SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2022/1252557 1252557 研究文章 脐带间充质干细胞小细胞外囊泡交付miR-21促进角膜上皮愈合通过PTEN / PI3K / Akt途径 https://orcid.org/0000 - 0002 - 1359 - 4376 刘 枭龙 1 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6008 - 9316 李 Xuran 3 4 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1334 - 9634 吴 广元 1 4 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7329 - 9419 气 Pengfei 1 4 张 Yanyan 3 刘 致宇 5 李 Xinyue 3 余 余 3 叶 Xiangmei 1 4 李 杨 1 4 杨 东莞 1 4 腾 Yueqiu 1 4 史 Ce 1 4 金 兴ydF4y2Ba 3 气 森 6 刘 个 3 王 摘要舒亶 3 刘 应 3 曹 Fenglin 1 4 香港 Qingran 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 4894 - 0029 王 Zhenkun 1 4 https://orcid.org/0000 - 0003 - 4179 - 5666 张 在香港 3 4 这些后 Stefan 1 中心实验室 第一附属医院 哈尔滨医科大学 哈尔滨 中国 hrbmu.edu.cn 2 生命科学学院 东北农业大学 哈尔滨 中国 neau.edu.cn 3 眼科医院 第一附属医院 哈尔滨医科大学 哈尔滨 中国 hrbmu.edu.cn 4 NHC重点实验室的细胞移植 哈尔滨医科大学 哈尔滨 中国 hrbmu.edu.cn 5 部门的实验室诊断 第一附属医院 哈尔滨医科大学 哈尔滨 中国 hrbmu.edu.cn 6 血液学部门 第一附属医院 哈尔滨医科大学 哈尔滨 中国 hrbmu.edu.cn 2022年 14 7 2022年 2022年 8 12 2021年 19 5 2022年 23 6 2022年 14 7 2022年 2022年 版权©2022枭龙刘et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

客观的。受伤后快速恢复角膜上皮完整性尤为重要保存角膜透明度和愿景。间充质干细胞(msc)可以考虑的有前途的再生疗法改善伤口愈合过程基于多种有效成分。细胞外囊泡形式msc,尤其是液,被认为是重要的旁分泌介质虽然小分子核糖核酸移植到受体细胞。本研究调查人类脐带的机制MSC-derived小细胞外囊泡(HUMSC-sEVs)在角膜上皮愈合伤口。 方法。HUMSC-sEVs被透射电子显微镜发现,纳米粒子跟踪分析和免疫印迹。角膜荧光素染色和组织学染色评估角膜伤口机械模型。变化HCEC扩散HUMSC-sEVs或miR-21模拟治疗后评估CCK-8 EdU化验,而迁移被体外挠伤口评估分析。完整的转录组测序进行识别与HUMSC-sEVs相关的差异表达基因治疗,其次是验证通过实时聚合酶链反应和免疫印迹。 结果。塞夫来自HUMSCs可以显著促进角膜上皮细胞增殖,迁移体外和体内角膜上皮愈合伤口。miR-21转染后得到了类似的效果,而HUMSC-sEVs部分否定的有利影响miR-21击倒。结果还表明,带来的好处是减少PTEN水平和HCECs PI3K / Akt信号通路的激活。 结论。HUMSC-sEVs能促进角膜上皮创伤的恢复虽然抑制PTEN miR-21转移,可能代表一种承诺角膜伤口修复的新治疗剂。

 哈尔滨医科大学 2021年j02 黑龙江省自然科学基金 LH2020H039 中国国家自然科学基金 8210061916 81970776 U20A20363 1。介绍

快速表面角膜病变可以治愈,无并发症,然而,角膜上皮愈合延迟可能导致后续进一步角膜感染并发症,如角膜瘢痕、变薄,溃疡甚至穿孔。据世界卫生组织统计,据估计,角膜混浊,包括角膜溃疡,是全世界第四致盲的重要原因之一 1]。尽管存在一些疗法和越来越多的新方法出现,治疗严重角膜上皮缺损仍然可以非常具有挑战性的。因此,局部治疗,艾滋病在管理和加速关闭角膜伤口将有助于减少感染和疤痕的风险,从而提高视觉效果。

间充质干细胞(MSC)的疗法参与修复受损或患病组织的结构和功能 2]。然而,可怜的嫁接和移植msc分化有限表明他们的有利影响可能不是与分化和受损组织的直接补给实质细胞( 3, 4]。目前,新兴的证据表明,msc的治疗效果主要依赖于旁分泌活动( 5]。msc可以释放细胞外囊泡(EVs)含有生物活性分子,影响相邻细胞的细胞过程。因此,它可能会避免干细胞疗法的局限性和并发症的眼睛通过使用MSC-derived EVs作为仿生代理商加快角膜伤口愈合( 6]。

