SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/5546032 5546032 研究文章 一个全面的预后和免疫分析新Three-Gene签名在肝细胞癌 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5328 - 0646 刘 小君 1 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5322 - 8186 陆 Jianjun 3 4 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3532 - 6444 李 Wenli 1 Allegrucci Cinzia 1 生殖医学中心 悦贝人民医院 汕头大学医学院 韶关512025 中国 stu.edu.cn 2 医学研究中心 悦贝人民医院 汕头大学医学院 韶关512025 中国 stu.edu.cn 3 第二临床医学院 南方医科大学 广州510080 中国 fimmu.com 4 医学事务部 中山大学第一附属医院 广州510080 中国 sysu.edu.cn 2021年 3 6 2021年 2021年 4 2 2021年 7 5 2021年 20. 5 2021年 3 6 2021年 2021年 版权©2021刘骏et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

很少有报告基因的作用与mRNA相关表达式的具备干细胞指数(mRNAsi)预后和免疫调节肝细胞癌(HCC)。本研究旨在分析的表达谱和预后意义mRNAsi-based three-gene签名在肝细胞癌。这个three-gene签名确认通过分析mRNAsi癌症基因组图谱的数据(TCGA)肝癌的数据集。的预后价值风险评分基于“三基因签名被Cox回归和kaplan meier分析评估,然后验证国际癌症基因组协会(ICGC)数据库。与此同时,风险评分之间的相关性和免疫细胞渗透模式、微卫星不稳定性(MSI),肿瘤突变负担(三甲),免疫分子,检查站hypoxia-related基因、免疫疗法的反应,和化合物目标基因签名进行了探讨,分别。结果表明,与正常肝组织相比,肝癌组织的mRNAsi得分显著增加。PTDSS2、MRPL9和soc mRNAsi最相关的基因在肝细胞癌组织。生存分析结果表明,基于“三基因签名是一个独立的风险评分预测肝癌患者的预后。列线图结合风险评分和病理阶段表现出良好的预测能力对肝癌患者的总体生存病人。与此同时,风险评分显著相关免疫细胞渗透模式、MSI,三甲,几个免疫分子,检查站和hypoxia-related基因。 In addition, the risk score was associated with the immunotherapy response, and fifteen potential therapeutic drugs targeting the three-gene signature were identified. Therefore, we propose to use this three-gene signature including PTDSS2, MRPL9, and SOCS as a potential prognostic biomarker for HCC.

 1。介绍

肝细胞癌(HCC), -90%的肝癌占80%,是世界上第五个最常见的癌症和第三所有癌症相关死亡的主要原因。HCC的转移和复发的疾病很难治愈。尽管化疗是一种常见的方法除了手术切除,局部切除,肝移植患者的肝细胞癌,癌细胞的耐药性高限制了治疗效果。最近,癌症干细胞的概念(CSC)有助于解释转移,复发和耐药肝癌。有一些二者在肿瘤,强烈的生存,发展,自我更新,和抵抗能力,从而促进肿瘤的发展和传播 1]。在过去的几年中,CSC是用来识别重要的基因在肝细胞癌( 2]。发现CSC地位不仅可以用作预后因子也可能是肝癌治疗的新目标( 3]。

二者通常被等相关生物标志物CD133, cd44, CD90、上皮细胞粘附分子(EpCAM)。我们已经知道,CD133(+)肝癌细胞能促进化疗耐药,并增加CD133表达对肝癌病人是一个独立的预后因子。此外,据报道,细胞质CD133的表达是显著相关的肝细胞癌患者的生存 4- - - - - - 6]。此外,cd44也与HCC患者的不良预后相关( 7]。CD90表达与肝细胞癌的早期复发有关( 8]。EpCAM +肝癌细胞与肝细胞癌的侵犯和转移,整体存活率密切相关( 9]。因此,干细胞特征是重要的因素可以影响肿瘤复发和进展。CSC的mRNAsi是一个重要的指标,和更高的mRNAsi分数去分化与更大的肿瘤。正如我们所知,异常mRNA表达起着重要的作用在肿瘤生物学,和一些异常mRNA会影响自我更新,扩散,二者的发展。因此,异常mrna表达肝细胞可以作为生物标志物来评估肝细胞癌患者的预后。

