-Akt / Akt和p-mTOR / mTOR显著增加,而LC3 II /我途径激活组显著减少(图<xgydF4y2Baref rid="fig3" ref-type="fig"> 3</xgydF4y2Baref>(a))。因此,液可以显著减少的相对表达p-Akt p-mTOR;然而,当Akt-mTOR通路被激活,p-mTOR的水平和p-Akt恢复和自噬水平相对较低,这表明液促进自噬通过抑制Akt-mTOR通路在npc LPS-induced变性。</gydF4y2Bap> <fig id="fig3"> <label>图3</gydF4y2Balabel> <p>免疫印迹检测p-Akt的相对表达的变化,一种蛋白激酶,p-mTOR mTOR, LC3在每组。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M39"> <mml:mi> n</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> =</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 6</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M40"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.05</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>;<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M41"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</gydF4y2Bap> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.003"></graphic> </fig> </sec> <sec id="sec3.4"> <title>3.4。BMSC-Exo促进自噬通过抑制减轻椎间盘变性鼠IDD Akt-mTOR通路的模型</tgydF4y2Baitle> <p>在进一步的研究中,我们建立了一个椎间盘变性大鼠模型观察BMSC-Exo在变性的治疗效果。核磁共振扫描进行所有的老鼠。结果显示明显降低外来体组的汤普森的t2加权阶段评分在治疗8周(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M42"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.05</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>)与其他两组相比(数据<xgydF4y2Baref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</xgydF4y2Baref>(一)和<xgydF4y2Baref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</xgydF4y2Baref>(c))。控制和途径激活组染色显示减少椎间盘核和核细胞数量和数量也在椎间盘纤维环损伤。然而,更多的髓核细胞和纤维环完整的外来体治疗组(数字<xgydF4y2Baref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</xgydF4y2Baref>(b)和<xgydF4y2Baref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</xgydF4y2Baref>(d))。盘的功能是由胶原蛋白II。管理液导致II型胶原蛋白的表达增加与控制和途径激活组(图<xgydF4y2Baref rid="fig4" ref-type="fig"> 4</xgydF4y2Baref>(e))。这表明,液有助于椎间盘变性的结构和功能的恢复,有效促进合成和分泌的主要基质成分在椎间盘变性,这是通过Akt-mTOR通路的激活。</gydF4y2Bap> <fig id="fig4"> <label>图4</gydF4y2Balabel> <p>活体动物实验的结果。(a) MRI发现后注入液和igf - 1的尾盘老鼠。(b)的组织学分析他和S / O染色光盘。II型胶原免疫组织化学染色显示外来体组II型胶原蛋白的存在,但在控制和外来体+ igf - 1组。酒吧规模:100<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>m。汤普森(c)的三组。外来体组的得分低于其他群体。(d)组织学评分显示,8周后显著地提高成像的外来体的疗法,但更高的控制和外来体+ igf - 1组;(e)免疫组织化学染色的II型胶原面积(%)。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M43"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</gydF4y2Bamml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.01</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</gydF4y2Bap> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.004"></graphic> </fig> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4所示。讨论</tgydF4y2Baitle> <p>IDD的发病机制尚不清楚,证据已经建立,椎间盘变性的病理过程密切相关,增加氧化应激,炎症因子,细胞凋亡,增加基质金属蛋白酶(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</xgydF4y2Baref>]。炎症是最密切相关的npc,和炎症因素起着关键作用<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B14"> 14</xgydF4y2Baref>,<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B15"> 15</xgydF4y2Baref>]。促炎因子不仅抑制细胞外基质的合成,诱导细胞凋亡,导致npc的数量减少,而进一步加剧IDD [<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</xgydF4y2Baref>]。它已经表明,MSC-derived液可以抑制椎间盘的炎症反应,从而降低npc的凋亡反应,但机制尚不清楚。因此,有必要探讨机制MSC-derived液在椎间盘炎症反应和细胞凋亡。</gydF4y2Bap> <p>液微泡测量直径约40 - 100海里,含有多种生物活性物质(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B16"> 16</xgydF4y2Baref>]。研究表明,液发挥重要作用在细胞通讯和代谢调节<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B17"> 17</xgydF4y2Baref>]。BMSC-Exo抑制炎症介质的活化,减少髓核细胞凋亡(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B11"> 11</xgydF4y2Baref>]。