电动汽车,特别是exosomes-a特定族群的塞来自多泡核内体,旁分泌功能单位的干细胞,治疗效果与母细胞相似,表明它们可能提供一种很有前途的,颗粒治疗选项( 7- - - - - - 9]。MSC-derived电动汽车的应用就可以发挥类似功能的msc和参与免疫反应的规定,炎性疾病和伤口愈合 10]。EVs保护蛋白质的双分子层脂膜细胞,mrna,和非编码rna (ncRNAs)破坏,可以转移到受体细胞,细胞间通信( 11]。ncRNA被认为是关键基因表达的转录后的调节器,可以转移活性形式通过电动调节特定细胞的活性。其中,小分子核糖核酸(microrna)已成为最重要的调制器( 12]。microrna是散播他们的类守恒的,单链ncRNAs,要么是转录的RNA聚合酶II独立基因或蛋白编码基因的内含子 13]。microrna是至关重要的球员在正常的人体发育进程中,体内平衡,疾病,参与几乎所有的生物过程,如细胞增殖和生存 14]。

从绳msc组织很容易实现和比msc与成人更原始的来源。之前的研究表明,人类脐带间充质干细胞小细胞外囊泡(HUMSC-sEVs)可以转让microrna和减弱细胞死亡,提高皮肤的伤口愈合 15, 16]。考虑到类似的皮肤和角膜之间的伤口愈合过程,我们研究HUMSC-sEVs角膜创伤修复的功能。本研究证明了HUMSC-sEVs使用角膜伤口机械模型的治疗效果。调查机制HUMSC-sEV-mediated角膜创伤修复,我们研究了HUMSC-sEVs对人类的影响角膜上皮细胞(HCEC)迁移和扩散。通过高通量测序和生物信息学分析,我们发现,miR-21是由HUMSC-sEVs作为关键因素导致HCECs表达下调的迁移和扩散PTEN的表达。

 2。材料和方法 2.1。主细胞培养和鉴定

脐带的妇产科学系获得哈尔滨医科大学第一附属医院为研究目的获取知情同意后,经伦理委员会批准的(伦理批准号:201859)。收集脐带沃顿的果冻组织切成小块,然后允许坚持细胞培养板的底部。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)低葡萄糖10%胎牛血清的边后卫和100 U /毫升penicillin-streptomycin(美国Gibco)添加到细胞中。分离细胞被洗PBS和沾抗体CD90、CD105, CD73, CD34, CD11b CD19、CD45、HLA-DR使用BD™人类MSC分析工具。流式细胞仪分析使用流式细胞仪石中剑™流式细胞分析仪(BD生物科学)和数据分析使用FlowJo软件(BD生物科学)。释放液从HUMSCs被preincubating HUMSCs 20 μ美国M GW4869(σ)为24小时。所有细胞用于我们的实验从早期文章3 - 5所示。

避免HUMSC-sEVs FBS-derived电动汽车的影响,HUMSCs用于提取培养使用EV-free签订的边后卫的离心机在4°C 120000×g 18个小时用贝克曼最适条件l - 100 XP西南32 Ti转子离心器。

 2.2。隔离和HUMSC-sEVs的识别

准确性和清晰,我们使用术语“电动汽车”或“塞”而不是“液”小HUMSC-derived膜结构后,国际社会为细胞外囊泡(ISEV)推荐指南EV命名,隔离和表征( 17, 18]。HUMSC上层清液收集在不同的时间每一个24 - 48小时和离心机在300 g×10分钟丸死细胞,细胞碎片和被离心法在2000 g×10分钟,然后10000 g×30分钟来消除大的囊泡,和g离心法在120000×70分钟后,HUMSC-sEV球洗了PBS和离心器120000×g 70分钟。在4°C所有离心步骤进行。纯化塞resuspended在PBS和存储在-80°C。

HUMSC-sEVs由BCA决定蛋白质的浓度化验设备,按照制造商的建议(Beyotime生物技术研究所,中国)。HUMSC-sEVs的形态是透射电子显微镜(TEM)观察到(JEOL jem - 1220,日本)。和HUMSC-sEVs的粒度分布测定纳米粒子跟踪分析(NTA莫尔文Zetasizer,英格兰)。膜蛋白标记(CD9、研究和CD63)使用免疫印迹分析。

