SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2022/3674931 3674931 研究文章 能量代谢和Lipidome高度管制在牙科卵泡细胞的成骨分化 piel 奥利弗 1 贺南洪 马库斯 2 阿德尔 Sadiyeh 1 Reichert 托尔斯滕·E。 1 Liebisch 格哈德 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3580 - 5883 Morsczeck 基督教 1 小笠原群岛 渡边 1 口腔颌面外科 雷根斯堡大学医院 Franz-Josef-Strauss-Allee 11 93053年雷根斯堡 德国 uniklinikum-regensburg.de 2 临床化学和实验室医学研究所 雷根斯堡大学医院 Franz-Josef-Strauss-Allee 11 93053年雷根斯堡 德国 uniklinikum-regensburg.de 2022年 16 7 2022年 2022年 21 1 2022年 14 6 2022年 30. 6 2022年 16 7 2022年 2022年 版权©2022奥利弗piel et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

牙科卵泡细胞(dfc)牙周膜干细胞/祖细胞和肺泡造骨细胞。然而,对成骨分化的分子机制的理解,这需要细胞疗法,是分隔的。本研究旨在分析展开的成骨分化过程中能量代谢。人类展开培养,成骨分化诱导了地塞米松或骨形成蛋白2 (BMP2)。以前的微阵列数据再分析研究成骨诱导后监管的途径。表达和活性的代谢标记被免疫印迹分析和具体分析,评估相关的线粒体DNA是衡量实时定量聚合酶链反应,细胞是由谷胱甘肽的氧化状态分析,以及细胞的lipidome通过质谱(MS)分析。此外,成骨的标记进行了分析后的抑制脂肪酸合成5 - (tetradecyloxy) 2-furoic酸或C75。微阵列数据的通路富集分析表明碳代谢的调节通路成骨诱导后展开。进一步分析表明,酶参与糖酵解、三羧酸循环、线粒体活动,在分化和脂质代谢差异表达,与大多数标记调节更明显比BMP2与地塞米松诱导后。此外,细胞状态更氧化和线粒体DNA在下半年明显调节分化。 Besides, MS of the lipidome revealed higher lipid concentrations after osteogenic induction, with a preference for species with lower numbers of C-atoms and double bonds, which indicates a de novo synthesis of lipids. Concordantly, inhibition of fatty acid synthesis impeded the osteogenic differentiation of DFCs. This study demonstrates that energy metabolism is highly regulated during osteogenic differentiation of DFCs including changes in the lipidome suggesting enhanced de novo synthesis of lipids, which are required for the differentiation process.

 德意志Forschungsgemeinschaft 319390412 1。介绍

牙周疾病是一种常见的健康问题,会导致严重的组织损伤和牙齿脱落。基于生物组织工程和干细胞功能牙周组织的再生是一个有前途的方法( 1- - - - - - 3]。牙科卵泡细胞(dfc)牙周膜干细胞/祖细胞和引起牙槽骨、牙骨质、牙周韧带在牙齿发育。因此,展开适合干细胞治疗牙周疾病( 4, 5]。此外,他们可以很容易地分离提取智齿( 6]。然而,除了近年来的进展,功能组织细胞分化过程的分子机制为仍不够理解,阻碍其最佳使用靶向治疗( 5, 7]。

dfc的成骨分化通过刺激细胞可以在体外诱导与地塞米松或骨形成蛋白2 (BMP2)在其他[ 8, 9]。几项研究表明,这两个诱导目标不同的分子信号通路。例如,BMP2驱动器通过runt-related的表达分化转录因子2 (RUNX2)和distal-less同源框3 (DLX3),而dexamethasone-induced骨生成需要其他转录因子,如锌指和BTB domain-containing 16 (ZBTB16) [ 10- - - - - - 12]。然而,这两个分化过程也有相似之处就像古典亚型的蛋白激酶C (PKC)干扰与诱导骨生成 13]。除了特定的分子途径,只有重视了一般细胞新陈代谢的作用DFC分化。先前的研究显示,骨变化展开的敏感在活化蛋白激酶(AMPK)的活动 14),这是一个关键分子传感器细胞能量( 15]。可能有的,能量代谢可能起到关键作用成骨前体细胞的分化。骨骨髓来源间充质干细胞(msc)据报道,激活氧化磷酸化,但不是糖酵解,成骨诱导后( 16, 17),而缺氧抑制分化[ 18]。活性氧(ROS),这主要是由线粒体代谢生成,可以调节成骨分化[ 19]。线粒体活动进一步刺激成骨分化通过乙酰化作用 β连环蛋白( 20.]。以外,还细胞脂质代谢参与能量体内平衡和涉及几个分子途径激活PKC [ 21- - - - - - 23]。

为了进一步揭示背后的分子机制展开的成骨分化,本研究旨在分析能量代谢包括标记为糖酵解、三羧酸循环,氧化磷酸化,脂质代谢与地塞米松诱导分化后,BMP2。此外,lipidome区分dfc和脂肪酸合成的作用进行了分析。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养

人类牙齿卵泡细胞从AllCells购买(美国加利福尼亚州阿拉米达)和在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM)含10%胎牛血清(青霉素的边后卫)和1% (100 U /毫升)/链霉素(100 μg / ml)解决方案(所有Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)37°C和5%股份有限公司2在湿润的气氛。生长介质改变了三次一个星期。细胞直到8通道用于实验。

 2.2。成骨分化

诱导成骨分化,subconfluent dfc是处理成骨分化培养基组成的DMEM补充2%的边后卫,抗生素如上所述,20毫米玫瑰,10毫米 β甘油磷酸盐,100 μM phospho-ascorbic酸,100 nM地塞米松(所有Sigma-Aldrich),或与BMP2分化培养基含有50 ng / ml BMP2 (Biomol,汉堡,德国)地塞米松。同时控制,细胞在DMEM培养上述2%的边后卫和抗生素。微分媒体改变了两次一个星期。

