SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/6637328 6637328 研究文章 同种异体和自体T细胞增殖的抑制脂肪间充质干细胞的强直性脊柱炎患者 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9068 - 3885 Kuca-Warnawin Ewa 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6084 - 7906 Plebańczyk 马格达莱纳 1 Bonek Krzysztof 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2380 - 2810 Kontny Ewa 1 弗里斯 杰斯 1 病理生理学和免疫学 国家老年研究所的 风湿病和康复 华沙02 - 637 波兰 spartanska.pl 2 风湿病学部门 国家老年研究所的 风湿病和康复 华沙02 - 637 波兰 spartanska.pl 2021年 12 3 2021年 2021年 26 10 2020年 17 1 2021年 15 2 2021年 12 3 2021年 2021年 版权©2021 Ewa Kuca-Warnawin et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。在强直性脊柱炎(AS),伴随着慢性炎症,T细胞扩张发挥了致病作用;骨骨髓来源间充质干细胞的免疫调节特性(BM-MSCs)受损,而脂肪tissue-derived同行的功能特性(对asc)未知。<我talic> 方法。我们评估的抗增殖活动作为对asc /,获得20个病人,对同种异体和自体T淋巴细胞,利用健康的捐赠者对asc (HD /对asc)细胞系作为参考。PHA-activated外周血单核细胞(PBMCs) cocultured与未经处理的信息联络和transwell条件或TNF +干扰素<我talic> γ-对asc (TI)许可,然后通过流式细胞术分析识别增殖和nonproliferating CD4+和CD8+T细胞。犬尿氨酸的浓度,前列腺素E2(铂族元素2)和il - 10在文化浮在表面的测量。<我talic> 结果。在同种异体系统,高清/对asc和对asc /同样减少CD4细胞的扩散+和CD8+T细胞,主要是通过溶性因素。犬尿氨酸的浓度和铂族元素2与T细胞增殖具有负相关性,这些因素合成的选择性抑制剂明显恢复了T细胞的反应。对asc /施加类似的抗增殖的影响也在自体T细胞。<我talic> 结论。我们首次报告,尽管体内慢性暴露在炎症条件下,对asc /保持正常功能抑制同种异体和自体CD4的扩张+和CD8+T细胞,主要通过犬尿氨酸和铂族元素2,因此可能有潜在的治疗价值。一些区别的抗增殖作用,对asc /对asc和HD /显示体内对asc /许可。

 Ministerstwo Nauki我Szkolnictwa Wyzszego S / 6 Narodowe中枢Nauki 2016/21 / B / NZ5/00500 1。介绍

强直性脊柱炎(AS)是一种风湿性疾病的特点是慢性炎症和关节病理新骨形成轴向产生脊髓段融合。外围关节炎,enthesitis、骨质疏松症和extraskeletal症状,如参与的眼睛,皮肤,或肠道,也很普遍 1]。它提出了免疫屏障功能障碍(肠道、皮肤)和/或异常免疫反应在机械应力的网站(entheses,血管壁),一起相互先天和适应性免疫之间的相互作用机制,是触发的关键,发展和监管的( 2]。与HLA-B的引人注目的协会<我nline-formula> ∗ 27个等位基因和上位相互作用与等位基因编码内质网氨基肽酶(ERAP)表明T细胞抗原呈递的关键致病作用,其次是发展和持久性的适应性免疫反应,主要包括T细胞亚群( 3]。作为病人,T细胞占主导地位在早期和积极的骶髂关节炎和代表大约50%的细胞浸润影响关节( 4, 5]。增加CD4的数量和更大的扩散+和CD8+T细胞被发现在滑液和这些患者的外周血 6- - - - - - 9]。间叶细胞间质干细胞(msc),存在于各种组织,具有免疫调节能力。众所周知,这些细胞在不同的免疫细胞发挥免疫抑制作用,包括T淋巴细胞( 10]。代理通过可溶性介质和细胞contact-dependent途径,msc抑制活化,和T细胞的增殖抑制效应但保护或诱导调节性T细胞(Treg) [ 11]。在大量的可溶性因子,前列腺素E2(铂族元素2)和indoleamine-2 3-dioxygenase (IDO) /犬尿氨酸通路被视为人类msc的免疫抑制活性的主要介质,包括抑制T细胞增殖的 12- - - - - - 14]。提高成功的临床应用msc的治疗特点,几个开发策略,并与促炎细胞因子预处理,如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素<我talic> γ(干扰素<我talic> γ),是常用的 15]。重要的是,来源于msc (BM-MSCs)从患者的骨骼显示异常基因表达,分泌的潜力,和免疫调节活动下降 16- - - - - - 18]。此外,BM-MSCs建议有助于异常骨内稳态,特点是,由于他们具有很强的抑制能力osteoclastogenesis以及增强osteoblastogenic和脂肪形成的分化 19- - - - - - 21]。同种异体的因此,在目前正在进行的临床试验,但不是自体msc各种组织起源用于病人的治疗。然而,脂肪间充质干细胞(对asc),具有较强的免疫抑制特性比BM-MSC [ 14,还没有测试 22]。此外,在风湿性疾病,骨髓是炎症发生的地方,在不影响周围脂肪组织相比 23]。有趣的是,有前景的结果的应用自体间质血管分数(SVF),含脂肪间充质干细胞(对asc),表明这些细胞的治疗用途( 24]。不幸的是,对asc的生物学的病人(如对asc /)了解甚少,对asc和免疫调节特性的数据/失踪。对asc我们以前发现的患者(如对asc /)显示某些异常表面标记物的表达和分泌的可溶性因子但是保留能力调节T细胞活化标志物的表达( 25, 26]。考虑一个重要的角色的T细胞在发病机制和潜在的治疗应用自体对asc,在目前的研究中,我们主要集中在进一步评估免疫调节对asc的潜力,通过评估抗增殖活性和机制的作用(s)这些细胞对同种异体和自体CD4细胞+和CD8+T淋巴细胞。这一目标,mitogen-stimulated外周血单核细胞(PBMCs) cocultured与未经处理或TNF +干扰素<我talic> γ对asc的先决条件(TI),获得病人和健康的捐赠者(HD);然后,CD4细胞的增殖+和CD8+T淋巴细胞释放PGE2、犬尿氨酸,白介素- 10 (IL)进行了分析。可溶性介质对asc免疫调节作用的贡献是防止信息联系,验证了使用transwell系统和应用程序的特定抑制剂的铂族元素2和犬尿氨酸合成。