获取miR-21击倒HUMSC-sEVs,转染msc miR-21抑制剂(RiboBio,中国)或负控制(数控)使用Opti-MEM(美国Gibco)和Lipofectamine干细胞转染试剂(英杰公司)根据制造商的指示。文化孵化48小时后,塞夫被隔绝文化上层的差速离心如上所述。

 2.3。HCEC文化和转染

人类的角膜上皮细胞系(中国Bnbio HCEC)在DMEM培养高葡萄糖补充的边后卫(美国Gibco)为10%。HCECs被播种到6-well或12-well盘子前一天治疗。HUMSC-sEVs或PBS治疗之前,HCECs饿死在无血清DMEM 24小时50%的融合。HCECs转染了miR-21模仿或miR-21抑制剂和相应的数控,pCDNA3.1-3×Flag-PTEN,和空载体质粒。

 2.4。塞夫吸收试验

吸收分析、签订20 μ100年g纯化HUMSC-sEVs μl PBS孵化了1 μ米迪勒(Beyotime生物技术研究所、中国)在黑暗中30分钟,与PBS洗两次,超离心机在120000 g×70分钟去除不具约束力染料,然后resuspended在无血清培养基。HCECs是用5毫米CFSE标记在黑暗中20分钟,洗两次完全培养基。200年 μl细胞悬液( 5 × 10 4 / 毫升 )被播种到35毫米玻璃底菜(美国Cellvis),让细胞坚持12小时的玻璃。CFSE-labeled HCECs与Dil-labeled cocultured HUMSC-sEVs 2小时。洗后用PBS和固定在4%多聚甲醛,细胞核与DAPI染色(Beyotime生物技术研究所,中国)。共焦显微镜下拍摄图像(德国蔡司LSM 710)和分析辅助软件。

TEM观察,HCECs cocultured HUMSC-sEVs (40 μg / ml) 2小时,然后用2.5%戊二醛固定和后缀3%四氧化锇(OsO4) 2小时。标本在一系列分级的乙醇脱水,嵌入在环氧树脂树脂,然后用TEM成像在100 kV(日本日立h - 7650)。

 2.5。伤口愈合体外测定

HCECs被播种到six-well盘子和成长为融合。单层挠使用200 μl吸管提示无血清培养系统和清洗去除分离细胞。然后,这些细胞被保存在coculture HUMSC-sEVs与否。在不同的时间,伤口抓在显微镜下拍摄的图像。分析了刮关闭ImageJ软件。伤口缝合的百分比计算如下: 迁移 区域 % = 一个 0 − 一个 n / 一个 0 × One hundred. ,在那里 一个 0 代表了最初的伤口面积和 一个 n 代表伤口面积的测量。

 2.6。体外细胞增殖试验

HCEC扩散测量使用细胞计数kit-8(美国σCCK-8)根据制造商的协议。光密度(OD)在450纳米测量平均值从三个复制使用一个微型板块读者(BioTek仪器,美国)。

 2.7。体外EdU扩散试验

细胞增殖也评估使用EdU细胞增殖试验装备(RiboBio,中国)根据制造商的协议。简单地说,治疗后,HCECs暴露在50 μM 5-ethynyl-2 ′ 脱氧尿苷(EdU RiboBio) 2小时37°C,然后,这些细胞被固定在4%多聚甲醛。与0.5% Triton-X100透化作用后,细胞反应1×阿波罗反应鸡尾酒30分钟。随后,细胞的DNA内容沾Hoechst33342 30分钟。最后,细胞的比例将EdU决心与荧光显微镜(奥林巴斯,IX51)。

 2.8。免疫印迹

HUMSC-sEVs和HCECs细胞溶解在裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Beyotime生物技术研究所,中国)。蛋白质是由电泳分离后加载到聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到PVDF与初级孵化抗体phospho-Akt(4060年代,春秋国旅),PTEN(9188年,春秋国旅),CD9 (ab92726 Abcam) CD61 (ab59479 Abcam)和研究(00679767,英杰公司)在一夜之间在4°C与5%脱脂牛奶阻塞后,紧随其后的是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体。发现了蛋白质免疫印迹分析系统。

 2.9。聚合酶链反应

细胞总RNA提取使用试剂盒工具包(美国表达载体)。RT-qPCR进行了使用SYBR®预混料交货TaqTM工具包(豆类生物、日本)根据制造商的指示。热循环条件下(Bio-Rad CFX96)使用如下:95°C 3分钟,其次是40 95°C的周期为5秒,30秒60°C, 72°C 30秒,紧随其后的是最后一个72°C 5分钟的延伸。这些基因的相对表达计算了2− ΔΔCt方法。