外来体分离和提取方法主要包括超速离心法、聚合物沉淀、超滤,immunoaffinity和微流体分离技术。超速离心法是“黄金标准”,使用最广泛的<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B18"> 18</xgydF4y2Baref>]。该方法用于提取液在这项研究中。被国际社会公认为细胞外液的囊泡规定识别必须包括粒子大小、形态、和蛋白质分子标记(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B19"> 19</xgydF4y2Baref>]。提取液通过观察粒径纳米粒子跟踪分析仪检测表面标记和免疫印迹分析,并使用免疫荧光试验,证实,他们可以由npc摄取。我们发现外来体组的细胞凋亡被流式细胞术盲目地明显,建议可以摄取BMSC-Exo npc和减少细胞凋亡。</gydF4y2Bap> <p>有限合伙人是一个重要的促炎因子在人体能诱导强烈的炎症npc导致细胞凋亡,减少细胞外基质合成,扮演着一个重要的角色在国际国内直拨电话<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</xgydF4y2Baref>]。有限合伙人可以激活炎症反应促进细胞凋亡<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</xgydF4y2Baref>]。因此,有限合伙人被选为感应介质在我们的研究中;这是CCK-8实验中发现的<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M44"> <mml:mi> 一个</gydF4y2Bamml:mi> </mml:math> </inline-formula>值逐渐降低LPS浓度的增加,它呈正相关,细胞生存能力,在这个值没有显著差异与LPS组测试500<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>克/毫升和1000年<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>克/毫升。因此,我们使用500年有限合伙人<gydF4y2Baitalic> μ</gydF4y2Baitalic>克/毫升浓度建立细胞凋亡模型,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率;这是观察到npc的LPS有效诱导细胞凋亡。</gydF4y2Bap> <p>结果表明:椎间盘变性可能产生大量炎症因子,如肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>和il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</xgydF4y2Baref>]。作为一个起始因子的炎症,肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>可以刺激其他炎症因子的表达,也有协同TNF -<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>等刺激炎症因子,il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>,“正反馈”效应(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B21"> 21</xgydF4y2Baref>]。发现细胞外基质降解增加刺激后il - 1的npc<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>,推进IDD的发展<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B22"> 22</xgydF4y2Baref>]。因此,炎症状态的细胞可以被理解的检测TNF -<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>和il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>。在这个实验中,我们检查了il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>信使rna RT-qPCR和发现,il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>信使rna在npc LPS-induced变性后显著增加,与il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>信使rna外来体治疗后明显下降。TNF -的浓度的检测<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>和il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>上层清液的浓度为每组ELISA显示,模型组的浓度明显增加,与对照组相比,这些外来体组与模型组相比显著降低。所有的结果表明,有限合伙人提升npc的炎症反应,但液抑制它。</gydF4y2Bap> <p>自噬是一个关键的适应性反应,是一种细胞自我保护的过程,可以降解和回收细胞内受损的细胞器和蛋白质(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B23"> 23</xgydF4y2Baref>]。它在退化性疾病的发病机制中发挥着关键作用(如骨关节炎和阿尔茨海默病)<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B24"> 24</xgydF4y2Baref>]。许等人发现自噬减毒老鼠的npc的分解代谢的影响(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B25"> 25</xgydF4y2Baref>]。因此,我们假设的抑制性和抗凋亡作用MSC-derived外来体也可能与自噬。</gydF4y2Bap> <p>LC3在自噬蛋白被认为是重要的。自噬的过程中,新合成的碳终端LC3由半胱氨酸蛋白酶水解生成LC3I。自噬过程的进展,LC3I共价结合磷脂酰乙醇胺形成LC3II ubiquitin-like反应催化的酶(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B23"> 23</xgydF4y2Baref>]。的比率LC3II / LC3I,自噬的最终产品,是与自噬的水平呈正相关。Beclin-1是第一个发现哺乳动物autophagy-related基因,这被认为是一个积极监管自噬分子(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B24"> 24</xgydF4y2Baref>]。因此,自噬的发生可以被检测的内容反映LC3II / LC3I和Beclin-1。通过测量使用RT-qPCR Beclin-1 mRNA表达,发现模型组中的表达明显高于对照组,而Beclin-1 mRNA表达进一步增加外来体组与模型组相比。也发现类似的结果在检测蛋白表达LC3II / LC3I和Beclin-1每组免疫印迹。LC3II / LC3I的蛋白表达和Beclin-1在模型组与对照组相比显著增加,而进一步增加表达式的外来体组与模型组相比。所有的结果表明,液能促进髓核细胞自噬。