 2。材料和方法 2.1。病人和样品收集

一组20例(12 8雌性,雄性)完成了研究(国际社会评估SpondyloArthritis)标准( 27被包括在研究。病人的特点给出了表 1。这项研究符合所有标准包含在赫尔辛基宣言,并经伦理委员会批准的国家老年研究所,风湿病,和康复,华沙,波兰(批准协议没有:KBT-8/4/20016)。所有患者报名之前给他们的书面知情同意。

人口统计学和临床特点的病人。

参数 强直性脊柱炎(AS) (<我nline-formula> n = 20. )
人口统计资料
年龄、年 42.0 (25 - 70)
性别,女(F) /男(M),<我nline-formula> n 8 f / 12米
疾病持续时间、年 6 (1.5 -18)
临床数据
BASDAI,分数 6.1 (1.0 - -8.2)
阿斯达c反应蛋白,得分 3.8 (1 - 4.7)
BASFI,分数 5.0 (0 - 9.6)
BASMI,分数 4.2 (0.25 - -7.2)
哈克,分数 1.125 (0 - 2.75)
实验室值
CRP, mg / l 7 (5-59)
ESR, mm / h 15 (1-59)
药物,%
非甾体抗炎药 80.0
Nonbiologic DMARDs 30.0
糖皮质激素 10.0
2.2。ASC隔离和文化

标本的腹部皮下脂肪来自患者的18 G针吸活组织检查。组织处理、ASC隔离和文化进行了如前所述[ 28]。五人脂肪间充质细胞行(Lonza集团Lonza Walkershille Inc .,医学博士,美国;供体数量:0000440549,0000410252,0000535975,0000605220,0000550179)是用作控制。在3 - 5个章节对asc所有实验进行使用。对asc是培养完整的DMEM / F12培养基组成(锅英国生物技术有限公司,Wimborn,英国),10%胎牛血清(FCS) (Biochrom,柏林,德国),200 U /毫升青霉素,200<我talic> μg / ml链霉素(Polfa Tarchomin S.A.华沙,波兰),5<我talic> μ圣地亚哥g / ml plasmocin (InvivoGen CA,美国)。预处理(“启动”或“许可”)对asc的促炎细胞因子是由细胞的刺激24小时与人类肿瘤坏死因子(TNF)和重组干扰素<我talic> γ(干扰素<我talic> γ)(从研发系统,明尼阿波利斯,美国;每个应用于10 ng / ml)。肿瘤坏死因子、干扰素的浓度<我talic> γ根据以往的出版物(确定 29日- - - - - - 31日]。

 2.3。接触和非接触Cocultures对asc的外周血单核细胞(PBMCs)

所有cocultures进行完整的DMEM / F12培养基。对asc (<我nline-formula> 6 × 10 4 / / 2毫升的介质)被播种与干扰素24-well盘子和刺激<我talic> γ和肿瘤坏死因子(见上图)。PBMCs分离得到淡黄色的外套从健康男性获得荣誉献血者(< 60岁)患者,按照常规应用程序使用Ficoll-Paque(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。隔离后,PBMCs (<我nline-formula> 1。2 × 10 6 / / 2毫升的介质)被播种直接(联系coculture)或0.4<我talic> μ米孔隙大小Transwell过滤器(MD24载体插入0.4我热费希尔科学,马萨诸塞州,妈,美国)(无触点coculture)与附着对asc 24-well板(<我nline-formula> 6 × 10 4 2.5 /)和处理<我talic> μ克/毫升phytohaemagglutinin (PHA Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。经过5天的coculture、文化上层清液(SNs)和PBMCs收获进行进一步分析,即。、测量浓度的可溶性factors-kynurenines铂族元素2分别,il - 10或流式细胞术。PBMCs培养分别被用作控制。

 2.4。浮在表面的可溶性因子的测量在文化

犬尿氨酸浓度测量spectrophotometrically所描述的其他地方( 32]。这一目标,SNs与30%三氯乙酸混合2:1比和孵化30分钟在5°C,然后在10000×g离心5分钟和最后稀释1:1的比例在埃尔利希试剂(100毫克p-dimethyl苯甲醛和5毫升冰醋酸;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。样品的光密度测量的波长490纳米。L-Kynurenine (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)稀释培养基用于准备标准曲线。铂族元素的浓度2和il - 10测定使用商用kits-the参数工具包(研发系统、明尼阿波利斯、MN)和人类il - 10酶联免疫吸附试验(热费希尔;猫。不。分别为88-7104-88)。所有测量都是在重复完成。

