SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/6631905 6631905 研究文章 比较人类Dental-Derived干细胞成骨分化潜能的牙髓隔绝,牙周韧带,牙科卵泡,牙槽骨 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7061 - 7899 曲 Guanlin 1 2 李 杨ydF4y2Ba 2 陈 陆 2 陈 清ydF4y2Ba 2 邹 Duohong 2 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1630 - 5389 杨 气 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2007 - 8054 周 清 1 王 唐爱军 1 口腔颌面外科 学校和医院口腔修复 中国医科大学 辽宁省重点实验室的口腔疾病 沈阳 辽宁 中国 cmu.edu.cn 2 口腔外科学系 上海第九人民医院 上海交通大学医学院;口腔学学院 上海交通大学;国家中心口腔学;口腔疾病国家临床研究中心;上海口腔学重点实验室;口腔颌面再生医学的研究单位 中国医学科学院 上海 中国 cacms.ac.cn 2021年 8 4 2021年 2021年 10 10 2020年 10 3 2021年 24 3 2021年 8 4 2021年 2021年 版权©2021瞿Guanlin et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。间充质干细胞(msc)已经成为有前途的候选人为再生医学由于multidifferentiation潜力和免疫调节能力。与经典的msc来源于骨髓和脂肪,dental-derived msc显示高塑性,可访问性和适用性。因此,它们被认为是再生医学的替代来源。 方法。四种类型的msc被孤立于牙髓、牙周韧带,牙科卵泡,和牙槽骨的捐赠,有五个不同的个体。我们分析了他们的形态,immunophenotype、增殖率、凋亡,trilineage分化潜能,在成骨分化和基因表达。 结果。PDLSCs,我们的研究表明,DPSCs DFPCs和ABMMSCs相似的形态学和immunophenotype展出。DFPCs显示较高的增殖和细胞凋亡。在trilineage分化培养基培养时,所有类型的msc骨生成的分化潜能,脂肪形成,软骨形成。通过染色过程中成骨诱导和遗传分析,ABMMSCs PDLSCs显示,成骨的能力最高,其次是DPSCs, DFPCs是最低的。 结论。总的来说,我们的研究结果表明,不同的dental-derived干细胞具有不同的生物学特性。骨组织工程,ABMMSCs PDLSCs可作为种子细胞的最佳候选人。

 科技计划项目 20-205-4-052 自然科学基金计划 2020 - ms - 175 2019 - zd - 0775 摄像头对医学科学创新基金 2019 - i2m - 5 - 037 上海市医院新兴前沿技术的关键项目 SHDC12017101 中国国家自然科学基金 81870785 1。介绍

在临床治疗骨再生是一个具有挑战性的问题。有多种原因,如创伤、先天异常,或肿瘤切除,可以破坏骨并导致功能障碍。到目前为止,自体组织移植提供了一种可能的治疗方法与功能重建手术的发展( 1]。然而,由于供体不足等缺陷组织来源和伤口感染,功能重建是有限的( 2]。近年来,骨组织工程基于干细胞,生物材料,生物活性大分子在骨缺损的重建成为一个新的领域和种子细胞的选择是一个关键因素( 3]。理想的种子细胞应具备的优点包括范围广泛的来源,容易提取,迅速扩张,multilineage分化潜能。另外,干细胞应该显示的能力结合脚手架材料稳定,形成一个合适的微环境 4]。

间充质干细胞(msc)是多能祖细胞,可以分化成不同类型的血统,包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、上皮细胞、neuron-like细胞,hepatocyte-like细胞( 5]。这些特点使得msc具有吸引力再生医学治疗,尤其是骨缺损的修复和重建。此外,由于低免疫原性和重要的免疫调节能力,msc治疗应用被认为是理想的候选人。从骨髓首次成功隔离后,msc随后被孤立的从不同的其他组织,如脂肪组织,脐带,羊膜,牙齿,滑膜 6- - - - - - 10]。近年来,dental-derived msc备受关注,由于其可塑性,可访问性和适用性。然而,组织再生的理想dental-derived msc仍有待阐明。