</gydF4y2Bap> <p>探讨凋亡之间的关系BMSC-Exo对髓核细胞自噬的影响,我们采用自噬通路抑制剂3-MA可以防止自噬小体的形成通过抑制磷酸肌醇3-kinase (PI3K),从而从根本上抑制自噬从源。我们检查了il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>信使rna抑制自噬使用后由RT-qPCR 3-MA,发现il - 1的表达<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>信使rna再次增加。然而,TNF -<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>和il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>浮在表面的内容在每个小组还发现,肿瘤坏死因子-<gydF4y2Baitalic> α</gydF4y2Baitalic>和il - 1<gydF4y2Baitalic> β</gydF4y2Baitalic>内容在自噬抑制组相比显著增加外来体组。所有结果表明液的抑制作用是扭转了自噬抑制后,表明液可能产生抑制炎症通过促进自噬的影响。流式细胞仪显示液能抑制细胞凋亡的髓核细胞由于有限合伙人,而细胞凋亡率增加后再使用3-MA抑制自噬。此外,我们研究原子核中幼粒细胞伯灵顿,Caspase-3裂解,通过免疫印迹和II型胶原蛋白。伯灵顿是调节细胞凋亡的一个重要因素,主要存在于细胞质中,介导下游凋亡分子的释放,引发细胞凋亡<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B26"> 26</xgydF4y2Baref>,<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B27"> 27</xgydF4y2Baref>]。伯灵顿表达式时可能发生细胞凋亡调节(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B28"> 28</xgydF4y2Baref>,<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B29"> 29日</xgydF4y2Baref>]。Caspase-3执行细胞凋亡的关键分子,作为一个激活的Caspase-3形式,形成裂解Caspase-3标志着不可逆的细胞凋亡(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.</xgydF4y2Baref>]。II型胶原蛋白是阀瓣的一个重要组成部分,是发现这个胶原蛋白在IDD盘明显减少患者(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B31"> 31日</xgydF4y2Baref>]。因此,II型胶原蛋白的表达在髓核细胞与退化的程度呈正相关。结果显示:裂解的表达Caspase-3,伯灵顿,II型胶原蛋白显著降低与对照组相比,模型组。与模型组相比,II型胶原蛋白的表达增加与裂解Caspase-3和伯灵顿外来体组明显减少。与外来体组相比,裂解Caspase-3和伯灵顿显示了明显的增加,和II型胶原蛋白显著减少自噬抑制组。在这个实验中,我们还研究了II型胶原蛋白的表达为每组RT-qPCR实验,结果表明,模型组的mRNA的表达与对照组相比显著降低,而mRNA的外来体组胶原蛋白mRNA表达显著增加与模型组相比,胶原蛋白的减少在自噬抑制组比外来体组。结果表明,液能抑制髓核细胞凋亡,但其凋亡的影响基本上是扭转了自噬抑制后,表明BMSC-Exo通过促进自噬可能产生凋亡的影响。</gydF4y2Bap> <p>大量研究表明,Akt-mTOR信号通路是一个重要的途径来调节各种细胞的生物功能(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B32"> 32</xgydF4y2Baref>- - - - - -<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B34"> 34</xgydF4y2Baref>),包括npc的生物功能的规定(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B35"> 35</xgydF4y2Baref>- - - - - -<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B37"> 37</xgydF4y2Baref>]。Akt-mTOR信号通路也参与各种人类退化性疾病的进展,包括髓核细胞的变性(<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B38"> 38</xgydF4y2Baref>]。作为一个典型的自噬信号通路,Akt-mTOR通路在自噬的规定显示了一个负面的作用。因此我们假设BMSC-Exo可能产生抗炎和抗凋亡的影响通过抑制Akt-mTOR信号促进髓核细胞的自噬。</gydF4y2Bap> <p>来证明这一假设,我们应用途径激活igf - 1在退行性髓核细胞外来体治疗后。我们检查了Akt-mTOR通路的激活免疫印迹检测phosphorylation-activated mTOR (p-mTOR)和phosphorylation-activated Akt (p-Akt)和调查LC3 / LC3I表达的变化以及自噬的激活。发现自噬蛋白LC3II / LC3I显著增加和通路蛋白p-mTOR p-Akt显示外来体组下降,而LC3II / LC3I autophagy-related蛋白的表达明显减少途径激活组和p-Akt p-mTOR蛋白的表达明显高于外来体组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M45"> <mml:mi> P</gydF4y2Bamml:mi> <mml:mo> <</gydF4y2Bamml:mo> <mml:mn> 0.05</gydF4y2Bamml:mn> </mml:math> </inline-formula>),这表明Akt-mTOR信号通路参与了exosome-regulated在髓核细胞自噬过程。</gydF4y2Bap> <p>综上所述,MSC-derived液减轻对LPS-induced凋亡细胞凋亡促进髓核细胞自噬,这是通过Akt-mTOR信号通路(图<xgydF4y2Baref rid="fig5" ref-type="fig"> 5</xgydF4y2Baref>)。本研究揭示了液减轻LPS-induced炎性损伤和细胞凋亡的可能机制,这将为IDD的治疗提供一个新的方向。然而,应该注意的是,所有的当前研究液仍处于基础研究阶段,还有许多问题需要解决。第一件事是,有一些人和动物之间的区别。其次,液不能批量生产,这也限制了他们的临床应用<xgydF4y2Baref ref-type="bibr" rid="B39"> 39</xgydF4y2Baref>]。另外,液隔绝biofluid是不洁净的和高度可变。此外,液的子集和对受体细胞的影响的具体机制仍缺乏定义。因此,尽管有一些成果与液治疗IDD,仍有很长的路要走,才能投入临床应用。相信随着研究的进步,治疗与液最终将成为新的碘缺乏症的临床治疗方案。</gydF4y2Bap> <fig id="fig5"> <label>图5</gydF4y2Balabel> <p>MSC-derived液减轻对LPS-induced凋亡细胞凋亡促进髓核细胞自噬,这是通过Akt-mTOR信号通路。