 2.3。微阵列分析转录组

公开的微阵列数据(GSE20963)被用于分析。包括基因表达谱的数据处理的展开不同的成骨诱导物包括地塞米松和BMP2七天而为每组控制媒介生物一式三份。数据处理(如前所述 24]。基因表达数据处理被用来寻找调节成骨诱导后的基因:基因选择了——或者至少使之抑制因子2, p 在学生的价值低于0.05 t 以及地塞米松和BMP2。选择基因的列表可以在补充表 1。之后,与所选择的基因通路富集分析与大卫生物信息学资源( 25, 26)使用KEGG(京都基因和基因组的百科全书)通路数据库( 27- - - - - - 29日]。一个 p 价值决定与轻松得分,和途径 p 值显著低于0.05被认为是解决。

 2.4。免疫印迹分析

dfc是细胞溶解和刮在一个缓冲区组成的20毫米trisHCl (pH值8.0),137毫米氯化钠,48毫米氟化钠,1% ( v / v )NP-40, 10% ( v / v Na)甘油,2毫米3签证官4鸡尾酒,磷酸酶抑制剂3 (Sigma-Aldrich),并完成™迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1平板在10毫升,Sigma-Aldrich)在H2o .上层清液离心后收集在14000 rpm溶解产物5分钟在4°C,和蛋白质浓度测定皮尔斯™BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。随后,溶解产物混合Laemmli样品缓冲(美国BIO-RAD大力神,CA)煮沸5分钟前在95°C。样本加载到一个4 - 15% Mini-PROTEAN®TXG StainFree™蛋白质凝胶(BIO-RAD)和蛋白质分离的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。在紫外光激活后,蛋白质被转移到Amersham Protran®0.2 μm硝化纤维素膜(Sigma-Aldrich)使用Trans-Blot®SD半干转移细胞或Trans-Blot®涡轮™传输系统(BIO-RAD)。车道总蛋白质的照片拍摄与ChemiDoc™触摸成像系统(BIO-RAD)。膜被洗在Tris-buffered盐水(TBS) 5分钟前阻止5%牛血清白蛋白(BSA) Tween-containing TBS (TBST)在室温下1小时。随后,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C主要抗体低氧诱导因子1α(HIF-1 α),细胞色素c, prohibitin 1,细胞色素c氧化酶亚基4考克斯(IV),丙酮酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶复合体亚基(SDHA),热休克蛋白60 (HSP60),压敏电阻器阴离子通道(VDAC)、己糖激酶,己糖激酶二世,磷酸果糖激酶,glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH),丙酮酸激酶M1/2,丙酮酸激酶平方米,乳酸脱氢酶,顺乌头酸酶2,异柠檬酸脱氢酶1,异柠檬酸脱氢酶2,dihydrolipoamide succinyltransferase (DLST)、延胡索酸酶,citrase合酶、线粒体丙酮酸载体1,线粒体丙酮酸载体2乙酰辅酶A羧化酶,phospho-acetyl-CoA羧化酶(Ser79)、atp柠檬酸裂解酶,phospho-ATP-citrate裂合酶(Ser455)、乙酰辅酶A合成酶,酰coa合成酶,脂肪酸合酶(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),或伸长的长链脂肪酸蛋白6 (ELOVL6) (Abcam,剑桥,英国)。主要的抗体都是稀释1:1000年TBST BSA为5%。之后,膜被洗了三次TBST 10分钟,在孵化前在二级抗体辣根过氧化物酶,(合)与anti-rabbit免疫球蛋白(细胞信号技术),在TBST稀释1:1000年5%的脱脂奶粉1小时在室温下。于是,膜清洗两次TBST 10分钟,一次磷酸盐(PBS)至少5分钟,一旦在TBS 5分钟,在一个化学发光信号是由使用清晰™西方ECL衬底(BIO-RAD)和记录ChemiDoc™触摸成像系统(BIO-RAD)。光密度定量进行软件版本6.0.1中图像实验室(BIO-RAD)与蛋白质乐队总巷正常化和对照组。

 2.5。L-Lactate化验

糖酵解细胞分析工具包(开曼化学,安阿伯市,美国)根据制造商的使用手册。短暂,展开与200年96孔细胞培养板 μl中每口井的离心机,20 μl的上层清液用于确定l-lactate的数量在一个比色反应,这是衡量spectrophotometrically OD = 490年 纳米 。

 2.6。己糖激酶活性测定

己糖激酶的比色测定试剂盒(Sigma-Aldrich)是根据制造商的指示使用。短暂,展开用PBS洗净,刮在分析缓冲区的装备,和离心机。上层清液进一步用于确定己糖激酶活动在一个比色反应,这是衡量spectrophotometrically OD = 450年 纳米 在动力模式。

 2.7。苹果酸脱氢酶活性测定

苹果酸脱氢酶活性测定工具包(Abcam)使用手册根据制造商的协议。简单地说,细胞被洗PBS和刮试验装备的缓冲区。离心后,上清液被用来确定苹果酸脱氢酶比色反应活动,这是衡量spectrophotometrically OD = 450年 纳米 在动力模式。

 2.8。复杂的我活动分析

线粒体分离与培养细胞的线粒体隔离工具展开(Abcam)根据制造商的指示。之后,我复杂的酶活性微型板块分析工具包(Abcam)是用来确定复杂我活动后,制造商的协议小册子。简而言之,从孤立的线粒体蛋白质提取使用的洗涤剂溶液工具包,装上微型板块预镀复杂我抗体。3小时后孵化,微型板块洗井,在分析解决方案添加装备是为了启动一个比色反应,这是衡量spectrophotometrically OD = 450年 纳米 在动力模式。