到目前为止,各种各样的msc从牙科组织分离和特征,包括牙髓干细胞(DPSCs) [ 11(PDLSCs)[],牙周韧带干细胞 12),牙科卵泡祖细胞(DFPCs) [ 13),肺泡bone-derived msc (ABMMSCs) [ 14),从人类脱落乳牙干细胞(棚) 15(SCAP)[],顶端乳头状干细胞 16),牙胚祖细胞(TGPCs) [ 17),牙龈msc(业务) 18]。因为骨髓间充质干细胞(BMMSCs)已广泛应用于临床治疗,dental-derived msc的特点通常是与BMMSCs相比。类似于BMMSCs, dental-derived msc可以分化成三种类型的细胞谱系,至少他们也表现出不同的特征。此外,dental-derived msc显示免疫调节和抗炎特性的优势在当地环境 19]。然而,没有研究系统DPSCs的特点相比,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs,可以很容易地从提取获得第三臼齿及其周围组织。

在这项研究中,我们取代传统BMMSCs ABMMSCs可以获得较低的创伤和形态进行了系统比较,immunophenotype,增殖率,antiapoptosis能力,和DPSCs trilineage分化潜力,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs。成骨的能力和基因表达模式四种类型的干细胞的成骨的过程比较评估其临床应用潜力在修复骨缺损提供理论支持的选择最好的骨组织工程的种子细胞。

 2。材料和方法 2.1。细胞隔离和文化

健康的牙齿和牙槽骨样本来自提取的第三臼齿和捐助者16 - 20岁。每种类型的MSC来自同一个捐赠者被用于以下实验中,有五个不同的个体。所有的程序都是研究伦理委员会批准的上海交通大学医学院(sh9h - 2020 tk60 - 1)。DPSCs的隔离、PDLSCs DFPCs,牙髓组织,牙科毛囊组织,三分之一的牙周韧带组织在根表面是用磷酸盐(PBS)洗净,切成小块的1 - 2毫米3。然后,他们与3毫克/毫升I型胶原酶消化(美国σ)40分钟37°C。在那之后,组织于70年通过 μm过滤器(美国热科学);然后,悬挂在1200转离心5分钟。细胞颗粒resuspended MEM - α介质(Biolnd,以色列)含20%胎牛血清(Biolnd的边后卫,以色列)和100 U /毫升penicillin-streptomycin (Beyotime,中国),然后被镀成菜。ABMMSCs隔离的,牙槽骨碎成小块,播种在菜肴使用相同的媒介。所有类型的细胞在37°C在湿润的气氛中孵化有限公司为5%2。在80%左右融合,细胞分离0.25%胰蛋白酶(Beyotime,中国)和分裂的比率1:3。中所有类型的细胞每3天刷新。细胞通过3是用于进一步的实验。

 2.2。流式细胞术

msc在通道3的四种类型被trypin-EDTA收获(美国σ),在1200转离心5分钟。然后,细胞颗粒在PBS resuspended和转移到测试管。分析了immunophenotype以下抗体:FITC-conjugated CD24、CD29、CD44、CD45、和CD73 PE-conjugated CD34, CD90、CD105, CD146。相应isotype-matched抗体被用作控制。所有抗体购自BD生物科学(美国新泽西州)。细胞培养在黑暗中收集的30分钟,流式细胞分析仪。分析的结果是使用Cell-Quest麦金塔电脑软件。

 2.3。TUNEL染色

msc在细胞培养的幻灯片,直到达到80%汇合,然后替换为无血清培养基为24小时。然后,他们被固定为4% PFA 30分钟,与PBS洗3次。然后,我们遵循制造商的指令TUNEL检测设备(Servicebio,中国)和荧光显微镜下拍照。红灯代表凋亡细胞核通过TUNEL染色,和蓝色光被DAPI染色的细胞。红色荧光细胞的数量的百分比蓝色荧光细胞的数量代表总细胞凋亡细胞的比例。

 2.4。细胞增殖

根据制造商的指示,细胞计数Kit-8 (Dojindo、日本)是用于检测细胞增殖。四种类型的msc被播种在96 -孔板(美国康宁公司)的密度 3 × 10 3 细胞/好,每一个含有100 μl αmem的边后卫为10%。孵化后第一个24小时,细胞数量每24小时连续七天测试。确定数量的msc、10 μL CCK-8试剂添加到每个好然后孵化2小时37°C。光密度值波长450纳米检测与Multiskan(美国热科学)。每个实验中执行三个复制。