在这项研究中,我们提取的肝癌组癌症基因组图谱(TCGA),识别最重要的预后mRNAsi相关的基因,并建立了一个基因签名对肝癌生存预测。关键基因的表达,验证基因表达的综合(GEO)和基因表达分析交互式分析(GEPIA)数据库。风险评分基于基因签名成立于TCGA数据库,随后ICGC数据库中验证。风险评分之间的相关性和免疫细胞渗透模式、微卫星不稳定性(MSI),肿瘤突变负担(三甲),免疫分子,检查站hypoxia-related基因,分别和免疫治疗反应进行了探讨。此外,我们使用连接地图分析来识别潜在的治疗目标化合物的基因签名。最后,我们建立了一个计算图表结合临床实践的预后基因签名和病理阶段,然后验证了预测精度的诺模图校准情节,接受者操作特征(ROC)曲线,时间和决策曲线分析。总之,在目前的研究中,我们全面分析新stemness-related的预后和免疫学意义在肝细胞癌基因签名。这个基因签名可以作为潜在的肝细胞癌预后的生物标志物。

 2。材料和方法 2.1。数据源

训练数据集与HCC-mRNA TCGA的表达谱和临床信息数据库包括370名肝癌组织和邻近non-HCC组织(ANTTs)。验证数据集HCC-mRNA表达谱和临床信息用于验证基因签名从ICGC下载数据库包括232肝癌组织和ANTTs。此外,十HCC军团的mRNA表达谱从GEO数据库下载检查确认关键基因的mRNA表达谱与预后的意义。与此同时,基因在GEPIA验证数据库( http://gepia.Cancer-pku.cn)[ 10]。我们获得了免疫细胞浸润的分数从计时器数据库( https://cistrome.shinyapps.io/timer/),肿瘤突变HCC计算基于体细胞突变的负担。我们从已发表的文献[获得微卫星不稳定 11]。上述四个数据库是公开的。因此,本研究不需要当地伦理委员会批准。

 2.2。mRNAsi在HCC及其临床意义

二者是肿瘤细胞具有自我更新能力和发挥重要作用在肿瘤生存、扩散、转移和复发。具备干细胞指数指标可以描述肿瘤细胞和干细胞之间的相似性。所以具备干细胞指标可以被视为CSC的量化特征,包括mRNAsi索引计算基于表达数据,和EREG-mRNAsi表达指数计算基于干细胞基因明显的规章制度。这些指标的范围从0到1,接近一个显示较低的细胞分化程度和CSC的更强的特征。调查mRNAsi分数和临床预后的价值,我们比较mRNAsi分数之间的匹配肝癌样本和正常肝组织,观察值mRNAsi分数不同的肿瘤的成绩,并比较患者预后之间高mRNAsi和低mRNAsi分数。

 2.3。识别差异表达基因(度)之间的肝细胞癌和非癌变组织

我们下载的原始测序数据HCC mRNA TCGA的数据库并获取度(<我nline-formula> 日志 2 足球俱乐部 > 1 或<我nline-formula> 日志 2 足球俱乐部 < − 1 ,<我nline-formula> p < 0.05 作为一个截断值)Limma R-package。度被用于后续的分析。随后的分析方法包括建立coexpression基因网络基于RNA序列数据,确定一个基因签名与预后价值,验证基因签名作为独立预后因子跟着李et al . 2020的方法 12]。

 2.4。基于RNA-Seq Coexpression基因网络数据

上一步中我们选择度确定和执行WGCNA构建基因coexpression网络( 13]。首先,我们计算了基因之间的皮尔逊相关系数的绝对值<我nline-formula> 我 和基因<我nline-formula> j 构建基因表达相似矩阵: (1) 年代 我 j = 1 + 天哪 x 我 + y j 2 ,

x 我 和<我nline-formula> y j 代表基因的表达水平<我nline-formula> 我 和基因<我nline-formula> j ,分别。然后,基因表达相似矩阵转换成邻接矩阵,这增加了强烈的相关性和削弱了弱相关的指数水平。<我nline-formula> β 软阈值,是每一对基因的皮尔森相关系数( 14]: (2) α ij = 1 + 天哪 x 我 + y j 2 β 。

接下来,我们将邻接矩阵转换成一个拓扑矩阵。拓扑重叠测量(汤姆)是用于描述基因之间的联系的程度: (3) 汤姆 = ∑ μ ≠ 我 j α 我 μ α μ j + α 我 j 最小值 ∑ μ α 我 μ + ∑ μ α j μ + 1 − α 我 j 。