 2.9。实时定量聚合酶链反应(qPCR)

的QIAamp®DNA迷你包(试剂盒、希尔登,德国)被用来分离DNA展开。为此,“培养细胞的协议”的制造商的使用手册。胰蛋白酶化和刮都应用于分离的贴壁细胞文化板块。的qPCR分析SsoAdvanced™普遍SYBR绿色Supermix (BIO-RAD)和引物对线粒体DNA(正向引物:5 ′ -GCCTTCCCCCGTAAATGATA-3 ′ 反向引物:5 ′ -TTATGCGATTACCGGGCTCT-3 ′ )或B2M(正向引物:5 ′ -TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3 ′ 反向引物:5 ′ -TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT-3 ′ )作为参考基因组DNA。qPCR是运行在一个StepOnePlus™实时PCR系统(热费希尔科学)以下协议:聚合酶激活在95°C 2分钟,然后40周期每个组成的变性步骤15秒95°C,和一个退火30秒/伸长一步在62°C,然后融化曲线分析(扩增子控制)从95°C,持续15秒,然后在60°C 1分钟后温度升高在0.3°C的步骤为每个15秒到95°C。线粒体DNA的数量是规范化B2M基因组DNA的数量和对照组在第一天使用 ΔΔCt方法( 30.]。qPCR协议包括贝和Halberg采用引物序列 31日]。

 2.10。谷胱甘肽测定

谷胱甘肽/ GSSG-Glo™试验设备(WI Promega,麦迪逊,美国)是按照制造商的指示使用来确定相对大量的氧化和减少谷胱甘肽在展开。简单地说,细胞被洗PBS和细胞溶解在谷胱甘肽裂解试剂氧化或工具进行分析的总谷胱甘肽。谷胱甘肽的量量化使用荧光素酶报告系统。对于每一个实验组,三个生物复制用于测定氧化和总谷胱甘肽,分别。从总谷胱甘肽的氧化,这是作为氧化应激的指标,是对照组的规范化。

 2.11。Lipidome质谱分析(MS)

dfc与PBS和刮洗0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)和完成™迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1平板在5毫升,Sigma-Aldrich)在H2o .溶解产物中蛋白质浓度测定与皮尔斯™BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学)。样本储存在-80°C到分析。细胞匀浆受到脂质提取据布莱和戴尔的方法 32]的存在不是天然脂质物种内部标准。下面的脂质物种作为内部标准:添加电脑14:0/14:0,PC 22: 0/22: 0, PE 14: 0/14: 0, PE 20: 0/20: 0 (diphytanoyl), PS 14: 0/14: 0, PS 20: 0/20: 0 (diphytanoyl),π17:0/17:0,LPC的13:0,LPC的19:0,简述13:0,Cer d18:1/14: 0, Cer d18: 1/17: 0, D7-FC, CE 17: 0, CE 22: 0, TG 51: 0, TG 57: 0, DG 28: 0,和DG 40: 0。氯仿相被移液恢复机器人(Tecan创世纪负责150)和真空干燥。残留在10毫米醋酸铵溶解在氯仿/甲醇(3:1, v / v )(低质量分辨率串联质谱)或氯仿/甲醇/丙胺(1:2:4 v / v / v )与7.5毫米甲酸铵(高分辨率质谱)。

质谱分析脂质是由直接流动注射分析(FIA)使用三重四极质谱仪(FIA-MS /女士;回调三重四极)和混合quadrupole-Orbitrap质谱仪(FIA-FTMS;高质量分辨率)。

FIA-MS / MS(回调)是表现在正离子模式下使用先前描述的分析设置和策略( 33]。的碎片离子 米 / z 184年用于lysophosphatidylcholine (LPC) [ 34]。以下中性损失应用:磷脂酰乙醇胺(PE) 141年,磷脂酰丝氨酸(PS) 185年,phosphatidylglycerol (PG) 189年,和磷脂酰肌醇(PI) 277 35]。PE-based缩醛磷脂(PE P)分析了根据Zemski贝瑞和墨菲(描述的原则 36]。Sphingosine-based神经酰胺(Cer)和hexosylceramides (HexCer)使用的碎片离子进行了分析 米 / z 264年( 37]。量化是通过校准线所产生的天然脂质物种各自的样本矩阵。校准线生成下列天然物种:PC 34: 1, 36: 2, 38: 4, 40: 0,和PC O-16: 0/20: 4;SM 18: 1;O2/16: 0, 18: 1, 18: 0;LPC的16:0,18:1,18:0;38岁的PE 34: 1、36: 2: 4,和40:6;PE第16页:0/20:4;38岁的PS 34: 1、36: 2: 4,和40:6;Cer 18: 1; O2/16 : 0, 18 : 0, 20 : 0, 24 : 1, 24 : 0; and FC, CE 16 : 0, 18 : 2, 18 : 1, and 18 : 0.

傅里叶变换质谱(FIA-FTMS)设置详细描述霍瑞et al。 38]。甘油三酯(TG)、双甘酯(DG)和胆甾醇酯(CE)记录在正离子模式下英尺分的范围内 米 / z 500 - 1000年为1分钟,最大注射时间(200毫秒),自动增益控制(AGC)的 1 × 10 6 三个微扫描,分辨率为140000(在一个目标 米 / z 200)。磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)测定在负离子模式下质量范围 米 / z 520 - 960。多路采集(MSX)是用于[M + NH4]+免费的胆固醇(FC) ( 米 / z 404.39)和D7-cholesterol ( 米 / z 411.43)0.5分钟采集一次,规范化的碰撞能量的10%,它的100毫秒,AGC 1 × 10 5 、隔离窗1 Da,目标分辨率为140000 ( 39]。数据处理细节描述霍瑞et al。 38)使用亚历克斯软件( 40其中包括赋值和峰值强度选择。提取的数据导出到Microsoft Excel 2016和进一步处理能够宏。FIA-FTMS量化是由乘法的上升与analyte-to-IS数量比例。