 2.5。脂肪形成的分化

脂肪形成的差异化,四种类型的msc被播种在每个6-well板的密度 2 × 10 5 细胞/和维护在MEM - α中含有10%的边后卫。confluency当细胞达到100%,与脂肪形成的分化培养基中取代了(美国Cyagen)根据制造商的指示和21天。合成的脂质滴分化细胞被发现使用油红染色(美国Cyagen)。

 2.6。Chondrogenic分化

chondrogenic分化, 5 × 10 5 细胞在15毫升离心聚丙烯管(美国康宁公司)和500年resuspended μL chondrogenic分化培养基(美国Cyagen)。每3天中被刷新。21天后,细胞颗粒固定在4% PFA然后切成石蜡切片5 μ米厚度。评估粘多糖沉积,与阿尔新蓝染色的部分(美国Cyagen)。

 2.7。成骨分化

对于成骨分化,msc被播种在每个6-well板的密度 1 × 10 5 细胞/和维护在MEM - α中含有10%的边后卫。细胞融合达到60 - 70%时,介质被替换为成骨分化培养基(美国Cyagen)。细胞被播种在成骨分化培养基为21天,每3天刷新中。

 2.8。高山活动染色和化验

成骨分化后,msc被高山染色检测工具(中国建成生物技术)和高山活动分析工具包(Solarbio,中国),3天,7和14。高山染色的细胞被孵化20分钟解决方案在37°C。扫描仪(惠普、中国)是用于获取数字图像。高山活动规范化的蛋白质浓度。标准协议后,蛋白质提取使用里帕裂解缓冲(美国σ)和由布拉德福德蛋白质浓度测定分析工具包(Sangon生物技术,中国)。

 2.9。茜素红染色和钙沉积量化

成骨分化后21天,msc被发现的矿化结节利用茜素红染色(美国Cyagen)的解决方案。这些细胞被固定在4% PFA 30分钟和孵化与茜素红染色溶液在室温下。5分钟后,反应是然后用PBS停在洗。扫描仪和显微镜是用来捕捉数字图像。与茜素红染色后,钙结节溶解10%党和孵化在37°C 30分钟。然后,上层清液被转移到一个96孔板,和590海里的吸光度测量统计分析。

 2.10。RNA提取和存在

总RNA提取利用RNAiso +(豆类、日本)trilineage msc分化。RNA浓度和纯度测定使用Multiskan(美国热科学)。互补脱氧核糖核酸合成的RNA通过使用retrotranscription工具包(豆类、日本)。定量实时聚合酶链反应(存在)进行混合使用SYBR绿色我的主人(豆类、日本)和运行LightCycler 96(罗氏,CH)。引物序列表中列出 1。每个基因的相对表达了使用2- - - - - - ΔΔCt获得的值正常化 β肌动蛋白的RNA作为内部控制。

所有的引物用于存在。

基因 转发(5 ′ 3 ′ ) 反向(5 ′ 3 ′ )
RUNX2 TGGTTACTGTCATGGCGGGTA TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA
高山 GTGAACCGCAACTGGTACTC GAGCTGCGTAGCGATGTCC
OCN GAAGTTTCGCAGACCTGACAT GTATGCACCATTCAACTCCTCG
OPN GAAGTTTCGCAGACCTGACAT GTATGCACCATTCAACTCCTCG
COL-1 TGCTCGTGGAAATGATGGTG CCTCGCTTTCCTTCCTCTCC
OSX CCTCTGCGGGACTCAACAAC AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG
比例导引 GGCTTTCCGGGAATCCAAGG TGGGGATAGTAACGTAAGTCTCC
C / EBP α GTGGACAAGAACAGCAACGA GGTCATTGTCACTGGTCAGC
FABP4 ACTGGGCCAGGAATTTGACG CTCGTGGAAGTGACGCCTT
第二列 TTTCCCAGGTCAAGATGGTC CTTCAGCACCTGTCTCACCA
SOX9 AGCGAACGCACATCAAGAC CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
能 TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA
β肌动蛋白 TGGCACCCAGCACAATGAA CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGA
2.11。西方墨点法