</gydF4y2Bap> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2022/9896444.fig.005"></graphic> </fig> </sec> <back> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性</tgydF4y2Baitle> <p>使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。</gydF4y2Bap> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>的利益冲突</tgydF4y2Baitle> <p>作者宣称没有利益冲突。</gydF4y2Bap> </sec> <sec> <title>作者的贡献</tgydF4y2Baitle> <p>全,云腾,哲赵收集数据。关丽珍肖、吴Lungang和金龙小王进行了实验。全周、陈Sumei和哲赵分析数据和解释。云腾,徐Hongjun Lungang吴搜查了文学与图像处理完成。全周,全小哲赵写道。全周和全肖设计和研究资助。所有作者阅读和批准最终的手稿。全小哲赵,云腾的贡献同样这项工作。</gydF4y2Bap> </sec> <ack> <title>确认</tgydF4y2Baitle> <p>这项工作是支持的科研项目的江苏省卫生委员会(M2020103)和怀安自然科学研究计划(HAB201953)。</gydF4y2Bap> </ack> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Modic</gydF4y2Basurname> <given-names> m . T。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 罗斯</gydF4y2Basurname> <given-names> j·S。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 磁盘腰椎退行性疾病</一个rticle-title> <source> <italic> 放射学</gydF4y2Baitalic> <year> 2007年</gydF4y2Bayear> <volume> 245年</gydF4y2Bavolume> <issue> 1</gydF4y2Baissue> <fpage> 43</gydF4y2Bafpage> <lpage> 61年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1148 / radiol.2451051706</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 34548662684</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 17885180</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Pennicooke</gydF4y2Basurname> <given-names> B。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 守口</gydF4y2Basurname> <given-names> Y。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 侯赛因</gydF4y2Basurname> <given-names> 我。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Bonssar</gydF4y2Basurname> <given-names> l</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 哈特尔</gydF4y2Basurname> <given-names> R。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 退行性椎间盘疾病的生物治疗方法:临床试验回顾和未来的方向</一个rticle-title> <source> <italic> Cureus</gydF4y2Baitalic> <year> 2016年</gydF4y2Bayear> <volume> 8</gydF4y2Bavolume> <issue> 11条e892</gydF4y2Baissue> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.7759 / cureus.892</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 28018762</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B3" content-type="article"> <label>3</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 丁</gydF4y2Basurname> <given-names> F。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 邵</gydF4y2Basurname> <given-names> z W。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 熊</gydF4y2Basurname> <given-names> l . M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 在椎间盘变性细胞死亡</一个rticle-title> <source> <italic> 细胞凋亡</gydF4y2Baitalic> <year> 2013年</gydF4y2Bayear> <volume> 18</gydF4y2Bavolume> <issue> 7</gydF4y2Baissue> <fpage> 777年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 785年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1007 / s10495 - 013 - 0839 - 1</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84878708661</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 23512131</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B4" content-type="article"> <label>4</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 徐</gydF4y2Basurname> <given-names> G。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 梅</gydF4y2Basurname> <given-names> Q。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 周</gydF4y2Basurname> <given-names> D。