 2.5。阻断实验

调查的角色PGE2和犬尿氨酸对asc的免疫调节能力,这些因素的特定抑制剂的合成,即。,106M的吲哚美辛(Sigma-Aldrich、德国)或1毫米的1-methyl-tryptophan (1-MT、Sigma-Aldrich、德国),分别被添加在细胞培养期间的开始。上述浓度选择从先前的研究的文献搜索 32- - - - - - 36]。与特定抑制剂对asc的预培养48小时后,PHA-activated和CFSE-stained PBMCs被添加到文化。接下来,1-MT或消炎痛又添加了。文化是培养5天在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。结束的时候coculture, PBMCs收获进一步仪分析。

 2.6。流式细胞术分析 2.6.1。T细胞亚群的识别

从文化在50 resuspended PBMCs收获<我talic> μl 30分钟的缓冲和染色流式细胞仪对各自的冰膜抗原为人类使用fluorochrome-conjugated单克隆抗体特定:CD4-APC-Cy7(美国圣地亚哥BD Pharmingen CA)或CD8-PerCP (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。清洗步骤后,细胞获得和分析使用FACSCanto细胞血细胞计数器和女主角的软件。使用适当的同形像控制实验。

 2.6.2。扩散分析

二乙酸扩散试验,PBMCs沾carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)(热费希尔科学、马萨诸塞州、马、美国),然后用PHA刺激对asc和cocultured如上所述。细胞从文化分析流式细胞仪确定增殖和nonproliferating细胞。描述细胞的增殖反应,增殖细胞的比例,增殖指数(PI),复制指数(RI)计算(其它地方描述的那样 37),使用下面的数学公式: (1) π = ∑ 1 我 我 × N 我 / 2 我 ∑ 1 我 N 我 / 2 我 。

增殖指数是反应细胞,他们已经经历了一个部门的平均数;<我nline-formula> N 是细胞分裂的数量,<我nline-formula> 我 是部门的数量。 (2) 国际扶轮 = ∑ 1 我 N 我 ∑ 1 我 N 我 / 2 我 。

复制指数是反应细胞,褶皱扩张的文化;<我nline-formula> N 是细胞分裂的数量,<我nline-formula> 我 是部门的数量。

的直方图显示的扩散PHA-stimulated PBMCs在各种文化变异图所示 1(补充材料)。

 2.7。数据分析

数据分析使用的软件版本7 GraphPad棱镜。Shapiro-Wilk测试被用作正常测试。单向方差分析(方差分析)和重复的措施和事后图基测试是用来评估治疗的效果和肿瘤坏死因子、干扰素<我talic> γ治疗的靶细胞上也比较联系与(与)无触点cocultures和同种异体和自体cocultures。Mann-Whitney测试应用于分析对asc HD /对asc和/之间的差异。

参数(皮尔森是线性)和非参数(斯皮尔曼秩)相关测试是用来评估之间的关联分析参数。概率值小于0.05被认为是重要的。

 3所示。结果 3.1。病人

有关人口和临床患者队列异构数据(表 1)。百分之九十的病人HLA-B27是积极的,40%的人以眼部症状(葡萄膜炎),和10%的人外周关节炎。他们大多是对待nonsteroid抗炎药(非甾体抗炎药),而应用程序的nonbiologic疾病修饰治疗风湿病的药物(DMARDs)和糖皮质激素并不频繁。

 3.2。通过对asc抑制T细胞增殖

在控制,分别培养,PHA-treated PBMCs (PBMCsPHA),CD4的大部分+和CD8+T细胞数量(<我nline-formula> 的意思是 ± 扫描电镜 = 88.7 ± 1。6 % 和<我nline-formula> 81.9 ± 2。4 % 分别),但相当多的PBMC donor-dependent观察变化(数据 1(一)和 1 (d))。作为显示在图 2年代的辅料,也抑制增生性反应的程度取决于个体特异性PBMCs捐赠者的,因为相同的HD /对ASC或/ ASC线施加不恒等的影响PBMCs起源于不同的捐助者(比较没有。1和2)。因此,高清/ ASC和ASC活动进行评估在同样的实验中,使用PBMCs来自同一个捐赠者。在治疗和对asc TI-stimulated增殖T细胞的数量的子集和部门/增殖细胞的数量(PI)以及褶皱这些细胞的扩张(RI)显著降低。重要的是,对asc HD /对asc和施加类似的抑制效果(数据 1(一)- - - - - - 1 (f))。在cocultures高清对asc /对asc和HD /“透明国际”对asc和对asc /, /“透明国际”,增殖CD4的数量+细胞被抑制<我nline-formula> 23.1 ± 5.8 % 和<我nline-formula> 44.2 ± 6.2 % vs。<我nline-formula> 29.3 ± 5.8 % 和<我nline-formula> 40.8 ± 7.4 % 分别在增殖CD8的数量+细胞减少<我nline-formula> 14.3 ± 4.6 % 和<我nline-formula> 40.3 ± 7.7 % vs。<我nline-formula> 29.4 ± 5.7 % 和<我nline-formula> 34.9 ± 6.2 % 分别为(<我nline-formula> 的意思是 ± 扫描电镜 ;数据未显示)。之间没有明显差异施加影响治疗和TI-treated对asc /(数字 1(一)- - - - - - 1 (f)),而对asc TI-treated HD /比未经处理的更强大的T细胞增殖抑制剂对asc HD /(数字 1(一)- - - - - - 1 (d)和 1 (f))。