DPSCs经过21天的成骨分化,PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs,细胞总蛋白提取使用里帕裂解缓冲(σ,美国),和由布拉德福德蛋白质浓度测定试验设备(Sangon生物技术,中国)。培养在MEM - msc α中含有10%的边后卫是用作控制。样本加热8分钟在100°C。等量的蛋白质分离10% SDS-polyacrylamide凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国Bio-Rad)。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下2小时然后孵化主要抗体RUNX2(1: 2000年,ab236639 Abcam),高山(1:2000年,ab83259 Abcam), OSX(1: 2000年,ab94744 Abcam), OPN(1: 2000年,ab8448 Abcam) β肌动蛋白(1:2000,ab8227 Abcam)一夜之间在4°C。洗后用TBST缓冲区,这些墨迹孵化了合山羊anti-rabbit(1: 1000年,Abcam)在室温下1小时。蛋白质是可视化使用ChemiDoc成像系统(美国Bio-Rad)。

 2.12。统计分析

所有统计分析计算软件使用GraphPad棱镜8。差异超过三组,单向方差分析应用。所有实验至少重复三次,并给出了数据 的意思是 ± SD 。被认为具有统计显著性结果 p 价值; p < 0.05 被认为是统计学意义( ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与DPSCs;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与PDLSCs;& p < 0.05 ,& & p < 0.01 ,&&& p < 0.001 与DFPCs;__ p < 0.05 ,组合 p < 0.01 ,††† p < 0.001 比ABMMSCs)。

 3所示。结果 3.1。MSC形态

隔离和培养DPSCs之后,PDLSCs DFPCs ABMMSCs, msc是扩大和培养基的通道。倒置相差显微镜是用来评估的形态学msc在通道0和3(图 1(一))。我们发现所有类型的msc展出呈长梭形形状和收敛时显示旋转的安排。3通道后,细胞形态仍然是光滑的和一致的。无显著差异,而在形态学观察四种类型的细胞。

形态学、DPSCs immunophenotype PDLSCs DFPCs, ABMMSCs。(一)相差显微镜的图像msc在0和通道3 ( 规模 酒吧 = 1 毫米, 放大 = × 40 )。(b)代表的照片流仪分析表面标记表达式DPSCs, PDLSCs DFSCs, ABMMSCs。

 3.2。MSC Immunophenotype

我们通过流式细胞术分析了msc的immunophenotype。数据显示低表达内皮细胞和造血标记(CD24、CD34、CD45)和高表达典型的MSC标记(CD73 CD90、和CD105)和CD29、CD44, CD146(图 1 (b))。结果表明,四种类型中没有区别msc immunophenotype。据报道,cd146 msc增殖和分化能力高于CD146-negative msc ( 20.]。为了消除CD146的干扰,我们选择了msc CD146表达高(> 95%)以下测试。

 3.3。细胞凋亡和增殖率

通过血清剥夺我们MSC诱导细胞凋亡。结果表明,凋亡率DFPCs最高和ABMMSCs最低,其次是DPSCs PDLSCs。之间没有统计凋亡率的差异DPSCs和PDLSCs(数字 2(一个)和 2 (b))。

细胞凋亡和增殖率的DPSCs PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs。(一)DPSCs TUNEL染色,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs P3 ( 规模 酒吧 = 50 μ米)。(b)的细胞凋亡率DPSCs, PDLSCs DFPCs, ABMMSCs P3。(c)的增殖率DPSCs, PDLSCs DFPCs, ABMMSCs P3 ( ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与DPSCs;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与PDLSCs;& p < 0.05 ,& & p < 0.01 ,&&& p < 0.001 与DFPCs;__ p < 0.05 ,组合 p < 0.01 ,††† p与ABMMSCs p < 0.001)。

根据CCK-8连续7天测试结果,分析了生长曲线和吸引。结果表明,所有的msc慢慢扩散前两天,在第三天进入对数生长期。DFPCs的增殖率显著高于ABMMSCs, DPSCs和PDLSCs第二(图 2 (c))。

 3.4。高山活动染色和化验

高山主要表现在矿化矩阵由成骨分化细胞产生和被认为是成骨细胞的早期标志( 21]。成骨诱导过程中,四种类型的msc的高山活动随时间增加。在3天、7和14的成骨诱导,ABMMSCs显示最高的高山活动,其次是PDLSCs DPSCs, DPFCs拥有最低的(数据 3(一)和 3(b))。