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 吴</gydF4y2Basurname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 汉</gydF4y2Basurname> <given-names> l</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 维生素D受体基因和aggrecan基因多态性和椎间盘退化的风险——一个荟萃分析</一个rticle-title> <source> <italic> 《公共科学图书馆•综合》</gydF4y2Baitalic> <year> 2012年</gydF4y2Bayear> <volume> 7</gydF4y2Bavolume> <issue> 11条e50243</gydF4y2Baissue> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1371 / journal.pone.0050243</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84870358268</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B5" content-type="article"> <label>5</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 程ydF4y2Ba</surname> <given-names> j·W。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 倪</gydF4y2Basurname> <given-names> B . B。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 李</gydF4y2Basurname> <given-names> B。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 杨</gydF4y2Basurname> <given-names> y . H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 江</gydF4y2Basurname> <given-names> s D。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 江</gydF4y2Basurname> <given-names> l S。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 自噬和凋亡的反应在髓核细胞氧化应激:对椎间盘变性的影响</一个rticle-title> <source> <italic> 细胞生理学和生物化学</gydF4y2Baitalic> <year> 2014年</gydF4y2Bayear> <volume> 34</gydF4y2Bavolume> <issue> 4</gydF4y2Baissue> <fpage> 1175年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 1189年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1159 / 000366330</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84908610175</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 25277442</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B6" content-type="article"> <label>6</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 刘</gydF4y2Basurname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 余</gydF4y2Basurname> <given-names> P。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 戴</gydF4y2Basurname> <given-names> F。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 江</gydF4y2Basurname> <given-names> H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 马</gydF4y2Basurname> <given-names> Z。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 汉能减少氧化应激、细胞凋亡和细胞外基质降解,改善椎间盘变性诱导自噬</一个rticle-title> <source> <italic> 生物工程</gydF4y2Baitalic> <year> 2022年</gydF4y2Bayear> <volume> 13</gydF4y2Bavolume> <issue> 2</gydF4y2Baissue> <fpage> 3944年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 3957年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1080 / 21655979.2022.2031396</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 35109761</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B7" content-type="article"> <label>7</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 郑</gydF4y2Basurname> <given-names> Z。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 王</gydF4y2Basurname> <given-names> z G。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 程ydF4y2Ba</surname> <given-names> Y。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 程ydF4y2Ba</surname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 豪尔</gydF4y2Basurname> <given-names> 年代。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 李</gydF4y2Basurname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 他</gydF4y2Basurname> <given-names> Z。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 王</gydF4y2Basurname> <given-names> Q。