健康的捐赠者对asc抑制T细胞增殖(HD)和病人。外周血单核细胞(PBMCs)获得9健康捐助者(HD)与PHA刺激和单独培养(控制)或cocultured 5天与未经处理或TNF +干扰素<我talic> γ(TI)刺激对asc从5 HD(高清/对asc)或10的病人(如对asc /)。CD4细胞的增殖+(a - c)和CD8+(d-f) T细胞通过流式细胞术分析。数据结果表明实验(<我nline-formula> n )。点确定文化之间的界限(a, d)包含对asc和PBMCs相同。(b-f)结果表示为中位数(水平线)和四分位范围(IQR盒),上下胡须(数据在3/2×差)和离群值(点)(图基的盒子)。<我nline-formula> ∗ P = 0.05 - - - - - - 0.01 ,<我nline-formula> ∗ ∗ P = 0.01 量 0.001 ,<我nline-formula> ∗ ∗ ∗ P = 0.001 量 0.0001 社会团体内部的比较(细胞cocultures比控制独立的文化和表示)。群际(HD与)微不足道的统计学差异。

 3.3。细胞间接触和可溶性的贡献因素对asc的抗增殖作用

coculture条件允许或防止(transwell)细胞间直接接触,未经处理和TI-treated对asc /同样减少了CD4细胞的增殖+(数据 2 (d)- - - - - - 2 (f))和CD8+(数据 3 (d)- - - - - - 3 (f))T细胞,而高清的抑制作用对asc /更强有力的transwell比细胞间接触文化,和这种差异是观察在CD4的情况下+(数据 2(一个)- - - - - - 2 (c))和CD8+(数据 3(一个)- - - - - - 3 (c))T细胞。这些结果指向分泌因素的关键介质对asc引发抗增殖效果。

比较对CD4 ASC抑制性影响+在接触和T细胞增殖transwell cocultures。PBMCs,孤立的从3健康献血者和PHA激活,对asc是单独培养(控制)或cocultured从4健康献血者(HD /对asc)或5的病人(如对asc /)条件允许细胞直接接触或transwell系统。治疗和肿瘤坏死因子+干扰素<我talic> γ-对asc (TI)治疗。CD4细胞的增殖+T细胞通过流式细胞术分析。数据结果表明实验(<我nline-formula> n ),显示为图基的盒子。<我nline-formula> ∗ P = 0.05 量 0.01 ,<我nline-formula> ∗ ∗ P = 0.01 量 0.001 ,<我nline-formula> ∗ ∗ ∗ P = 0.001 量 0.0001 比较细胞cocultures与控制分离的文化和表示。# # P = 0.01 量 0.001 联系的比较与transwell cocultures。

比较对CD8 ASC抑制性影响+在接触和T细胞增殖transwell cocultures。细胞的起源和文化条件如图 2,除了CD8 + T细胞进行了分析。<我nline-formula> ∗ P = 0.05 量 0.01 ,<我nline-formula> ∗ ∗ P = 0.01 量 0.001 ,<我nline-formula> ∗ ∗ ∗ P = 0.001 量 0.0001 比较细胞cocultures与控制分离的文化和表示。# P = 0.05 量 0.01 和# # # P = 0.001 量 0.0001 联系的比较与transwell文化。

 3.4。Upregulation犬尿氨酸和铂族元素<子> 2 < /订阅>对asc的Cocultures PBMCs

未经处理的PBMCs产生小中等数量的犬尿氨酸激活上升显著(<我nline-formula> 的意思是 ± 扫描电镜 ,<我nline-formula> 1.69 ± 0.25 vs。<我nline-formula> 2.56 ± 0.32 μ 摩尔 / 毫升 ,<我nline-formula> P = 0.0011 对未经处理的PBMCs与PBMCsPHA)。类似的,铂族元素的显著增加2水平被发现(没有分泌vs。<我nline-formula> 456.2 ± 163年 pg / 毫升 ,<我nline-formula> P = 0.016 对未经处理的PBMCs与PBMCsPHA)。根据我们之前的发现,对asc HD /和对asc /分泌犬尿氨酸(<我nline-formula> 2。5 ± 0.3 vs。<我nline-formula> 0.4 ± 0.2 μ 摩尔 / 毫升 ,<我nline-formula> P < 0.0001 )和铂族元素2(<我nline-formula> 134年 ± 27 vs。<我nline-formula> 357年 ± 120年 pg / 毫升 ,<我nline-formula> P = 0.35 )自发,对TI介质的释放增加预处理水平较低的类似发现在当前coculture实验(犬尿氨酸<我nline-formula> 4.3 ± 0.4 vs。<我nline-formula> 0.8 ± 0.3 μ 摩尔 / 毫升 ,<我nline-formula> P < 0.0001 ;铂族元素2 315年 ± 61年 vs。<我nline-formula> 811年 ± 246年 pg / 毫升 ,<我nline-formula> P = 0.23 )[ 24]。然而,这些指示性数据不能直接提到现在coculture条件,因为对asc起源于其他捐助者。相比之下,分别培养PBMCsPHAcocultures,这些细胞治疗和对asc TI-stimulated HD / /对asc,显著增加犬尿氨酸和铂族元素2生产观察(数字 4(一)和 4 (d))。对asc治疗相比,添加对asc TI-treated HD /触发明显高于一代犬尿氨酸发现了铂族元素(一个类似的趋势2分泌),而在TI-treated对asc /只有较高的铂族元素的释放2被发现。然而,之间没有显著差异的大小犬尿氨酸和铂族元素2海拔的HD /对asc和对asc /被发现。相比之下,在同一培养条件的分泌il - 10没有上升(图 3年代)。