汤姆表明基因之间的差异程度<我nline-formula> 我 和基因<我nline-formula> j 。最具代表性的基因在每个模块称为特征向量的基因,我代表整个模块内的基因表达水平。我们执行平均链接层次聚类根据汤姆的相似性测度,计算其相似度,并建立了一个模块树图: (4) 我 = princomp x 我 j 问 。

在这里,<我nline-formula> 我 代表了基因模块<我nline-formula> 问 ,<我nline-formula> j 表示模块的芯片样品<我nline-formula> 问 。我们使用皮尔逊相关性的基因表达谱在所有样本和特征向量的我表达谱基因测量模块中基因的身份,它被称为模块成员(毫米): (5) 毫米 我 问 = 天哪 x 我 , 我 问 。

在这里,我代表的表达谱<我nline-formula> 我 基因。我们计算基因的重要性(GS)反映了每个模块的重要性,用这个来衡量基因和样本特征之间的相关性。所显示的模块(MS)重要性的平均GS模块和用于测量模块和样本特征之间的相关性。在这项研究中,我们选择mRNAsi和EREG-mRNAsi临床表型和选择模块,为后续分析mRNAsi有着显著的相关性。

 2.5。Three-Gene签名的定义与预后的价值

在这项研究中,单变量,至少绝对收缩和选择算子(套索)和多个Cox回归分析被用来探索基因表达水平之间的相关性和总生存期(OS)。我们首先使用单变量Cox回归分析来确定OS-related基因,然后应用套索Cox回归HCC预后基因的进一步缩小范围,并使用多个Cox回归分析评估预后的基因是否可以作为独立的预后因素。接下来,我们建立了一个预测基因签名乘以系数的表达式的多变量Cox回归模型(<我talic> β)的表达水平。也就是说,<我nline-formula> 预后 指数 π = β ∗ PTDSS 2 表达式 水平 + β ∗ MRPL 9 表达式 水平 − β ∗ soc 2 表达式 水平 。随后,我们把TCGA的370名肝癌患者分为高和低风险组基于风险评分的预后模型和执行kaplan meier(公里)生存曲线和ROC曲线来评估模型的预测能力。此外,我们验证了在一个独立的肝细胞癌预后模型数据集从ICGC数据库。

 2.6。“三基因签名是一个独立的预测HCC的操作系统

我们用单变量和多变量Cox回归分析评估是否“三基因签名可以作为一个风险因素独立于其它临床病理变量如年龄、性别、肿瘤分级,对肝癌病人和病理阶段。我们临床特点为独立变量,操作系统为因变量,计算出风险比(人力资源)(95%置信区间,两面<我nline-formula> p 值)。

 2.7。浓缩的基因分析分数高危人群

TCGA肝癌样本被分成高和低风险组表达水平的基础上“三基因签名。然后,集富集分析(GSEA)是使用GSEA执行软件( https://www.broadinstitute.org/gsea/)在高危人群的基因丰富找到通路。相关的设置<我nline-formula> 对齐 = 基因 集 ,<我nline-formula> 度规 = _ 类 区别 ,<我nline-formula> # 安排 = 2500年 。

 2.8。“三基因签名的验证数据集由一个独立的肝癌

我们验证了“三基因签名的预后价值在一个独立的HCC从ICGC数据库数据集。所有肝癌患者的平均风险评分在验证数据集作为截断值,我们HCC患者随访信息分为高和低风险组,比较两组之间的操作系统(两面<我nline-formula> p 价值,<我nline-formula> p < 0.05 代表一个重要的统计差异)。

 2.9。风险评分之间的相关性分析和肿瘤免疫微环境(时间)

时间是肿瘤细胞的免疫细胞复杂的环境中生存和发展。为了评估风险评分之间的交互和时间,我们分析了风险评分之间的相关性和免疫细胞渗透模式、MSI,三甲,免疫检查点,分别和hypoxia-related基因。随后,我们分析了肝癌患者的生存率从以上方面(双因素分析)。免疫浸润细胞包含在本研究CD8 T细胞、B细胞、树突状细胞、CD4 T细胞,中性粒细胞和巨噬细胞。免疫分子包含在分析PDCD1检查站,CTLA4, CD80、CD86, CD274, PDCD1LG2,小鼠,VTCN1。hypoxia-related基因包含在分析了从以前的文献,包括SLC2A1 LDHA, ALDOA,三,VEGFA, ACOT7, TPI1, CDKN3, MRPS17, MIF、NDRG1, TUBB6, ADM, PGAM1, PGAM1 [ 15, 16]。