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 张</gydF4y2Basurname> <given-names> H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 徐</gydF4y2Basurname> <given-names> K。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Fanghua</gydF4y2Basurname> <given-names> G。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 肖</gydF4y2Basurname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 王</gydF4y2Basurname> <given-names> X。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 亚精胺促进髓核自噬作为一种保护机制与细胞凋亡和改善椎间盘变性</一个rticle-title> <source> <italic> 细胞和分子医学杂志》上</gydF4y2Baitalic> <year> 2018年</gydF4y2Bayear> <volume> 22</gydF4y2Bavolume> <issue> 6</gydF4y2Baissue> <fpage> 3086年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 3096年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1111 / jcmm.13586</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 85044328553</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B8" content-type="article"> <label>8</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 全</gydF4y2Basurname> <given-names> M。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 在香港</gydF4y2Basurname> <given-names> m·W。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> Ko</gydF4y2Basurname> <given-names> m . 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Dharmalingam</一个rticle-title> <article-title> 蛋白质组学的签名在胎儿椎间盘髓核</一个rticle-title> <source> <italic> 亚洲脊柱日报》</gydF4y2Baitalic> <year> 2020年</gydF4y2Bayear> <volume> 14</gydF4y2Bavolume> <issue> 4</gydF4y2Baissue> <fpage> 409年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 420年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.31616 / asj.2019.0217</gydF4y2Bapub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B32" content-type="article"> <label>32</gydF4y2Balabel> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 徐</gydF4y2Basurname> <given-names> K。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 吴</gydF4y2Basurname> <given-names> F。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 徐</gydF4y2Basurname> <given-names> K。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 李</gydF4y2Basurname> <given-names> Z。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 魏</gydF4y2Basurname> <given-names> X。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 陆</gydF4y2Basurname> <given-names> Q。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 江</gydF4y2Basurname> <given-names> T。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 吴</gydF4y2Basurname> <given-names> F。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 徐</gydF4y2Basurname> <given-names> X。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 肖</gydF4y2Basurname> <given-names> J。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 程ydF4y2Ba</surname> <given-names> D。</ggydF4y2Baiven-names> </name> <name> <surname> 张</gydF4y2Basurname> <given-names> H。</ggydF4y2Baiven-names> </name> </person-group> <article-title> 硫氢化钠还原线粒体功能,抑制自噬信号通路激活PI3K / Akt / mTOR改善创伤性脑损伤后功能恢复</一个rticle-title> <source> <italic> Chemico-Biological交互</gydF4y2Baitalic> <year> 2018年</gydF4y2Bayear> <volume> 286年</gydF4y2Bavolume> <fpage> 96年</gydF4y2Bafpage> <lpage> 105年</gydF4y2Balpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1016 / j.cbi.2018.02.028</gydF4y2Bapub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - 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