脂质物种被注释根据最新提议的脂质结构的简化符号来源于质谱( 41]。回调glycerophospholipid物种,甚至注释的假设是基于碳链只有编号。浓度数据的补充文件。

 2.12。抑制脂肪酸合成

为了分析脂肪酸合成的作用在成骨分化,展开服用5 μg / ml脂肪酸合成抑制剂C75或5 - (tetradecyloxy) 2-furoic酸(TOFA, Sigma-Aldrich)分化或控制媒体。相应的介质为0.05% ( v / v )DMSO作为车辆控制。

 2.13。反向Transcription-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)

的RNeasy®+迷你包(试剂盒)被用来隔离RNA从展开。浓度和纯度的RNA进行了分析使用NanoDrop™2000分光光度计(热费希尔科学)。接下来,iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(BIO-RAD)被用来mRNA转化为互补脱氧核糖核酸(逆转录)。qPCR分析与SsoAdvanced™通用探针Supermix (BIO-RAD)和probe-containing PrimePCR™引物(BIO-RAD)对GAPDH RUNX2,和COL1A2(胶原蛋白1型α2链)StepOnePlus™实时PCR系统(热费希尔科学)以下协议:2分钟聚合酶激活在95°C,那么40 5秒的周期变性在95°C,和30秒退火/伸长60°C。目标基因表达是归一化的表达GAPDH和DMEM组使用 ΔΔCt方法( 30.]。

 2.14。碱性磷酸酶(ALP)活性测定

检查高山活动展开,细胞与PBS和细胞溶解洗Triton-X在PBS (0.1%)。溶菌产物的一部分是用移液器吸取新鲜的96孔板为了测量使用皮尔斯™BCA蛋白质的蛋白质浓度测定工具包(热费希尔科学)。此外,p-nitrophenylphosphate (Sigma-Aldrich)添加到剩下的溶解产物,然后孵化在37°C 60分钟。此后,立即转换成黄色p-nitrophenol spectrophotometrically在量化 OD = 415年 纳米 。高山活动值归一化每个样本的总蛋白和DMEM对照组。

 2.15。茜素红染色

分析了矿化的细胞外基质茜素红染色。细胞用PBS和4%福尔马林固定。随后,细胞被洗与H2阿三次,沾染了茜素红溶液(美国默克密理博,Billerica的)20分钟,再洗与H2阿三次。显微照片然后被溶解茜素红染色是量化晶体中的氯化十六烷吡啶在PBS(10%)和测量spectrophotometrically OD = 595年 纳米 。获得的值归一化到DMEM对照组。

 2.16。统计分析

实验在生物一式三份,除非另有说明。学生的 t 以及和单向方差分析(方差分析)与软件SPSS进行版本25(美国、IBM、纽约Armonk)图中所描述的传说。 p 值 < 0.05 被认为是统计学意义并贴上示图传说。

 3所示。结果 3.1。碳代谢中起着重要作用在成骨分化展开

旨在进一步解开骨背后的分子机制展开,前微阵列数据进行再分析。KEGG通路分析后确定通路显著监管与BMP2成骨的感应与地塞米松和感应。在蛋白质的生物合成和代谢通路相关,碳代谢显著(表来解决 1),这证实了能量代谢中起着重要作用在骨生成。

通路富集分析显著受地塞米松和BMP2基因。

KEGG通路 %的调控基因 p 价值
氨基酸的生物合成 6.8 3.43 E − 07年
甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 4.5 3.12 E − 05年
生物合成的抗生素 7.5 1.70 E − 04
氨酰生物合成 3所示。8 3.57 E − 03
碳代谢 4.5 4.41 E − 03
蛋白质的消化和吸收 3所示。8 9.86 E − 03
精氨酸生物合成 2。3 1.54 E − 02
丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 2。3 4.40 E − 02
3.2。糖酵解和三羧酸循环调节成骨分化期间展开

因此,我们调查了信号通路参与碳代谢与能量代谢密切相关的细胞,更准确地说。从糖酵解,我们分析最重要的酶的表达,免疫印迹分析(图 1(一)、上部和补充表 2)。己糖激酶的蛋白质表达我己糖激酶二磷酸果糖激酶,和乳酸脱氢酶与地塞米松调节成骨诱导后更明显,除了乳酸脱氢酶,由BMP2更多的调节。相比之下,GAPDH和丙酮酸激酶表达相当一致。此外,生产L-lactate(图的数量 1 (b)(图)和己糖激酶活动 1 (c))在成骨分化明显增强,这又与地塞米松更加明显。此外,后续的柠檬酸循环的酶检查(图 1(一)下部和补充表 2)。顺乌头酸酶的免疫印迹分析表明,表达式2,异柠檬酸脱氢酶2,DLST,延胡索酸酶,柠檬酸合成酶调节骨生成的后期。相比之下,酶异柠檬酸脱氢酶1,线粒体丙酮酸载体1,线粒体丙酮酸载体2表示相当一致。除了柠檬酸循环标记的蛋白表达,苹果酸脱氢酶的活性显著调节在成骨分化,更高的增加与地塞米松诱导后(图 1 (d))。