DPSCs成骨分化染色,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs。(一)高山染色DPSCs、PDLSCs DFPCs, ABMMSCs后3、7、14天的成骨分化( n = 3 )。(b)高山DPSCs活动分析,PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs后3、7、14天的成骨分化( n = 3 )。(c)茜素红染色DPSCs, PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs成骨分化后21天( n = 3 )。(d)茜素红染色分析钙沉积量的DPSCs PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs经过21天的成骨分化。( n = 3 )。DPSCs (e)茜素红染色,PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs成骨分化后21天( n = 3 )( 规模 酒吧 = 2 毫米)( ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与DPSCs;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与PDLSCs;& p < 0.05 ,& & p < 0.01 ,&&& p < 0.001 与DFPCs;__ p < 0.05 ,组合 p < 0.01 ,††† p < 0.001 比ABMMSCs)。

 3.5。茜素红染色和钙沉积量化

为了检测DPSCs的成骨的能力,PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs,我们进行成骨分化实验。每种类型的细胞在成骨分化培养基培养是21天。染色结果证实,所有的msc经历了成骨分化,但效率是不同的。如数据所示 3(c) - 3(e)、ABMMSCs和PDLSCs茜素红染色显示强于DFPCs,其次是DPSCs,这表明成骨的能力从ABMMSCs下降,PDLSCs, DPSCs DFPCs。为了量化的钙沉积水平细胞基质沉积钙溶解在10%使用标(图党和量化 3(d))。正如所料,ABMMSCs钙含量和PDLSCs DPSCs和DFPCs相比更高。

 3.6。成骨的基因表达分析

我们进一步评估msc的成骨的能力通过比较相对的mRNA表达成骨的标记在天0、7、14和21的成骨诱导(图 4)。除了DPSCs COL-1、PDLSCs DFPCs显示一个向下的趋势在骨的第七天,OPN, OCN, RUNX2, OSX,高山在msc所有随时间增加。在21天的成骨诱导,结果表明,所有的标记都表达在ABMMSCs最高,DFPCs最低,DPSCs PDLSCs第二。

成骨分化的基因表达。分析执行中存在的效力在DPSCs成骨分化,PDLSCs, DFPCs,和ABMMSCs天0,7、14、21。的 y 设在代表相对信使rna折叠变化计算使用2− ΔΔCt公式 β肌动蛋白作为内部控制。误差线代表了SD ( n = 3 )( ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与DPSCs;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与PDLSCs;& p < 0.05 ,& & p < 0.01 ,&&& p < 0.001 与DFPCs;__ p < 0.05 ,组合 p < 0.01 ,††† p < 0.001 比ABMMSCs)。

我们还研究了成骨分化的表达蛋白质标记RUNX2,高山,OSX, OPN使用免疫印迹(数字 5(一个)和 5 (b))。成骨诱导后21天,OSX和高山上级表达在msc与对照组相比。此外,成骨的转录因子RUNX2和已故的标记OPN在ABMMSCs显著增强,PDLSCs, DPSCs,但只显示DFPCs蛋白质含量略高于控制细胞。总的来说,这些发现表明,msc隔绝不同dental-derived组织表现出独特的成骨分化能力,和osteogenesis-related基因的表达有显著差异。结合茜素红染色结果,得出四种类型的msc、ABMMSCs成骨的效率最高,其次是PDLSCs, DPSCs温和,DFPCs最低。

成骨分化的蛋白表达。(a)免疫印迹分析成骨的标记(RUNX2,高山,OSX和OPN)蛋白质在DPSCs PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs和成骨分化没有21天( n = 3 )。(b)的相对灰度值RUNX2,高山,OSX和OPN / β肌动蛋白。

 3.7。脂肪形成的分化和基因表达分析

为了测试DPSCs的脂肪形成的能力,PDLSC, DFPCs, ABMMSCs, msc在脂肪形成的诱导培养介质。大约7天后感应,msc变得平坦,脂质空泡在诱导细胞开始出现。经过21天的感应,这些细胞被固定4% PFA然后脂肪生成验证了油红O染色。胞质油滴的积累可以清楚地观察到msc(图的四种类型 6(一))。我们进一步评估msc的脂肪形成的能力通过比较相对mRNA表达的脂肪形成的标记在天0和脂肪形成的感应(图21 6 (b))。结果表明,所有的脂肪形成的标记在ABMMSCs表达最高。