Upregulation犬尿氨酸和前列腺素E2(铂族元素2)合成在接触和非接触cocultures PBMCs对asc。细胞制备和cocultured中描述的数据 1(一)和 1 (d)和数字 2 (b), 2 (c), 2 (e), 2 (f)。11 PBMCs外周血中分离的(一个)或5 - 7(中)健康献血者。5 HD / ASC线条和对ASC /获得12 (a)或5 - 7(中)患者使用。犬尿氨酸的浓度和铂族元素2在文化上清液测定中描述的材料和方法。数据显示为图基的盒子;进行实验的数量(<我nline-formula> n )所示。<我nline-formula> ∗ P = 0.05 量 0.01 ,<我nline-formula> ∗ ∗ P = 0.01 量 0.001 ,<我nline-formula> ∗ ∗ ∗ P = 0.001 量 0.0001 比较细胞cocultures与控制分离的文化和表示。# # P = 0.01 量 0.001 和# # # P = 0.001 量 0.0001 联系的比较与transwell文化。

 3.5。细胞间接触的贡献和可溶性因子Upregulation犬尿氨酸和铂族元素<子>对asc 2 < /订阅>

犬尿氨酸和铂族元素的高度2生产,未经处理的HD /对asc和对asc /在transwell显著高于细胞间接触cocultures PBMCsPHA,一个类似的趋势在cocultures包含对asc TI-treated(数字 4 (b), 4 (c), 4 (e), 4 (f)),这表明一个重要的角色upregulation可溶性因子的犬尿氨酸和铂族元素2。

 3.6。协会的可溶性因子的分泌对asc的抗增殖作用

如图 5的cocultures PBMCsPHA对asc TI-treated HD / /对asc,犬尿氨酸的浓度与增殖CD4的比例负相关+(e)和CD8+(b, f) T细胞。类似的关系对asc未经处理的AS /观察(图(图 4年代,电池板E、F)。然而,在HD /对asc的情况下,只有CD8统计学意义+,但不是CD4+细胞增殖(图 4年代,面板B和A,分别)。增殖CD4的百分比之间的负相关+和CD8+T细胞和铂族元素2分泌还发现,但由于少量的实验中,它并不总是达到统计学意义。然而,这是只注意到在TI-treated(数字 5 (c), 5 (d), 5 (h);类似的趋势(g))但不是未经处理的(图 4年代,电池板C, D、G H对asc)。相比之下,分泌的il - 10未能表现出负相关与T细胞增殖(图的数量 5S), cocultures PBMCsPHA对asc HD /“透明国际”分泌的il - 10甚至积极增殖CD4的数量相关+T细胞(图 5年代,面板C)。这些结果指出犬尿氨酸和铂族元素2,但不是il - 10对asc介质的抗增殖能力的可能性。要验证这一点,我们执行的选择性抑制剂阻断实验犬尿氨酸(1-MT)和铂族元素2(吲哚美辛)一代使用(数据 6和 7)。

犬尿氨酸和铂族元素的相关性2浓度与扩散T细胞的数量。PBMCs与PHA刺激与TNF cocultured +干扰素<我talic> γ-(TI)治疗对asc从高清(模拟)和病人(情况)。CD4细胞的增殖+(a, c, e, g)和CD8+细胞(b、d、f、h)评估,和犬尿氨酸的测定和铂族元素2浓度在材料和方法进行描述。斯皮尔曼等级(<我nline-formula> Rs )(a, b, e, f)和皮尔森(<我nline-formula> R )(c, d、g h)和相关系数<我nline-formula> P 值显示。在图的其他解释 1。

犬尿氨酸的选择性抑制剂(1-MT)和铂族元素2抵消(吲哚美辛)合成的抑制作用对asc CD4细胞的增殖+T细胞。细胞制备和文化条件如图 1。浓度和时间的细胞治疗1-MT和消炎痛(印度)中描述的材料和方法。数据显示为图基的盒子;进行实验的数量(<我nline-formula> n )所示。<我nline-formula> ∗ P = 0.05 量 0.01 ,<我nline-formula> ∗ ∗ P = 0.01 量 0.001 ,<我nline-formula> ∗ ∗ ∗ P = 0.001 量 0.0001 比较细胞cocultures与控制独立的文化。# P = 0.05 量 0.01 ,# # P = 0.01 量 0.001 ,# # # P = 0.001 量 0.0001 比较的抑制剂与未经处理的cocultures治疗。在图的其他解释 1。