 2.10。量化风险评分的免疫反应使用Immunophenoscore预测

Immunophenoscore (IPS),它是基于主要组织相容性复数相关分子,检查点/免疫调制剂,效应细胞,抑制细胞,可用于肿瘤免疫原性的因素进行量化和描述intratumor免疫antigenomes景观和癌症。加权平均的总和<我nline-formula> Z 分数计算使用示例<我nline-formula> Z 分数的每个类别称为“诱导多能性”( 17]。在这项研究中,ip是用来预测的反应anti-CTLA-4 anti-PD-1方案。

 2.11。使用连接映射分析预测潜在的治疗性化合物

使用连接图分析,我们确定了目标化合物“三基因签名,可能导致小说治疗引发具备干细胞分化和排气潜在肿瘤( 18]。

 2.12。建立和评价生存预测HCC的诺模图

列线图是一种简化的操作系统评估图,将统计预测模型转换成图适合临床使用。在这项研究中,我们结合基于“三基因签名的风险评分和病理阶段构建一个列线图可以评估1 -,3 -,肝癌患者的5年生存概率和预测的概率的计算图表相比实际观察到的生存概率的校准曲线来验证计算图表的准确性。线的重叠表明模型是准确的。此外,中华民国曲线是用来评估预测精度的诺模图。

 3所示。结果 3.1。整个研究过程和总结患者的信息

图 1整个研究工作的流程图。这个图显示了一个集成的详细施工过程模型预测肝癌患者的总体生存基因签名通过一个基于网络具备干细胞转录组数据的分析指标。TCGA病人的信息和ICGC组如表所示 1。

本研究的总体流程图。

病人的信息,TCGA和ICGC同志们。

临床特点 总 %
,TCGA 370年
生存状态 生存 244年 65.95
死亡 126年 34.05
年龄 ≤65年 232年 62.70
> 65年 138年 37.30
性别 男性 249年 67.30
女 121年 32.70
组织学分级 G1 55 14.86
G2 177年 47.84
G3 121年 32.70
G4 12 3.24
阶段 我 171年 46.22
二世 85年 22.97
三世 85年 22.97
四世 5 1.35
T分类 T1 181年 48.92
T2 93年 25.14
T3 80年 21.62
T4 13 3.51
TX 1 0.27
M分类 M0 266年 71.89
M1 4 1.08
MX One hundred. 27.03
N分类 N0 252年 68.11
N1 4 1.08
NX 113年 30.54
ICGC 232年
生存状态 生存 189年 81.47
死亡 43 18.53
年龄 ≤65年 90年 38.79
> 65年 142年 61.21
性别 男性 171年 73.71
女 61年 26.29
阶段 我 36 15.52
二世 106年 45.69
三世 71年 30.60
四世 19 8.19
之前的恶性肿瘤 没有 202年 87.07
是的 30. 12.93
3.2。网络分析在HCC mRNAsi和度

癌细胞具备干细胞的临床重要性,mRNAsi是CSC的定量表达式。在这项研究中,TCGA HCC数据集从数据库下载分析mRNAsi分数在肝癌组织中。如图 2。mRNAsi得分有显著差异之间的肝细胞癌组织和邻近nontumor组织(ANTTs)(图 2(一个)),mRNAsi分数增加而增加肝癌年级(图 2 (b))。此外,mRNAsi分数较高的患者预后较差比患者mRNAsi得分较低(图 2 (c))。为了比较的mRNA表达谱肿瘤组织和正常组织,肝细胞癌表达TCGA矩阵从数据库下载屏幕度和6779度筛选(<我nline-formula> 日志 2 足球俱乐部 > 1 或<我nline-formula> 日志 足球俱乐部 < − 1 ,<我nline-formula> p < 0.05 423年),其中6356为调节和表达下调(图 2 (d))。