脂肪形成的分化能力DPSCs PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs。DPSCs (a)油红O染色,PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs后21天去( 规模 酒吧 = 500年 μ米)。(b)中存在的效力进行分析在DPSCs脂肪形成的差异化,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs天0和21。的 y 设在代表相对信使rna折叠变化计算使用2− ΔΔCt公式 β肌动蛋白作为内部控制。误差线代表了SD ( n = 3 )( ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与DPSCs;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与PDLSCs;& p < 0.05 ;& & p < 0.01 ,&&& p < 0.001 与DFPCs;__ p < 0.05 ,组合 p < 0.01 ,††† p < 0.001 比ABMMSCs)。

 3.8。Chondrogenic分化和基因表达分析

DPSCs的chondrogenic能力、PDLSC DFPCs, ABMMSCs, msc在15毫升锥形管离心机。与软骨分化培养基培养后21天,软骨细胞颗粒被固定,切成石蜡切片。部分被阿尔新蓝染色,这表明chondrogenic苷。所有测试msc显示(图染色阳性结果 7(一))。我们进一步评估msc的chondrogenic能力通过比较相对的mRNA表达chondrogenic标记在天0和chondrogenic感应(图21 7 (b))。结果表明,所有chondrogenic标记在DPSCs表达最高。

DPSCs Chondrogenic分化能力,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs。(a)阿尔新蓝染色DPSCs, PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs chondrogenic分化后21天( 规模 酒吧 = 200年 μ米)。(b)中存在的效力进行分析chondrogenic DPSCs分化,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs天0和21。的 y 设在代表相对信使rna折叠变化计算使用2− ΔΔCt公式 β肌动蛋白作为内部控制。误差线代表了SD ( n = 3 )( ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 与DPSCs;# p < 0.05 ,# # p < 0.01 ,# # # p < 0.001 与PDLSCs;& p < 0.05 ,& & p < 0.01 ,&&& p < 0.001 与DFPCs;__ p < 0.05 ,组合 p < 0.01 ,††† p < 0.001 比ABMMSCs)。

 4所示。讨论

msc发挥关键作用在健康和疾病之间的平衡 22]。结合不同类型的支架材料,如HAP和解放军,他们为骨再生提供新的治疗方法 23]。考虑他们的角色在组织和器官,许多研究致力于探索的基本生物学机制和潜在的临床应用msc ( 24- - - - - - 28]。msc的优势包括容易收获,并不倾向于形成肿瘤。在特定的增长条件下体外培养时,也显示自我更新和分化成多种细胞类型的特点( 29日]。此外,事实证明,不同来源的msc具有显著的免疫调节功能。在炎性疾病,msc编制了一个独特的反应自导和融入受损组织 30.]。这些独特的免疫调节特性使得msc许多临床研究领域的主要细胞类型( 31日]。更具体地说,msc显示巨大的潜力在骨损伤和疾病的病理生理学和可以作为治疗选择在未来 32]。

最好的组织工程种子细胞的评价包括许多方面。除了考虑的特征细胞含有增殖和分化成特定的血统,同样重要的是确定干细胞的来源。相比两个躯体msc BMMSCs ADSCs, dental-derived干细胞是成为一个有前途的细胞的再生医学,因为组织来源可以从医疗废物,如获得智慧的牙齿,这是简单的和更少的道德争议。与此同时,这些组织可以存储使用。BMMSCs,额外的侵入性程序捐赠者可能会导致严重的并发症,如感染。此外,可以获得较低的细胞群是隔离BMMSCs时遇到的一个缺点。虽然ADSCs可以通过抽脂手术或剖腹产,进展仍然是侵入性( 33, 34]。鉴于上述原因,dental-derived比体细胞干细胞干细胞表现得更好。本研究旨在描述DPSCs的生物学特性和成骨分化潜力,PDLSCs, DFPCs, ABMMSCs和确定其应用潜力骨再生。到目前为止,这样的直接比较没有被报道。

为了避免个体差异,我们从同一个人分离出四种类型的细胞。通过细胞表面标记的识别和tri-lineage分化的能力,我们孤立的细胞满足msc的标准( 5]。细胞治疗和组织工程的应用程序需要大量的细胞,细胞的增殖能力是非常重要的。我们评估四种类型的msc的增殖率连续7天。结果表明,所有的msc达到对数生长期的第三天,之后快速增长。DFPCs的扩散速度是最快的,DPSCs和PDLSCs第二,和ABMMSCs是最慢的。