犬尿氨酸的选择性抑制剂(1-MT)和铂族元素2(吲哚美辛)合成的抑制作用抵消对asc CD8的扩散+T细胞。细胞制备、培养条件、浓度和时间的细胞治疗1-MT和吲哚美辛如图(印度)和其他的解释 6,除了CD8 + T细胞进行了分析。

1-MT和吲哚美辛部分,但值得注意的是,废除TI-treated HD /对asc CD4细胞的抗增殖效果+和CD8+细胞,增加增殖细胞的数量以及扩散和复制指数。相比之下,应用抑制剂未能扭转弱抑制作用对asc未经处理的HD /施加于这些细胞的增殖(数字 6(一)- - - - - - 6 (c)和数字 7(一)- - - - - - 7 (c)分别)。至于对asc的抗增殖能力,1-MT中和TI-treated细胞CD4的影响+(数据 6 (d)- - - - - - 6 (f))和CD8+(数据 7 (d)- - - - - - 7 (f))T淋巴细胞数量显著增加T细胞增殖和/或扩散和复制指标,分别。反过来,消炎痛几乎完全恢复增殖CD4的数量+和CD8+细胞显著减少在TI-treated和未经处理的存在对asc /。

 3.7。对自体PBMCs作为对asc /的免疫调节作用

比较同时执行cocultures未经处理和TI-treated对asc /与同种异体或自体PBMCsPHA表明,在这两个系统对asc /对CD4施加类似的抗增殖的影响+和CD8+T细胞(图 8(一个)- - - - - - 8 (f)),以及犬尿氨酸和铂族元素的浓度升高2(数据相似的水平 8 (g)和 8 (h)分别)。此外,TI-treated对asc /甚至引发了明显高于增加的犬尿氨酸cocultures自体的同种异体PBMCs(图 8 (g))。

免疫调节作用的比较是对asc / cocultured同种异体和自体PBMCs。细胞制备和cocultured图中描述 1。同种异体和自体PHA-activated PBMCs作为靶细胞。数据显示为图基的盒子;进行实验的数量(<我nline-formula> n )所示。<我nline-formula> ∗ P = 0.05 量 0.01 ,<我nline-formula> ∗ ∗ P = 0.01 量 0.001 ,<我nline-formula> ∗ ∗ ∗ P = 0.001 量 0.0001 比较细胞cocultures与控制分离的文化和表示。# P = 0.05 量 0.01 同种异体和自体cocultures的比较。

 4所示。讨论

已是不争的msc扮演了一个重要的免疫调节作用的阻尼各种免疫细胞的激活,包括T淋巴细胞,单核细胞/巨噬细胞和树突细胞。在众多监管活动中,免疫抑制msc对T细胞增殖的影响已经证实体外和体内条件( 10- - - - - - 14, 32, 38]。在强直性脊柱炎,T细胞扩张,注意到本地和在边缘,被认为发挥致病作用[ 4- - - - - - 9]。重要的是,BM-MSCs的病人有一些功能缺陷和被认为有助于病理骨内稳态( 16- - - - - - 21]。值得注意的是,骨髓是更容易比脂肪组织慢性炎症。所有这些观察结果可能表明减少自体BM-MSCs作为的治疗效用。大量数据表明,msc不同组织来源的免疫调节功效并不平等,脂肪tissue-derived msc(对asc)具有较强的免疫抑制特性比BM-MSCs [ 14, 39]。不幸的是,对asc的病人在这方面还没有被调查。我们之前的研究结果表明,至少有一些/ ASC属性可能会改变,因为减少了基础水平的一些表面的分子,即。,CD90 and intracellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) on AS/ASCs, impaired basal secretion of kynurenines and galectin-3 by these cells, but the normal capability to regulate expression of activation markers on allogeneic T cells was revealed [ 25, 26]。因此,在本研究中,我们进一步评估的功能对asc /通过调查控制T细胞的增殖能力,使用高清/对asc作为参考细胞系。重要的是,我们发现在异种系统对asc HD /和对asc /抑制增殖CD4的数量+和CD8+T细胞具有类似能力(数据 1(一)和 1 (d))。此外,显著减少分歧/增殖CD4的数量+和CD8+细胞也被观察到的数据 1 (b)和 1 (e)),因此,这两个事件导致T细胞扩张(数据的减少 1 (c)和 1 (f))。我们的结果是一致的与他人的观察MSC属性一般( 10- - - - - - 14, 40, 41),但示威一样对asc /有效抑制同种异体CD4细胞的扩散+和CD8+T细胞是一个新发现。