Stemness-characteristic指数及其在肝癌预后的意义。(一)差异mRNAsi TCGA HCC和匹配的正常肝组织之间的数据集。(b)肝癌子组之间比较mRNAsi除以病理成绩。(c) kaplan meier曲线的病人分配到高和低风险组基于TCGA mRNAsi值的数据集。high-mRNAsi组的预后差比low-mRNAsi组。(d)火山情节展示度在肝癌样本。绿色表示基因表达下调,红色代表调节的基因。

 3.3。与mRNAsi相关识别最重要的模块

在这项研究中,重要基因模块具备干细胞相关的肿瘤细胞被WGCNA确认。我们选择6779个差异基因对于WGCNA处理,构建基因coexpression模块和分配这些基因在不同模块通过聚类树形图(图 S1每个模块的基因数)。在WGCNA表所示 2。发现模块与mRNAsi coexpression较高相关系数是黑色,蓝色,和黄绿色模块(相关系数分别为-0.59、0.50和0.47,分别)。每个coexpressed基因之间的相关系数模块和HCC具备干细胞(mRNAsi和EREG-mRNAsi)如图 S1b模块相关分析的结果表明,有高相关性的黑色、蓝色,green-yellow基因模块(图 S1C),这些基因模块和表型之间的关系是最重要的(图 S1D)。因此,黑色,蓝色,green-yellow模块被认为是最重要的模块与mRNAsi有关。

在WGCNA基因数量的每个模块。

模块 基因数量
黑色的 94年
蓝色的 421年
布朗 250年
绿色 119年
凯利 60
灰色 3062年
品红色的 74年
粉红色的 89年
紫色的 71年
红色的 108年
唐ydF4y2Ba 55
绿松石 2206年
黄色的 170年
3.4。构建一个Three-Gene签名为生存的预测

为了建立一个基于CSC临床肝癌生存预测模型,我们使用一个肝癌TCGA的数据库作为训练数据集和应用套索Cox回归分析来确定稳定标记从259年survival-related候选人。我们减少一些系数为零,迫使回归系数的绝对值之和小于一个固定值。接下来,我们使用相对回归系数来确定最稳定的预后指标,进行交叉验证,避免过度拟合套索Cox模型(图 S2Cox模型,建立的)。两个过滤器标记包括PTDSS2和MRPL9与高风险相关(<我nline-formula> 人力资源 > 1 ),一个过滤器标记SOCS2与低风险(<我nline-formula> 人力资源 < 1 )(图 S2B)。

然后,我们应用上述3基因基因签名构造一个基于最低标准的生存预测肝癌。我们使用系数从Cox回归分析计算获得每个HCC患者的风险评分在训练集。为了测试之间的关系“三基因签名和肝细胞癌患者的预后,我们建立了一个预测模型基于“三基因签名:<我nline-formula> 预后 指数 = 0.236923 ∗ PTDSS 2 + 0.534246 ∗ MRPL 9 − 0.50027 ∗ soc 2 。然后,所有肝癌患者的平均风险评分在训练数据集作为截断值,我们370 HCC患者随访信息分为高风险(<我nline-formula> n = 185年 )和低风险(<我nline-formula> n = 185年 )组织和比较了两组的基因表达谱和生存状态。结果表明,与低风险组相比,高危组的预后更差。此外,MRPL9和PTDSS2的表达水平更高,而SOCS2的表达水平较低的高危人群,而那些低风险组(图 S2C)。

接下来,我们验证了“三基因签名的生存预测能力在一个独立的HCC队列从ICGC数据库。我们提取的mRNA表达谱数据和随访信息从这个验证组232名肝癌患者,然后计算每个HCC患者的风险评分使用相同的公式作为训练集,以风险评分的中位数为截止值,我们将232名肝癌患者分为高危组(<我nline-formula> n = 116年 )和低风险组(<我nline-formula> n = 116年 ),比较两组的基因表达谱和生存状态。结果表明,与低风险组相比,高危组的预后更差。此外,MRPL9的表达水平和PTDSS2在高危人群高,虽然SOCS2的表达水平较低,相比之下,那些低风险组中。这些结果是一致的,在训练集,因此,进一步验证“三基因的表达谱和预后价值签名(图 S2D)。