 2.10。生物信息学分析

HUMSC-sEV microrna的表达微阵列GSE69909 ws从GEO数据库下载。目标扫描、mirBase miRDB被用来在股票预测microrna丰富的目标基因。所有的预测目标的目标 预测 分数 ≥ 80年 受到基因本体论(去)分析探讨底层机制的潜在HUMSC-sEV microrna和目标在角膜reepithelialization mrna。

 2.11。完整的转录组测序

HCECs ( 2。5 × 10 6 细胞)是治疗40 μg / ml HUMSC-sEVs 48小时,同样体积的PBS添加控制有三个生物复制。总RNA分离使用试剂盒的试剂根据制造商的指示。1 μg总RNA准备互补脱氧核糖核酸数据库使用cDNA-PCR测序牛津纳米孔技术提供的工具包(SQK-PCS109)协议(永久)。短暂,模板切换活动定义的全长cDNA逆转录酶丰富,增加了PCR直接向两端的第一链cDNA适配器。和此前cDNA PCR 14圈LongAmp标签(内)。适配器的采购PCR产品接受了结扎使用T4 DNA连接酶(内)。Agencourt XP珠子用于DNA纯化根据安大略省的协议。最后互补脱氧核糖核酸数据库添加了FLO-MIN109 flowcells PromethION平台上和运行在生物科技公司(中国,北京)。KOBAS软件被用来测试统计浓缩的微分表达式成绩单KEGG通路。

 2.12。角膜伤口机械模型和治疗

实验伦理委员会批准的协议是哈尔滨医科大学第一附属医院(伦理批准号:2020100)。男性Sprague-Dawley老鼠加权160 - 180 g(6 - 8周大)购买了从动物实验中心的哈尔滨医科大学第二附属医院。老鼠和腹腔内注射麻醉,局部使用proparacaine 0.5%,角膜上皮是移除角膜/缘的边境AlgerBrush II(美国阿尔杰公司Lago Vista, TX)如前所述[ 19]。创建一个单方面的角膜损伤。批准的协议是哈尔滨医科大学动物保健和使用委员会的指导方针。

老鼠被随机分为四组和结膜下注射100 μl PBS包含 2 × 10 6 HUMSCs,同等数量的HUMSCs使用GW4869, 40岁 μg HUMSC-sEVs,分别或同等体积的PBS。伤口残留面积监测每12小时使用荧光素染色和拍摄使用尼康相机装备FS-2裂隙灯生物显微镜。剩余的百分比由ImageJ软件缺陷进行了分析。

 2.13。组织学分析

眼睛是无核的后缀和4%多聚甲醛后10分钟内安乐死。4 μm石蜡包埋部分与苏木精和伊红染色(圆))被用来观察角膜的结构和角膜reepithelialization程度。光显微镜下拍摄的部分(奥林巴斯、日本)。

 2.14。统计分析

所有使用棱镜进行了统计分析软件。数据进行了总结 的意思是 ± 标准 偏差 SD 。学生的 t - - - - - -测试是用来确定样本统计上显著的差异。当需要多重比较分析,统计学意义被单向方差分析评价。所有 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。HUMSCs和HUMSC-sEVs的识别

流式细胞仪分析结果证实存在积极的表达典型的MSC CD105标记,CD90、CD73,而诸如CD34造血细胞的表面标记,CD11b, CD19、CD45、HLA-DR相当弱探测与控制(图同形像 1(一))。此外,根据倒置显微镜观察,细胞的形态是普通长轴定向安排和提出一个典型的梭形,成长为惠而浦或集群(图 1 (b))。

形态学观察和识别HUMSCs HUMSC-sEVs。(一)在HUMSCs表面标记流式细胞术分析。(b)光形态HUMSCs的形象。(c)下HUMSC-sEVs TEM的形态。酒吧,规模100海里。(d)峰值的大小HUMSC-sEVs约80海里NTA所显示的。(e) HUMSC-sEVs CD9是积极的,通过免疫印迹的研究和CD63表示。

的经典结构孤立的股票,包括“rim的杯”和双层膜形态、透射电镜的观察(图 1 (c))。NTA结果表明,粒子的直径大约50 - 150纳米(图 1 (d))。蛋白质标记的电动汽车被进一步证实了免疫印迹,包括CD9、CD63,研究(图 1 (e))。