提供成功的免疫调节,msc采用直接的细胞间的相互作用和溶性因素( 10, 11, 14, 42, 43]。类似于其他报告( 34, 44),我们观察到的抗增殖作用对asc HD /对asc和CD4细胞+和CD8+主要由溶性T细胞是介导因素(数字 2和 3)。进一步的实验确定犬尿氨酸和铂族元素2对asc作为关键贡献者的抗增殖作用的健康的捐赠者和病人。首先,我们发现犬尿氨酸和铂族元素的浓度2(数据 4(一)和 4 (d)),但不抗炎cytokine-IL-10(图 3,大幅提高PBMCs coculturesPHA与未经处理的以及对asc TI-stimulated高清对asc /, /。其次,在TI预处理对asc HD /对asc /,这两个因素的浓度,特别是犬尿氨酸,反向与增殖CD4的数量+和CD8+细胞(图 5),而没有这样的协会在il - 10(图中被发现 5。最后,对asc HD /抗增殖的影响对asc /部分,但值得注意的是,废除犬尿氨酸和铂族元素的选择性抑制作用2代(数据 6和 7)。我们的观察是一致的与其他报告证明最关键作用的犬尿氨酸通路对ASC人类T细胞增殖的抑制作用 32, 44, 45]。在这个通路,吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)异化必需氨基酸色氨酸(Trp),导致当地Trp剥夺和犬尿氨酸生成,最终导致T细胞增殖,抑制细胞凋亡和形成Treg细胞( 46, 47]。犬尿氨酸通路可以被模拟,Trp 1-methyl-tryptophan (1-MT)结合被罩亚铁复杂,但由于额外的甲基,不能催化地转换成犬尿氨酸( 48]。也类似于犬尿氨酸通路,PGE2据报道,调解各种类型的msc的抗增殖作用的T细胞( 49- - - - - - 51]。前列腺素E2,最有效的前列腺素家族成员之一,众所周知,调节T细胞激活大量的事件,包括细胞周期阻滞( 52]。像其他前列腺素类、铂族元素2从花生四烯酸是合成代谢途径依赖环氧合酶(COX)同功酶的酶活性,主要COX-1和COX - 2 ( 53]。非甾体类抗炎药吲哚美辛,是一种非选择性抑制剂COX-1和cox - 2的活动,因此,抑制前列腺素的生成( 51]。有趣的是,铂族元素2据报道,引起油/犬尿氨酸通路耐受性树突状细胞及协同这一途径的免疫抑制NK细胞的msc ( 36, 54]。因此,这两种方式可以合作中介对asc在T细胞的抗增殖作用。基于目前阻断实验和相关分析的结果对各种类型的报告和符合其他msc ( 44, 45, 49, 50),我们指出犬尿氨酸和铂族元素2的抗增殖作用的重要介质不仅对asc HD /还对asc /。

应该澄清,因为两个PBMCsPHA对asc和犬尿氨酸生成和铂族元素2,在我们的实验设置,1-MT和吲哚美辛都呈现在整个细胞coculture的时期。如前所述在结果(部分 3所示。4),基底犬尿氨酸和铂族元素的释放2通过休息PBMCs很低,在PHA-treatment显著升高,进一步增强在未经处理和对asc TI-treated HD / /对asc(数据 4(一)和 4 (d))。另一方面,我们曾报道,高清/对asc相比,自然发生的犬尿氨酸对asc /受损,而基底合成铂族元素2是正常的。同时,我们注意到,这些差异对asc /对asc和HD /持续甚至在TI刺激大大提升了一代的犬尿氨酸和铂族元素2( 26]。然而,尽管基底差异观察在不同的文化中,目前的结果表明,在cocultures与靶细胞对asc /至少生产高清对asc /(数字 4(一)和 4 (d))。

如前所述,msc免疫调节的执行可能是一个复杂的过程,涉及各种可溶性介质以及直接msc与免疫细胞的交互。transwell系统相比,在细胞联系cocultures, T细胞增殖抑制的程度和水平的免疫抑制介质由于复杂、多向msc和不同类型的细胞之间的相互作用在PBMCs池。结果显示(图 2和 3),高清的抑制作用对asc / T细胞增殖是细胞接触低于transwell cocultures,暗示的高清互动与其他细胞类型对asc /可能抵消,因此监督,这些细胞的抗增殖作用。类似的观察趋势的情况对asc /,但无足轻重的差异,表明弱控制这些细胞的活动。提供prosurvival信号可能会导致这个事件。例如,据报道,在PBMCs-ASCs coculture T, B,和NK细胞对asc坚持,和部分绑定保存在一个激活T细胞,增殖状态。有趣的是,这些细胞表达高水平的endoglin开关转化生长因子<我talic> β(TGF<我talic> β从反proproliferative通路)信号 55]。此外,BM-MSCs发现支持B细胞生存能力通过直接细胞接触,导致upregulation血管内皮生长因子(VEGF)保护B细胞与细胞凋亡 56]。与MSC cocultures的单核细胞,甚至MSC单层的密度可以生成prosurvival信号,因为单层密度的减少是紧随其后的是增加存在剂量依赖的相关性在淋巴细胞增殖 57]。最后,各种表面分子的表达水平较低,调节细胞间接触和导致的免疫抑制特性msc ( 58)也会影响msc的抗增殖活动,这是证明在CD90 [ 59]。尽管我们发现,一般来说,高清对asc /对asc和施加类似的抑制对T细胞增殖的影响,主要是通过可溶性因子,犬尿氨酸和铂族元素2这些细胞株之间的差异,有些也被观察到。首先,TI-priming显著增强对asc HD /抗增殖的影响,但对asc /, CD4细胞+和CD8+细胞(图 1)。同样,逆犬尿氨酸的浓度之间的相关性和增殖CD4的数量+和CD8+细胞在包含TI-licensed cocultures(数据更明显 5(一个)和 5 (b)比未经处理的高清对asc /(图) 3年代,电池板A、B)。相比之下,在cocultures包括未经处理和对asc TI-treated,这些协会可比数据 5 (e)和 5 (f)对比图 4年代,电池板E、F)。因此,作为对asc /似乎不如HD /敏感对asc TI-triggered增强的功能。msc与促炎细胞因子的启动,一个过程叫“许可”,是为数不多的几个策略来生成高度功能性msc治疗应用程序( 39]。与肿瘤坏死因子对asc许可和/或干扰素<我talic> γ据报道,增强这些细胞的免疫抑制作用,包括抑制T细胞增殖的 60, 61年),这是符合目前对asc HD /相关的结果。这个过程被认为模仿组织炎性环境,以促进msc的免疫调节功能( 39]。因为对asc是病人受到体内慢性炎症微环境,对asc和体外敏感TI-licensing健康的捐赠者,他们大概体内许可对成熟的抗增殖能力的细胞。

