贝格尔犬(Beagle dog)，雄性，3月龄，来自广州医药综合研究所，饲养于恒温恒湿无菌条件下，光照12 h /暗12 h循环。所有动物实验均按照华南理工大学医学院动物实验委员会的指导方针进行。从尿液中收集和扩大超滤泡的方法已在前面进行了描述，但略有改进[ 1］．简而言之，从6只比猎犬犬收集尿液样品，每个样品以500g离心5分钟以收集细胞。The pellet was washed in buffer containing 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) with Penicillin/Streptomycin, 0.5 mg/ml Amphotericin B. These cells were gently resuspended with primary culture medium composed of keratinocyte-serum free medium and progenitor cell medium in a 1 : 1 ratio. Cells were then plated to 24-well plates coated with 1% gelatin solution. During the first 72 hours, 1 ml primary culture medium was changed. Then, medium was changed and REGM was added until cells were expanded above 70% of the plate. USCs were plated at low density ( 4. × 10. 3. 细胞/ cm.²)及高密度( 40 × 10. 3. 细胞/ cm.²)。48小时后，去除未贴壁细胞，新鲜培养基替换现有培养基。10天后，这些细胞将用于后续实验。

进行QRT-PCR以测量在不同培养基中培养的USCs的基因表达。使用Transzol Up Plus RNA试剂盒（ER501-01，Transgen Biotech，China）分离总RNA。然后使用Primescript RT主混合物试剂盒（Takara Bio）将RNA逆转录成单链cDNA。使用ABI棱镜7500序列检测系统（应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚，美国）和SYBR绿色实时PCR主混合物进行QRT-PCR分析。在三种独立实验中，所有反应一式三份运行。使用使用的引物列出。

Western blot检测蛋白表达。简单地说，用含有蛋白酶体抑制剂的蛋白提取法对USCs进行裂解和总蛋白分离。使用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Scientific, 23228, Rockford, IL)测定裂解液中的蛋白浓度。在阻断缓冲液中与一抗和二抗孵育后，用ECL Plus Western Blot检测系统(GE Healthcare, UK)对目标蛋白进行成像。免疫反应条带通过扫描密度仪软件(NIH, Bethesda, MD, USA)进行定量，蛋白表达水平与管家基因GAPDH标准化。所有的实验都在几天内重复了三次。

用胰蛋白酶(Gibco-BRL)分离USCs，并以适当浓度扰乱为单细胞悬液。根据人MSC分析试剂盒(BD Biosciences)的说明书，将试管标记为抗小鼠CD24、CD29、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105、CD133和SSEA-4的单克隆抗体，置于冰上黑暗中30分钟。用染色缓冲液洗涤后，用500 mL PBS重悬，用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)分析样品。

我们使用验证过的小干扰RNA (siRNA) (#AM16708, Invitrogen;根据制造商的说明书，Thermo Fisher Scientific, Inc)针对ILK信使rna (mRNAs)。简单地说，USCs被播种在6孔板上并培养到50%汇合;然后用100 nM的siRNA转染这些细胞，用于ILK或siRNA阴性对照(#AM4611, Invitrogen;赛默飞世尔科学公司)。转染48小时后，在缺乏血清和抗生素的培养基中收集细胞并进行分析。为了分析敲除效率，我们使用qRT-PCR或Western blotting观察ILK表达在24小时内的抑制情况，并且在去除含有siRNA的培养基后，这种敲除至少维持72小时。

为了诱导ILK过度表达，USCS与0.4孵育  μmol / L LPTP (L - α- 磷脂酰-D-肌醇3,4,5-三磷酸，二辛酰基，σ），是一种有效和选择性的ILK激动剂。在药物处理后2小时，收集细胞和上清液，用于Western印迹分析和后续实验。同样，使用脂多糖（LPS）（圣路易斯，Mo，USA），革兰氏阴性细菌的成分，用于激活NF- κB通路。LPS浓度为100 ng/ml;孵育24小时后，收集细胞进行后续实验。