糖酵解和三羧酸循环标记的表达成骨分化期间展开。在成骨分化培养基培养(一)展开(ODM), BMP2分化培养基,或控制介质(DMEM), 7、14、28天前糖酵解标记己糖激酶的蛋白质表达我,己糖激酶二世,磷酸果糖激酶,glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH),丙酮酸激酶M1/2,丙酮酸激酶M2,乳酸脱氢酶和蛋白质的表达柠檬酸循环标记顺乌头酸酶2,异柠檬酸脱氢酶1,异柠檬酸脱氢酶2,dihydrolipoamide succinyltransferase (DLST)、延胡索酸酶,citrase合酶、线粒体丙酮酸载体1,线粒体丙酮酸载体2测定免疫印迹分析。量化结果和统计分析补充表所示 2。在成骨分化培养基培养(罪犯)展开(ODM), BMP2分化培养基,或控制介质(DMEM)七天之前的数量产生L-lactate (b)和己糖激酶活性(c)测定糖酵解的标志和苹果酸脱氢酶活性测定(d)柠檬酸循环的标志。结果显示为 意味着 + 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基介质。 ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 3.3。线粒体代谢是高度管制在分化

随后,我们调查的规定展开的线粒体在成骨分化标记(图 2)。我们发现蛋白质表达的细胞色素c,丙酮酸脱氢酶,SDHA明显调节,而HSP60略的表达和不显著调节,prohibitin 1的表达和VDAC与地塞米松诱导后表达下调。相比之下,这些标记是监管较少,甚至下调后BMP2感应到第14天,细胞色素c的表达,prohibitin 1, SDHA显著调节至28天。此外,第四考克斯的蛋白表达下调后七天,调节在稍后的时间点与成骨诱导物(图 2(一个)和补充表 2)。此外,复杂的我展开的活动是增强成骨分化后7天,但只有与地塞米松治疗显著(图 2 (b))。dfc的相对数量的线粒体DNA是监管与考克斯IV表达:在1至7天内分化,相对的线粒体DNA量显著降低,而显著调节与诱导物(图14天、28天的评分 2 (c))。此外,HIF-1的蛋白表达 α根本抑制调查时间点(图 2 (d)),这表明更多的氧物种存在于细胞。认识提高,更高比例的氧化谷胱甘肽在展开成骨诱导后7天(图 2 (e)),这表明更高的氧化应激。

评价dfc的线粒体代谢在成骨分化。在成骨分化培养基培养(一)展开(ODM), BMP2分化培养基,或控制介质(DMEM), 7、14、28天前蛋白表达的细胞色素c, prohibitin 1,细胞色素c氧化酶亚基4考克斯(IV),丙酮酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶复合体亚基(SDHA),热休克蛋白60 (HSP60),压敏电阻器阴离子通道(VDAC)是由免疫印迹分析。量化结果和统计分析补充表所示 2。在成骨分化培养基培养(b)展开(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM)复杂的前七天我活动确定了孤立的线粒体。(c, d)展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化培养基,或控制介质(DMEM) 1、7、14、28天前相对于基因组DNA线粒体DNA的数量是衡量qPCR HIF-1分析(c)和蛋白表达 α是由免疫印迹分析( n = 1 ,d)。在成骨分化培养基培养(e)展开(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM)七天。从总谷胱甘肽氧化谷胱甘肽的量测量作为氧化应激的指标。结果显示为 意味着 + 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基中同时点(b, c, e)。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 3.4。脂质代谢调控成骨分化期间展开

接下来,我们探讨了脂质代谢的另一个主要类型的碳基分子细胞。最初,参与脂类代谢相关酶的表达是通过免疫印迹分析(图分析 3和补充表 2)。结果显示软弱不是significant-upregulation atp柠檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶和重大upregulation acetyl-CoA-synthetase的成骨诱导物。然而,表达磷酸化atp柠檬酸裂解酶只有调节地塞米松和tendentially BMP2表达下调,这表明更高的酶激活状态dexamethasone-treated展开[ 42]。此外,乙酰辅酶a羧化酶的表达减少14天、28天,虽然没有明显的upregulation Ser79观察磷酸化在稍后的时间点。相反,Ser79-phosphorylated乙酰辅酶a羧化酶是由地塞米松调节到第14天,但是不明显,这是一个指标,抑制这种酶( 43]。在28天,几乎没有磷酸化乙酰辅酶a羧化酶被发现在任何样品。此外,表达ELOVL6显著增加在所有文化媒体直到28天,控制DMEM培养基中最明显,而在分化酰coa合成酶的表达是不变的。接下来我们分析了lipidome区分dfc的概述,女士的总和与脂质略enhanced-more明显dexamethasone-during骨从第七天(图 4(一))。然而,一些特殊的脂类是比其他人更规范。分析膜的比例最丰富的类脂质透露,尤其是磷脂酰乙醇胺的比例(PE)在分化(图不同 4 (b))。此外,磷脂酰胆碱(PC)显示类似的监管模式,但不明显(图 4 (c))。有趣的是,PE和PC的分数显著降低在第14天ODM-treated细胞相比,7天、28天的评分。此外,比例的磷脂酰肌醇(PI)期间不断调节成骨分化从第七天(图 4 (d))。除此之外,脂质类磷脂酰丝氨酸(PS), PE-based缩醛磷脂(PE P), PC-ethers阿(PC),鞘磷脂(SM)和自由胆固醇(FC)监管较少(数字 4 (e)- - - - - - 4(我))。监管模式的丰富脂质类补充图所示 S1。

脂质代谢标志物的表达在成骨分化的展开。展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM), 7、14、28天前蛋白的乙酰辅酶a羧化酶的表达,phospho-acetyl-CoA羧化酶、atp柠檬酸裂解酶,phospho-ATP-citrate裂合酶,乙酰辅酶a合成酶,酰coa合成酶,脂肪酸合成酶,伸长的长链脂肪酸蛋白6 (ELOVL6)是由免疫印迹分析。量化结果和统计分析补充表所示 2。