 3.2。应用HUMSCs或HUMSC-sEVs促进角膜伤口愈合在老鼠模型中

我们发现结膜下注射HUMSCs或者HUMSC-sEVs可以有效促进小鼠角膜缺陷的愈合,同时抑制外来体分泌通过GW4869可以减弱HUMSCs介导的好处在24小时(数字 2(一个)和 2 (c))。受伤的眼角膜接受HUMSC和HUMSC-sEVs恢复比治疗更定期安排和结构紧凑PBS通过评估角膜组织微观结构)染色(图 2 (b))。

HUMSCs和HUMSC-sEVs角膜上皮的影响伤口愈合体内。(a, c) Fluorescein-stained的图像缺陷眼角膜,治疗前后与HUMSCs HUMSCs-GW4869, HUMSC-sEVs或PBS。(b))染色显示角膜的组织学外观。数据表示为 意味着 ± SD 。 ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 , n = 8 。

 4所示。HUMSC-sEVs促进HCECs体外的增殖和迁移

为了演示签订的吸收,CFSE-labeled HCECs与Dil-labeled cocultured塞,然后用激光扫描共焦显微镜。红色的纳米粒子表示标签股票发生在较小的集群和观察细胞膜周围或在HCECs细胞质内。定位结果表明,塞夫来自HUMSCs已经被HCECs与染料在细胞内分布(图 3(一个))。此外,融合过程也是TEM观察到(图 3 (b))。

的影响HUMSC-sEVs HCECs的体外增殖和迁移。(a)的荧光图像CFSE-labeled HCECs(绿色)孵化与Dil-labeled HUMSC-sEVs(红色)。核与DAPI染色(蓝色)。(b) TEM与HUMSC-sEVs HCECs孵化。(c, d)代表图像从体外挠伤口愈合化验证明细胞迁移到胞外区域显著提升的HUMSC-sEVs相比,控制, n = 4 。(e) CCK-8化验显示增加扩散HCECs孵化与HUMSC-sEVs 48小时后, n = 5 。(f, g)增殖HCECs被EdU公司检测。细胞治疗与HUMSC-sEVs或空白的控制, n = 3 。蓝色:核染色(Hoechst33342);红色:EdU染色。数据表示为 意味着 ± SD 。 ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 。

为了评估是否HUMSC-sEVs刺激HCEC迁移,对伤口闭合率的影响研究。其余地区的差距在刮伤化验证实的promigratory影响HUMSC-sEVs 18小时的潜伏期(后与剂量相关的趋势数据 3 (c)和 3 (d))。考虑角膜愈合是一个动态的交织过程由细胞增殖、迁移、粘附、增殖能力是基础。我们进一步研究了HUMSC-sEVs能否提高proliferation-promoting HCECs体外的行为。CCK-8试验表明,HCECs的扩散与HUMSC-sEVs孵化后显著改善剂量依赖性的方式(图 3 (e))。和增殖细胞的EdU可视化的分析也表明,HUMSC-sEV治疗增加增殖细胞的比例相对于控件(数字 3 (f)和 3 (g))。

 5。HUMSC-sEVs促进HCECs通过PI3K / Akt通路的增殖和迁移

进一步调查的潜在机制HUMSC-sEVs HCECs监管的增殖和迁移,完整的转录组测序是用来检测相关基因的信使rna表达水平。240个差异表达基因(度)被确定( 褶皱 改变 ≥ 2 和 P 值< 0.05),其中包括104调节度和136度使之抑制(图 4(一))。然后,我们解释度的潜在生物功能的基因功能和信号通路通过KEGG浓缩分析显示,PI3K / Akt信号通路,磷脂酰肌醇信号系统,细胞粘附分子,和MAPK信号通路之间的显著差异之前和之后HUMSC-sEV-treated HCECs(图 4 (b))。先前的研究表明,PI3K / Akt途径深入参与角膜上皮愈合过程的调制( 20.]。因此,PI3K / Akt信号通路参与HCECs HUMSC-sEV治疗后的扩散和迁移过程进行了探讨。

转录组和路径分析HUMSC-sEV治疗。(a)火山情节之间的度HUMSC-sEV-treated HCECs和HUMSC-sEV-untreated HCECs。点绿色代表表达下调度,红点的意思是调节度,和黑点是无意义的度。(b)的KEGG注释结果度根据KEGG通路类型分类。度:差异表达基因;KEGG:京都基因和基因组的百科全书。