USCs在室温下固定在4％多聚甲醛中20分钟;在37℃下封闭缓冲液（5％山羊血清，0.01％（ V. / V. ）PBS中的Triton X-100），将样品用初级抗体在4℃下孵育过夜：ILK（AB76468，ABCAM，1：200），DESMIN（AB32362，ABCAM，1：100）和SMN（AB5831，ABCAM，1：100）。用PBS洗涤后，将样品与二抗（AB150077，ABCAM，1：500;或AB150113，ABCAM，1：500）缀合，然后用DAPI染色（在TNE缓冲液中25mg / ml：10mmol / L Tris-HCl，2mol / L NaCl，1mmol / L EDTA，pH 7.4;分子探针）。根据制造商的说明，使用FV1000激光扫描共聚焦显微镜（奥林巴斯，日本）捕获图像。

所有值都表示为 意思 ± 标准 偏差 SD. ．使用单向ANOVA和学生评估统计差异 T. - 适用的地方。使用SPSS统计数据20进行统计分析。 P. 小于0.05的值被认为是显著的。

从狗尿液中分离的祖细胞分别以高密度和低密度培养（图 1（a））.流式细胞术用于检测这些细胞的标记表达;我们发现USCs对多能干细胞标志物SSEA-4，CD29，CD90和CD24具有强烈阳性，CD31，CD133和CD105弱阳性。此外，一般造血细胞标记物CD45和内皮谱系标记CD31和CD34为阴性（图 1（b））.为了测试细胞 - 细胞粘附是否会影响USCS对SMC的分化，USC在低密度和高密度下镀层。免疫染色的结果表明肌原素蛋白水平 α-smooth肌肉肌动蛋白（ αSMA）和SM22显然增加（图 1（c））.此外，Calponin的蛋白质和mRNA水平， αSMA和SM22被Western印迹和QRT-PCR检测;我们发现，这些源性标记物的表达明显增加了高密度培养物（图 1（d）和图 1 (e)）.这些结果表明，高细胞密度可以促使USCS分化为SMC。

在我们之前的蛋白质组学分析中，我们观察到包括ILK在内的几种蛋白的蛋白水平在早期SMCs分化的USCs中显著升高。为了进一步证实这些发现，我们进行了以下实验。培养10天后，免疫染色显示ILK在高密度细胞中的表达明显高于低密度细胞(图) 2（a））.Western印迹表明，与低密度培养的那些相比，ILK的蛋白质水平在高密度以高密度培养的细胞中增加（图 2 (b)）.在协议中，QRT-PCR显示ILK mRNA水平也增加（图 2 (c)）.最后，在SMCs从USCs分化的过程中，随着细胞密度的增加，ILK的蛋白和mRNA水平被上调，在第5天达到最大值(图) 2 (d)和 2 (e)）.

为了研究ILK对USC的肌遗传分化的影响，将这些细胞在分化培养基中孵育，或没有0.4  μmol/L LPTP是一种有效的选择性ILK激动剂。结果表明，LPTP能增加ILK的表达;Western blot和qRT-PCR显示calponin， α分别在LPTP孵育后上调SMA和SM22蛋白和mRNA水平（图 3(一个)和 3 (b)）.另外，siRNA用于敲击ILK。如Western Blotting和QRT-PCR所示，敲击ILK对USCS分化，Calponin， αSMA和SM22蛋白和mRNA水平显着减少（图 3 (c)和 3 (d)）.占用，这些数据表明，USCS必须区分SMC所必需的ILK。

作为之前的研究表明，SMCS的分化涉及NF- κB信令路径[ 14.];因此，我们想知道ILK是否可以通过该信号传导途径的规定促进SMC分化基因表达。通过检查NF-的mRNA表达水平 κB，我们发现ILK过表达可以显著上调NF- κb p50表达，同时没有对nf-的效果 κB p52和p65表达(图 4(一)）.在LPTP孵育后，我们发现ILK的过度表达明显不受调节NF-的磷酸化水平 κB组分p50，不影响p50总蛋白水平(图 4 (b)）.此外，我们还观察到LPS可以激活NF- κB通路，几乎可以增加ilk诱导的平滑肌特异性标记物的表达。免疫染色显示，LPS处理显著上调SM22的水平(图 4 (c)）.此外，LP可以增加平滑肌特异性标记蛋白和mRNA水平的表达。然而，如果ilk撞击，则不会发生LPS对平滑肌特异性标记的影响（图 4 (d)）.这些结果表明，NF- κB信号通路参与ILK刺激USCs向SMCs分化。