调节膜脂质在成骨分化的展开。展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM), 7、14和28天前分析了lipidome女士这图显示了监管的总脂质(a)和磷脂酰乙醇胺的分数(PE、b),磷脂酰胆碱(PC, c)、磷脂酰肌醇(PI, d)、磷脂酰丝氨酸(PS, e), phosphatidylethanolamine-based缩醛磷脂(PE P f), phosphatidylcholine-ethers (PC O g)、鞘磷脂(SM, h)和自由胆固醇(FC,我)。数据点显示 意味着 ± 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基中在同一时间点。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。星号与分化培养基相同颜色的数据点和线。

 3.5。的复合脂质物种在成骨分化过程中被改变了

为了分析脂质更详细的规定,我们调查的组成PEs-as高度管制膜在制作成骨分化,发现一个异构的监管PEs和不同数量的碳原子双键(图 5)。虽然几乎没有被发现在第一天(数据变化 5(一个)和 5 (e)),脂质物种高度管制在7天:PEs和32岁的34和36个碳原子和一个,两个,三个双键是明显的调节,这是伴随着减少栓塞形成后症状(PEs)的40个碳原子和多不饱和PEs和四、五或六个双键(数字 5 (b)和 5 (f))。相同的监管模式是可观测的14天(数字 5 (c)和 5 (g))。更准确地说,PE物种32:1、34:1,34:2,36:2,36:3,38:2,和38:3调节在天7和14和PE 40: 3只在14天,而物种38:6,40:5,和40:6在这两天表达下调7和14,PE 36: 1, 38: 1,和40:4只在第七天,和PE 38: 4和38:5只在第14天(补充图 S2)。值得注意的是,这些变化通常是在dexamethasone-induced展开比较与BMP2成骨的感应。在28天,PE物种的组成dexamethasone-induced细胞类似于天7和14日,唯一的区别是PEs和调节另外38个碳原子。在BMP2-treated展开,PEs 38个碳原子也升高,以及PEs和两个、三个或四个双键,而物种与40个碳原子和五六个双键在28天表达下调(数字 5 (d)和 5 (h))。

磷脂酰乙醇胺的监管与不同数量的碳原子和双键在成骨分化的展开。展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM), 7、14和28天前分析了lipidome女士这个数字显示调节磷脂酰乙醇胺(PE)与不同碳原子数在第一天(a),第七天(b),第14天(c)和28天(d),并与不同数量的PEs双键(DB)在第一天(e),第七天(f),一天14 (g), 28天(h),结果显示为 意味着 + 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基中在同一时间点。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。星号与分化培养基与酒吧在同样的颜色。

 3.6。贮存脂质和甘油二酯是高度管制的成骨分化期间展开

此外,我们调查的规定储存脂质和甘油二酯(DG),因为DGs前体为甘油三酯(TG)和glycerophospholipids成骨分化过程中展开(图 6)。DGs最初相比下降的比例控制在第一天中,虽然它在后来的时间点稳步增加,在dexamethasone-treated细胞(图更明显 6(一))。对于甘油三酯的规定,减少与控制中可观测后,即在第七天,同时调节在14天、28天,除了dexamethasone-treated展开,在TGs的比例下降至28天(图 6 (b))。相比之下,胆甾醇酯(CE)不断下调而控制媒介从成骨诱导后第七天(图 6 (c))。DG分数是高度增加dexamethasone-treated展开,我们调查了DG物种配置文件在不同时间点的细节(图 6 (d))。结果表明,单不饱和DGs 34和36个碳原子是最丰富的物种在天1和7,而多不饱和DGs 38个碳原子是显性的,14天、28天的评分。我们还观察到的物种TGs dexamethasone-treated细胞和认识提高发现更多物种数量较低的碳原子和双键在更早的时间点,而多不饱和种类更多的碳原子在14天、28天的评分(图更加丰富 6 (e))。

贮存脂质和甘油二酯的监管在成骨分化展开。展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM), 7、14和28天前分析了lipidome女士(a - c)的线图表显示分数甘油二酯(DG,)、甘油三酯(TG), b),和胆甾醇酯(CE、c)。数据点显示 意味着 ± 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基中在同一时间点。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。星号与分化培养基相同颜色的数据点和线。(d, e)此外,DG物种(d)的构成和TG物种(e)在不同时间点细胞治疗ODM。只有物种丰富的超过2%的至少一个时间点显示为 意味着 + 标准 偏差 ,单向方差分析进行确定显著差异的一部分特定的物种在不同的时间点。 ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 3.7。抑制脂肪酸合成阻碍dfc的成骨分化

作为脂质浓度升高成骨诱导后,进行了进一步的实验调查脂肪酸合成的作用展开的成骨分化。细胞治疗与TOFA或C75,作为脂肪酸合成的抑制剂通过抑制酶乙酰辅酶a羧化酶或脂肪酸合酶,分别为( 44- - - - - - 46]。治疗dfc TOFA导致更高的乙酰辅酶a羧化酶的磷酸化,这表明失活的酶 43),而C75治疗减少脂肪酸合成酶(补充图的表达 S3)。后续分析成骨的标记显示,基因表达的COL1A2高山活动和茜素红染色减少抑制剂治疗后,更加明显,在与TOFA显著(数字 7(一), 7 (c), 7 (d))。然而,基因表达RUNX2只是减少脂肪酸合成抑制DMEM控制介质,而不变的,甚至高分化媒体(图 7 (b))。

监管的成骨分化抑制脂肪酸合成后展开。展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM)和同时处理5 μg / ml脂肪酸合成抑制剂TOFA C75或车辆控制不同时期之前评估的成骨分化标记:(a, b)基因的表达COL1A2 (a)和RUNX2 (b)相对GAPDH基因表达被RT-qPCR决定三天治疗后。(c)的碱性磷酸酶(ALP)相对于总蛋白测定后七天治疗。(d)矿化的细胞外基质是由茜素红染色后28天的治疗。染色的摄影图片所示的条形图显示了相对量化结果 意味着 + 标准 偏差 。学生的 t 测试进行了比较与车辆控制抑制剂治疗。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。