 6。miR-21调节PTEN / PI3K / Akt信号通路

签订管理大量的生理活动通过microrna [ 21]。作为HUMSC-sEVs microrna是丰富的,我们假设HUMSC-sEVs促进角膜上皮缺损的治疗主要是通过microrna。下载的数据集被用来确定各种microrna HUMSC-sEVs的内容( 22]。在几个microrna选择性地富集在HUMSC-sEVs,我们专注于最丰富,miR-21(图 5(一个))。下游目标预测的目标扫描,mirBase和miRDB数据库然后估算大卫在线进行分析。结果表明,miR-21参与各种分子的调节功能,含有钙离子结合,肽酶抑制剂活动,生长因子活性,等等(图 5 (b))。其中,磷酸酶活动可能涉及PI3K / Akt的监管。microrna与3交互可以发挥他们的功能 ′ 翻译区(3 ′ UTR)或蛋白质编码序列的目标mrna。根据miRbase数据库,PTEN可能的潜在下游miR-21(图 5 (c))。

包含在HUMSC-sEVs microrna的识别。(一)对HUMSC-sEVs microrna的丰度分析。(b) mRNA HUMSC-sEVs microrna显著富集的目标识别和分析。(c)之间的结合位点miR-21和PTEN信使rna。MF:分子功能;:基因本体。

不出所料,我们发现PTEN mRNA和蛋白表达水平的降低被确定后HCECs HUMSC-sEVs处理(数据 6(一)和 6 (d))。PI3K / Akt通路的激活在HCECs HUMSC-sEV刺激被评估验证磷酸化Akt水平(图 6 (d))。确认是否PTEN在HCECs miR-21的目标,我们进一步检测PTEN的表达HCECs转染独立miR-21模仿或抑制剂及其相应的数控来验证miR-21之间的交互和PTEN的存在和免疫印迹。一旦转染miR-21模仿,PTEN的蛋白质含量显著降低在HCECs(图 6 (f)),不同的是在转录水平(数据也发现 6 (b)和 6 (c))。我们还发现miR-21对一种蛋白激酶磷酸化的影响促进(图 6 (g))。同时,过度的PTEN表达下调的磷酸化Akt的水平,这是重要的扩散和迁移(图 6 (e))。这些结果表明,miR-21调节PTEN在HCECs通过转录后的修改。

miR-21调节HCECs的扩散和迁移激活通过针对PTEN PI3K / Akt通路。(a, d) HUMSC-sEV治疗减少HCECs PTEN的RNA和蛋白质含量。(b)的表达水平在HCECs miR-21。f (c), PTEN与miR-21变异改变了。(e) phospho-Akt过度后的PTEN的表达。(g)的表达水平phospho-Akt转染后miR-21模仿被免疫印迹检测。数据表示为 意味着 ± SD 。 ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 。

 7所示。通过miR-21 HUMSC-sEVs促进HCECs增殖和迁移

为了评估是否sEV-mediated miR-21转移中发挥作用HCECs的扩散和迁移,随后可拆卸的实验。HUMSCs转染了miR-21抑制剂(100海里)的最终浓度或数控和孤立的文化收集上层清液随后签订。然后,HCECs包含相同浓度的miR-21孵化或miR-21击倒HUMSC-sEVs移民和CCK-8分析。结果表明,upregulation迁移(数据 7(一)和 7 (b)(图),以及扩散 7 (c))由HUMSC-sEVs被miR-21击倒部分否定。

sEV-mediated miR-21转移促进HCEC增殖和迁移。(a, b) HCECs miR-21 KD HUMSC-sEVs处理或miR-21包含HUMSC-sEVs 18 h。划痕试验显示miR-21 KD HUMSC-sEV-treated的治疗组低于miR-21包含HUMSC-sEV-treated集团 n = 5 。(c) CCK-8试验显示miR-21 KD的扩散HUMSC-sEV-treated组低于miR-21包含HUMSC-sEV-treated组18小时后, n = 3 。(d, e)的增殖HCECs被EdU公司检测转染后miR-21模仿(在最后50 nM)的浓度。蓝色:核染色(Hoechst33342);红色:EdU染色, n = 3 。(f) CCK-8试验显示miR-21的扩散模拟组高于对照组48小时后, n = 3 。(g h)划痕试验显示显著加快伤口关闭HCECs孵化与miR-21模拟数控18小时后, n = 5 。数据表示为 意味着 ± SD 。 ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 。KD:击倒。