干细胞的antiapoptosis能力也是一个重要的方面在考虑治疗应用。据报道,约99%的msc丢失在细胞移植后第一个24小时,和细胞凋亡被认为是主要因素 35]。很多机制可能会导致移植细胞的凋亡,包括营养不足和炎性环境( 36]。我们部分的微环境模拟移植网站通过使用无血清培养基,成功地诱导MSC细胞凋亡。结果表明,ABMMSCs拥有最强的抗凋亡能力。

此外,我们研究了DPSCs的成骨分化能力,PDLSCs DFPCs, ABMMSCs。成骨分化能力被高山染色证实,高山活动分析,茜素红染色。成骨诱导后,ABMMSCs显示更多的高山染色在第七天,黑暗在第14天,其次是DPSCs PDLSCs, DFPCs拥有最轻的颜色。高山活动测试结果与高山染色一致。成骨诱导的21天,ABMMSCs显示更强的茜素红染色,PDLSCs第二但略强于DPSCs, DFPCs是最轻的。这些结果表明,产生更多的矿化结节ABMMSCs成骨诱导过程中最敏感的成骨细胞的分化。

在基因层面上,我们分析的表达成骨的标记(包括高山、RUNX2 COL-1, OCN, OPN,和OSX)进一步证明成骨分化。结果表明,随着成骨诱导时间的增加,在ABMMSCs成骨的基因的表达显著增加,高于DPSCs PDLSCs, DFPCs。同时,我们分析了蛋白质含量在21天或没有成骨的感应。在成骨诱导的后期阶段,msc仍显示成骨的潜力。在ABMMSCs成骨的蛋白质的表达明显高于DFPCs, PDLSCs和DPSCs紧随其后。总之,我们的研究结果表明,相对于上述四种dental-derived干细胞,ABMMSCs拥有最强的成骨能力,PDLSCs略弱,DPSCs第二,他们都比DFPCs更好。考虑到可用性的细胞来源,增殖,凋亡,成骨的能力、ABMMSCs PDLSCs被认为是潜在的替代品BMMSCs骨组织工程。

 5。结论

总之,我们的结果表明DPSCs, PDLSCs DFPCs, ABMMSCs来自同一个体具有不同的生物学特性。ABMMSCs PDLSCs显示,更高的成骨的潜力,这将使他们为骨组织工程最佳的干细胞。然而,我们只有相比生物学特性和这些干细胞体外成骨的潜力。体内需要做更多的研究来确定最优骨再生的干细胞来源。

 缩写 msc:

间充质干细胞

 DPSCs:

牙髓干细胞

 PDLSCs:

牙周韧带干细胞

 DFPCs:

牙科卵泡祖细胞

 ABMMSCs:

肺泡骨髓间充质干细胞

 PFA:

多聚甲醛

 存在:

RNA提取和定量实时聚合酶链反应

 高山:

碱性磷酸酶

 COL-1:

胶原蛋白I型

 第二列:

胶原蛋白II型

 能:

Aggrecan

 RUNX2:

Runt-related转录因子2

 OSX:

Osterix

 OCN:

骨钙素

 OPN:

骨桥蛋白

 APN:

脂联素

 FABP4:

脂肪酸结合蛋白4

 中国共产党:

Cetylpyridine氯。

 数据可用性

作者声明,所有的数据支持本研究的发现可以从相应的作者通过电子邮件以合理的要求。

 伦理批准

道德伦理委员会的批准获得上海交通大学医学院(sh9h - 2020 tk60 - 1)。

 同意

同意并不是必要的。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

这项研究是由Q.Z.设计和C.Y.基准线问进行了大部分的实验和起草了手稿。开出信用证的核进行了一些实验。D.H.Z.帮助与统计分析。Y.L.帮助论文的编辑。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。杨气、清周贡献本文同样。

 确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81870785)、上海市医院新兴前沿技术联合关键项目(SHDC12017101),医学科学的凸轮创新基金(CIFMS) (2019 - i2m 5 - 037),自然科学基金会的计划(2019 - zd - 0775和2020 - ms - 175,辽宁、中国),和科技计划项目(20-205-4-052、沈阳、中国)。

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