 4所示。讨论

这项研究的结果表明,能量代谢是高度管制成骨诱导后展开。与先前的研究结果报告,只有氧化磷酸化和糖酵解是调节( 16),我们的实验显示,归纳的一些糖酵解标记。据推测,糖酵解骨生成的能源生产不是可有可无的。认识提高,先前的研究表明,miR-34a抑制成骨分化的差别的msc对这些乳酸脱氢酶( 47),调节骨中展开。尽管如此,线粒体标记也在展开和分析规范的线粒体DNA拷贝数显示高upregulation下半年的分化过程。这是伴随着HIF-1抑制 α表达和氧化细胞状态。Downregulation HIF-1的 α也被报道在来源于msc的骨的成骨分化,而HIF-1复活 α抑制氧化磷酸化( 16]。有趣的是,HIF-1抑制 α成骨诱导后表达发生直接展开,而线粒体DNA甚至下调1和7在天。可能,其他的分子机制是重要的诱导分化,而充足的能源供应和氧化磷酸化活动是必要的在后期不成熟的成骨细胞导致生物矿化的细胞外基质。然而,更高的能源需求可能不是在骨增强线粒体活动的唯一目的,因为一项研究报道,抑制氧化磷酸化确实可以补偿由糖酵解,保持ATP水平,但仍然阻碍成骨分化( 20.]。反对这一发现,诱导pseudohypoxia增强PDL细胞的增殖和成骨分化,同时将能量代谢从氧化磷酸化,糖酵解( 48]。因此,糖酵解代谢不一定是阻碍分化有关。Upregulation线粒体活动的进一步报道取决于一种蛋白激酶( 49),这是高度管制在展开[骨生成 13]。结果表明,线粒体upregulation扮演了一个关键的和多样化的角色在成骨分化的分子发条和能量代谢影响骨生成更多的尊重比只有ATP供应。

结果进一步揭示了地塞米松和BMP2感应之间的差异。关于线粒体标记,值得注意的是,诚然都诱发导致upregulation线粒体DNA拷贝数从14天,但移植不同的蛋白质地塞米松主要增强的细胞色素c和丙酮酸脱氢酶的表达,而BMP2诱导prohibitin 1的表达。碳代谢的差异比较成骨的感应与地塞米松或BMP2也发现在msc ( 50]。观察加强两抗病诱导剂的假设导致同一outcome-upregulation线粒体活动,更多的氧化状态,抑制HIF-1 α矩阵mineralization-but函数,最后通过调节不同的蛋白和信号通路,在将来的研究中值得进一步探讨的。

有关脂类代谢酶分析也显示出较高的监管与诱导物包括upregulation成骨诱导后的脂肪酸代谢的重要标记。这是符合的女士分析lipidome同时显示高脂质浓度。总的来说,监管lipidome相似与成骨的诱导物,虽然在dexamethasone-treated dfc的表达相关酶和脂质高的浓度。这是非常有趣的关于先前的观察,dexamethasone-induced矿化更强烈而BMP2-treated展开[ 13]。转录因子ZBTB16的表达式是高度引起地塞米松( 11),对这种差异可能扮演一个角色,因为这还与能量代谢有关( 51]。兔子msc可能进一步研究表明,lipidome在成骨分化的前体细胞和变化,此外,lipidomes相似的细胞不同的起源 52]。这意味着骨生成的脂类代谢的基本作用。详细分析与PE物种的例子表明,特别是物种的碳原子,直到36-which主要对应于PEs和两个脂肪酸与每个18 C-atoms-and更高饱和度增加在第七天,这表明从头合成的主要来源是血脂水平升高。认识提高,PE物种与碳原子数,直到38和更多的双键被发现直到28天,假设链伸长和稀释后的合成。这种假设是根据观察ELOVL6的表达,这是众所周知的,拉长脂肪酸高达16个碳原子与18碳原子(物种 53),随着时间的推移增加。

最终,抑制脂肪酸合成的差别导致了对这些研究成骨的标记。尤其是COL1A2基因表达、高山活动和茜素红染色影响细胞外基质生产和矿化的重要标志。此外,基因表达RUNX2的影响较小。有趣的是,高山活动和RUNX2表达式几乎在媒体分化调节与控制中。这意味着使用的展开我们的研究已经表现出较高的基底的这些标记物的表达,这可能是与高成骨的潜力。因此,进一步RUNX2的监管和高山可能不需要驱动分化过程。然而,随着抑制脂肪酸合成阻碍矿化而不是RUNX2表达式,骨生成的脂类代谢的相关性可能不是RUNX2连接。相反,从头合成的脂肪酸和脂质是osteogenically诱导的大概所需的适当的函数展开努力生产组织。在真核细胞脂肪酸合成发生在细胞质和线粒体( 54]。因此,增强线粒体活动可能在分化脂肪生成的一个重要驱动力。

生物矿化的确切作用增强脂质生产仍然难以捉摸的矿化过程和可能有不同的功能。为主,细胞可能会使用脂肪酸作为能量来源,也是报告的一项研究[ 55]。这是进一步支持的事实,从第七天DGs的分数高,作为中间产品,并最终在第14天TGs的作用主要是定义为能量储存( 56]。认识提高,DG物种32:0,32:1,和34:1-presumably由于新创synthesis-showed山峰在第七天dexamethasone-induced分化。然而,DG物种38:3和38:4和TG物种56:5和56:6高度诱导在14天、28天的评分。据推测,upregulation多不饱和种类发生由于吸收以提高细胞培养基的能源资源。