进一步研究的潜在参与miR-21, HCECs是暂时性的转染miR-21模仿或数控。转染后扩散HCECs miR-21模仿或数控评估使用CCK-8和EdU化验。miR-21模仿转染大大促进了HCECs扩散与NC组(数字 7 (d)- - - - - - 7 (f))。此外,的能力HCECs转染与miR-21模仿恢复单层长大而NC-transfected细胞(数据完整性 7 (g)和 7 (h))。

综上所述,我们的数据表明,miR-21塞促进HCECs的扩散和迁移通过激活PI3K / Akt信号通路,这可能会发挥重要作用促进角膜上皮愈合伤口。

 8。原理图

我们首先确定股票的积极作用来源于HUMSCs在促进角膜上皮愈合伤口,然后确定的主要分子PI3K / Akt在伤口愈合过程中以及miR-21 HUCMSC-sEVs通过生物信息学分析中包含的是最丰富的。最后,我们固定PTEN作为miR-21下游目标,这是miR-21之间的关键环节和相关蛋白质和确定PTEN / PI3K / Akt参与细胞增殖和迁移(图 8)。

原理图描述了角膜上皮HUMSC-sEVs机制缺陷。

 9。讨论

角膜上皮损伤是一种最常见的眼部疾病,和小说治疗需要改善这种疾病的临床结果。目前的研究证实的有益作用HUMSC-sEVs角膜损伤。阐明与此活动相关的潜在机制,我们的体外结果表明HUMSC-sEVs促进HCECs增殖和迁移通过镇压PTEN的表达和下游涉及一种蛋白激酶的磷酸化的影响。此外,miR-21作为一种重要的监管机构也显示效果在促进HCECs针对PTEN的增殖和迁移。我们的研究结果表明,HUMSC-sEVs可能是一个非常有意义的和有前途的方法治疗角膜的缺陷。

作为细胞疗法治疗人类疾病已经得到了越来越多的兴趣在过去的几十年里,数以百计的诊所或使用人类msc开展了临床试验,显示应用程序的msc可以提高伤口愈合( 23和改善肝纤维化 24]。在这项研究中,我们已经表明,结膜下注射HUMSCs促进角膜上皮愈合伤口。不过,最近的一些研究表明,msc的治疗作用可能主要由旁分泌作用涉及蛋白质/肽激素,和囊泡包装各种分子( 25]。在这样的效应器,液被认为是关键效应器产生治疗作用。为了进一步确认是否HUMSC旁分泌作用主导角膜伤口愈合的过程中,使用GW4869 HUMSCs,外来体一代拦截器( 26]。最少、HUMSCs更有效地提高伤口愈合释放液时阻塞。这些结果暗示的功能HUMSCs特别依赖外来体释放到微环境。

研究表明,独立的应用MSC-derived塞也可以发挥重要作用在促进受损组织的修复 27]。此外,在msc MSC-derived有很多优势,比如少安全隐患( 28),长期保存和容易运输 29日),低免疫原性( 30.),和跨越生物障碍的能力 31日]。之前的研究表明,塞夫从角膜msc可以减少疤痕形成和增加角膜的透明性愈合 32]。塞夫从胎盘msc可以减少炎症反应在角膜碱烧伤和促进恢复正常角膜的结构( 33]。塞夫从骨髓msc促进视网膜神经节细胞的生存和再生的轴突通过miRNA-dependent机制( 34]。在目前的研究中,第一次,我们证明HUMSC-sEVs能促进角膜上皮修复完整和角膜损伤的愈合过程在体外和体内。

microrna以来首次发现了李et al .,仍能发现新的microrna随着高通量测序技术的发展和计算和生物信息学预测方法 35]。越来越多的证据表明,microrna能防止目标mRNA翻译成蛋白质转录后的调控( 22]。在大多数情况下,microrna与3 ′ UTR目标mrna以互补的方式来抑制蛋白质翻译然后调节细胞增殖、分化、发育和衰老( 36, 37]。作为的关键调解人MSC-derived塞,microrna能提供持续的治疗效果和基本局部微环境的改变,使它理想的治疗性生物分子( 38]。许多研究验证microrna在塞的作用在各种类型的细胞( 39, 40]。为了进一步探讨HUMSC-sEVs影响角膜上皮细胞,我们咨询了地理数据集,结合生物信息学分析方法分析HUMSC-sEV-derived microrna的内容组成,并进行转录组测序识别度HUMSC-sEV-treated HCECs比未经处理的条件。我们发现股票来自HUMSCs miR-21丰富,这可能作为生理和病理调节因子。在我们的研究中,塞夫从miR-21 KD HUMSCs HCECs削弱影响的扩散和迁移与提取miR-21包含HUMSCs形式,暗示HUMSC-sEVs部分取决于miR-21的功能。miR-21超表达类似的影响促进角膜上皮细胞的增殖和迁移。这些结果表明,miR-21对角膜上皮细胞基本功能放大。miR-21是扩散microrna的,其作用在皮肤伤口愈合了伤口模型( 41和角膜伤口愈合 42]。尽管预览结果证明miR-21 / SPRY2轴参与调节上皮表型,促进角膜上皮细胞的迁移,提高伤口愈合过程,miR-21影响角膜上皮愈合的机制在很大程度上仍未知。