有趣的是,阻断实验的相关分析,结果表明,犬尿氨酸和铂族元素的贡献2健康的捐赠者的抗增殖活动对asc和患者不公平。虽然犬尿氨酸和铂族元素2被发现的重要介质活动对asc TI-primed HD /(数据吗 5(一个)- - - - - - 5 (d), 6(一)- - - - - - 6 (c), 7(一)- - - - - - 7 (c)),他们打小,如果有的话,中介作用较弱的抗增殖作用治疗对asc HD /(数字 6(一)- - - - - - 6 (c), 7(一)- - - - - - 7 (c),3 s板模拟)。关于对asc /、犬尿氨酸是TI-treated的抗增殖活性的介质,在较小程度上,也未经处理的细胞增殖反应的影响所有测试参数(数字 5 (e)- - - - - - 5 (h), 6 (d)- - - - - - 6 (f), 7 (d)- - - - - - 7 (f), 3年代,电池板E, F),而铂族元素的贡献2这些细胞的功能受到限制,因为消炎痛中和未经处理的抑制作用和TI-treated对asc /只增殖T细胞的数量(数字 6 (d)- - - - - - 6 (f)和 7 (d)- - - - - - 7 (f))。

因为它曾被报道,体外preactivated T细胞部分和时间的方式,对asc耐抗增殖作用( 62年),我们最后检查是否对asc /可以抑制自体T lymphocytes-the细胞长期暴露在体内扩散的炎性环境。目前的结果表明,与同种异体和自体PBMCs cocultures,对asc /抑制CD4细胞的增殖反应+和CD8+T细胞具有类似能力(数据 8(一个)- - - - - - 8 (f))。此外,在同种异体和自体cocultures类似的铂族元素的浓度2被发现(图 8 (h)),在自体和犬尿氨酸代甚至高于同种异体的条件(图 8 (g))。

我们的研究有一些局限性。由于控制策略,我们使用,小污染CD4 +和CD8 +子集不能排除其他人群。

 5。结论

总之,我们的报告,第一次,间充质干细胞来源于脂肪组织的强直性脊柱炎患者(如对asc /)是同种异体和自体CD4的有效抑制+和CD8+T细胞,类似于从健康同行捐助者(HD /对asc),发挥抗增殖效果主要是通过溶性因素(犬尿氨酸和铂族元素2)。此外,一些区别的抗增殖活动对asc HD /对asc和建议后者细胞的体内许可。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

我们感谢所有为我们研究患者捐赠他们的脂肪组织。本研究由国家科学中心的财务支持波兰(批准号2016/21 / B / NZ5/00500)和核心资助(批准号/ 6)到NIGRR从波兰科学和高等教育。

 补充材料

图1:典型的直方图显示PHA-triggered外周血单核细胞的增殖(PBMCs)在各种文化变体:(A) CD4 +细胞的增殖;(b) CD8 +细胞的扩散。对asc:脂肪间充质干细胞;TI: TNF +干扰素<我talic> γ细胞治疗。图2 s: T细胞增殖抑制的程度取决于PBMCs捐献者。两个高清对asc /线(A、C)和两个对asc /线从2例(B, D) cocultured PBMCs的四个不同的捐助者(捐助者1 - 4)。Coculture条件如图 1。图3 s:分泌il - 10的PHA-stimulated外周血单核细胞单独培养(PBMCs)或与健康的捐赠者对asc cocultured (HD /对asc)和病人(如对asc /)。细胞制备和培养条件中描述的材料和方法。治疗和肿瘤坏死因子+干扰素<我talic> γ对asc (TI)治疗。没有明显差异的控制单独的PBMCs和细胞cocultures文化。#<我nline-formula> P = 0.05 量 0.01 对群际(HD与)比较。图4 s:犬尿氨酸和铂族元素的相关性2浓度与扩散T细胞的数量。CD4细胞制备、培养条件、评价+(A, C, E, G)和CD8+(B、D、F、H)细胞增殖,和犬尿氨酸和铂族元素的测量2浓度如图 5,除了,只有对asc未经处理的。斯皮尔曼等级(<我nline-formula> Rs )(A, B, E, F)和皮尔森(<我nline-formula> R )(C, D、G H)和相关系数<我nline-formula> P 值显示。在图的其他解释 1。图5 s:缺乏逆相关,il - 10浓度与扩散T细胞的数量。CD4细胞制备、培养条件和评价+(A, C, E, G)和CD8+(B、D、F、H)细胞增殖在未经处理的存在和对asc TI-treated在图5和4 s,分别。il - 10在文化上层清液浓度的测量是执行中描述的材料和方法。皮尔森(<我nline-formula> R 相关系数和<我nline-formula> P 值显示。在图的其他解释 1。

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