有趣的是,DGs在第一天是低浓度微分媒体相比,控制媒体。随着DGs的古典PKC激活的重要辅助因子( 57),抑制成骨分化展开的 13DGs成骨诱导后的差别),对这些阻碍PKC激活可能是重要的。此外,值得注意的是,胆甾醇酯是唯一的脂质类严格表达下调在分化而来控制媒体。相比之下,自由胆固醇的比例一直很高。保持一个稳定的自由胆固醇水平分化过程中可能扮演另一个关键的角色。先前的研究表明,oxysterols-oxidized衍生品cholesterol-support成骨分化的干细胞和抵消负面影响氧化应激( 58, 59]。因此,大量的自由胆固醇与增强线粒体活动可能是一个重要的机制来支持dfc的成骨分化。线粒体活动更自由胆固醇氧化细胞状态和upregulation一起可能成为另一个机制,有助于骨生成。进一步的研究将需要评估这些通路骨生成的意义。

 5。结论

能量代谢是高度管制在成骨分化展开。几个酶参与糖酵解、三羧酸循环、线粒体呼吸链,和脂肪酸代谢调节成骨诱导后,更尤其是地塞米松,伴随着更氧化细胞状态。最终lipidome分析显示高脂质浓度基本脂质物种组成的变化,同时抑制脂肪酸合成阻碍了骨。结果表明,能量代谢起着至关重要的作用在展开的成骨分化。

 缩写 自动增益控制:

自动增益控制

 高山:

碱性磷酸酶

 AMPK:

活化蛋白激酶

 方差分析:

方差分析

 BMP2:

骨形成蛋白2

 BSA:

牛血清白蛋白

 CE:

胆甾醇酯

 Cer:

天然保湿因子

 COL1A2:

1型胶原蛋白α2链

 考克斯四:

细胞色素c氧化酶亚基4

 DB:

双键

 展开:

牙科滤泡细胞

 DG:

双甘酯

 DLST:

Dihydrolipoamide succinyltransferase

 DLX3:

Distal-less同源框3

 DMEM:

杜尔贝科修改鹰的媒介

 ELOVL6:

伸长的长链脂肪酸蛋白质6

 的边后卫:

胎牛血清

 舰队指挥官:

免费的胆固醇

 FIA:

流动注射分析

 英尺分:

傅里叶变换质谱法

 GAPDH:

Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

 HexCer:

Hexosylceramides

 HIF-1 α:

低氧诱导因子1α

 合:

辣根过氧化物酶

 HSP60:

热休克蛋白60

 它:

注射时间

 KEGG:

京都基因和基因组的百科全书

 LPC的:

Lysophosphatidylcholine

 简述:

Lysophosphatidylethanolamine

 女士:

质谱分析

 硕士:

间充质干细胞

 MSX:

多路采集

 ODM:

成骨分化培养基

 PBS:

磷酸盐

 PC:

磷脂酰胆碱

 PC:阿

Phosphatidylcholine-ether

 体育:

磷脂酰乙醇胺

 PE P:

PE-based缩醛磷脂

 答:

Phosphatidylglycerol

 PI:

磷脂酰肌醇

 PKC:

蛋白激酶C

 PS:

磷脂酰丝氨酸

 qPCR:

实时定量聚合酶链反应

 ROS:

活性氧

 RUNX2:

Runt-related转录因子2

 SDHA:

琥珀酸脱氢酶复合体亚基

 SDS:

十二烷基硫酸钠

 sds - page:

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

 SM:

鞘磷脂

 TBS:

Tris-buffered盐水

 TBST:

与Tween20 Tris-buffered盐水

 TG:

甘油三酸酯

 TOFA:

(5)- Tetradecyloxy 2-furoic酸

 VDAC:

压敏电阻器阴离子通道

 ZBTB16:

锌手指和BTB domain-containing 16

 数据可用性

lipidome浓度数据作为补充文件。其他原始数据可从作者对合理的请求。

 伦理批准

这项研究人类牙科卵泡细胞购买了商业。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

 确认

这项工作是支持的德意志Forschungsgemeinschaft (DFG,项目编号319390412)。

 补充材料

显著受地塞米松和BMP2基因的列表。碳代谢途径的基因以粗体显示。

量化结果的西方墨迹图在图1 (a)、2(一个),和3 意味着 ± 标准 偏差 和抗原的分子量。统计学意义( p < 0.05 )值相比,控制介质(DMEM)在同一时间点以粗体显示。

监管不那么丰富的脂类在成骨分化的展开。展开在成骨分化培养基培养(ODM), BMP2分化中、或控制介质(DMEM), 7、14和28天前分析了lipidome女士这图显示了一部分lysophosphatidylethanolamines(简述,),lysophosphatidylcholines (LPC分析,b),神经酰胺(Cer c), hexosylceramides (HexCer d)和phosphatidylglycerols (PG, e)。数据点显示 意味着 ± 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基中在同一时间点。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。星号与分化培养基相同颜色的数据点和线。

物种的磷脂酰乙醇胺在成骨分化展开。这图中显示的复合磷脂酰乙醇胺(PE)物种在成骨分化培养基培养在展开分析了MS (ODM), BMP2分化培养基,或控制介质(DMEM)在14天7 (a)和(b)。结果显示为 意味着 + 标准 偏差 ,学生的 t 以及执行与控制比较分化培养基中在同一时间点。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 。星号与分化培养基与酒吧在同样的颜色。

抑制脂肪酸合成TOFA和C75展开。dfc服用5 μg / ml脂肪酸合成抑制剂TOFA (a)或C75 (b)或车辆控制两个小时之前一天(a)或(b)的蛋白表达phospho-acetyl-CoA羧化酶(a)或脂肪酸合成酶(b)是由免疫印迹分析。结果显示为 意味着 + 标准 偏差 ,学生的 t 以及进行比较抑制剂治疗与车辆控制。 ∗ p < 0.05 。

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