PI3K / Akt通路是细胞信号转导通路密切相关的增长和扩散,在扩散起着重要的中介作用,正常细胞的分化和凋亡。信号蛋白活性增加组织细胞的增殖能力强( 43]。研究表明,PI3K和Akt的激活可以触发,加快转型和皮肤上皮细胞增殖,而使用抑制剂可以抑制癌细胞的增殖,提高水平的程序性细胞死亡( 44, 45]。一旦PI3K / Akt信号通路抑制,角膜上皮移植被推迟( 46- - - - - - 48]。这些观察从不同的实验表明PI3K / Akt信号可能刺激效应的维护角膜上皮的完整性。在我们的实验中,PI3K / Akt通路被激活在HCECs HUMSC-sEVs的扩散和迁移促进了。miR-21可能会削弱PTEN的表达水平和增加HCECs PI3K / Akt信号激活。

下游miR-21已经验证基于母星数据库预测,dual-luciferase报告基因分析,和从其他研究证据 49- - - - - - 51]。PTEN是潜在的效应,属于肿瘤抑制基因和抑制的关键蛋白质的磷酸化水平在不同信号通路发挥负面作用通过促进细胞凋亡和细胞周期阻滞和调节细胞迁移和其他链接 52]。最近的研究表明,PTEN参与心肌损伤的病理机制和神经认知,也在调节角膜上皮缺陷( 48, 53- - - - - - 55]。此外,PTEN仍然是PI3K / Akt信号的主要负监管机构通过其磷酸肌醇磷酸酯酶活性( 56]。确认miR-21之间的关系、PTEN和PI3K / Akt,我们转移miR-21mimics HCECs,发现miR-21过度表达下调可能PTEN的表达水平,进一步诱导差别,这对这些upregulation phospho-Akt。这些结果表明,miR-21提升HCECs调节PI3K / Akt的扩散和迁移通过PTEN。

尽管miR-21是最丰富的microrna在HUMSC-sEVs之一,细胞迁移和增殖的规定引起HUMSC-sEVs被miR-21击倒部分否定。miR-21 KD HUMSC-sEVs保留大部分的生物活性表明还有其他身份不明的生物活性成分。据报道,电动车只带低数量太少引起任何的microrna的生物反应( 57, 58],MSC-derived EVs可能发挥功能作用,因为他们的蛋白质而不是rna ( 59]。虽然我们证实,miR-21 HUMSC-derived-sEVs介导HCECs增殖和迁移的影响,仍有其他货物(尤其是蛋白质)功能类似的角色等待进一步调查。此外,由于严重的角膜上皮缺损患者的情况比这要复杂得多在动物模型中,HUMSC-sEVs能否促进严重角膜损伤的治疗在临床实践中仍然是未知的。

然而,塞夫纳米囊泡可以交付使用针尽可能小,不会影响及其生物活性增加针的内部压力。我们建议HUMSC-sEVs不仅可以用作局部药物促进角膜上皮缺陷也可以注入更多的本地人工不能治疗的疾病,因此作为假定的治疗剂。我们的研究证明HUMSC-sEV眼是一个有前途的战略管理的角膜上皮缺损的治疗,这是更有效的发展战略的基础角膜伤口愈合。

 10。结论

总之,本研究首先透露HUMSC-sEVs的功能在促进角膜上皮细胞增殖和迁移通过上调PI3K / Akt信号通路虽然抑制PTEN miR-21转移,导致更好的角膜创伤修复和再生。我们的研究结果提供了一个小说治疗剂治疗角膜伤口治疗游离。

 数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

 信息披露

这个手稿提交预印本链接” https://www.researchsquare.com/article/rs-571150/v2“( 60]。

 的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

 作者的贡献

枭龙刘和李Xuran贡献同样这项工作。

 确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号。U20A20363, 81970776,, 8210061916),中国黑龙江省自然科学基金(批准号LH2020H039),杰出青年资助哈尔滨医科大学第一附属医院(批准号2021 j02)。

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