 3.5。kaplan meier和ROC分析“三基因签名

随后,我们使用风险评分中位数作为截断值将肝细胞癌患者分为高和低风险组,比较两组的总体生存使用kaplan meier生存曲线。此外,我们使用时间ROC曲线评价“三基因签名的预测能力。更高的AUC ROC曲线意味着更好的预测模型的性能。如图 3(一个)的操作系统,有一个重要的区别,TCGA的高和低风险组群(<我nline-formula> p < 0.0001 )。风险的auc分数对应0.5、1、2、3和5年生存率分别为0.716,0.775,0.757,0.733,和0.694,分别表明预测模型有很高的敏感性和特异性(图 3 (c))。如另一个kaplan meier曲线(图所示 3 (b)),操作系统在低风险组相比明显更好的高危人群在一个独立的验证从ICGC肝癌组(<我nline-formula> p < 0.001 )。这个结果与我们之前的结果是相一致的TCGA的队列训练数据集。如图 3 (d),auc的风险分数对应0.5、1、2、3和5年生存率分别为0.812,0.791,0.708,0.747,和0.800,分别,这进一步证实了“三基因签名具有高敏感性和特异性,可作为一个可靠的预测HCC的操作系统。

生存分析与培训“三基因签名和验证数据集。(a和b) kaplan meier TCGA HCC患者的总体生存分析(a)和ICGC (b)数据集分配给高位低风险组基于风险评分。患者更高的风险评分差总体生存训练和验证军团。(c和d) ROC曲线显示的预测效率风险签名TCGA的肝癌患者(c)和ICGC存活率(d)的数据集。

 3.6。风险评分是一个独立的预后因子与其他临床病理的特点

单变量和多变量Cox回归分析用于评估风险评分基于“三基因签名是否可以作为一个独立的预后指标系统预测肝癌患者。TCGA的数据集,单变量和多个Cox回归分析的结果表明,风险评分和病理阶段显著相关的操作系统,而年龄、性别、组织学分级与操作系统无关(数字 4(一)和 4 (b))。ICGC数据集,考克斯单变量分析的结果表明,风险评分,性别,和病理阶段显著相关操作系统(图 4 (c))。和多变量Cox回归分析的结果表明,风险评分,性别,先前的恶性肿瘤,病理阶段显著相关的操作系统(图 4 (d))。这些结果证实,基于“三基因签名的风险评分可作为肝细胞癌患者预后的独立预测指标。

Cox回归分析的临床病理特征之间的关系和肝细胞癌患者的总生存期。单变量和多变量Cox回归分析的临床病理因素之间的关系(包括风险评分)和总生存期的患者,TCGA (a和b)和ICGC (c和d)数据集。

 3.7。亚组分析基于各种分组方法对临床特点

如图 S3,为了进一步验证风险评分模型的准确性基于“三基因签名,我们分类HCC患者基于因素如年龄、病理阶段,组织年级。然后,我们小组进行生存分析,TCGA和ICGC数据集,分别。结果证明,基于“三基因签名的风险评分是一个生物标志物预测系统在不同的子组,包括TNM阶段i ii (<我nline-formula> p < 0.001 )、阶段iii iv (<我nline-formula> p < 0.001 ),G1和G2 (<我nline-formula> p < 0.001 ),G3 & 4 (<我nline-formula> p < 0.001 ),<我nline-formula> 年龄 < 60 (<我nline-formula> p < 0.001 ),<我nline-formula> 年龄 > 60 (<我nline-formula> p < 0.001 TCGA)的数据集,TNM阶段i ii (<我nline-formula> p = 0.019 )、阶段iii iv (<我nline-formula> p = 0.025 ),<我nline-formula> 年龄 < 60 (<我nline-formula> p = 0.001 ),<我nline-formula> 年龄 > 60 (<我nline-formula> p < 0.001 ICGC数据集)。

 3.8。验证Three-Gene签名在一个独立的肝细胞癌的预后价值群组

我们进一步验证的预后价值风险得分基于“三基因签名在一个独立的HCC队列从地理数据库。我们提取的mRNA表达谱数据和209名肝癌患者的随访信息从这个验证队列,然后计算每个HCC患者的风险评分使用相同的公式作为训练集,同样,中等风险作为截断值。肝细胞癌患者分为高危组(<我nline-formula> n = 104年 )和低风险组(<我nline-formula> n = 105年 ),基因表达谱和整体存活率的两组进行比较。结果表明,高风险组的预后差(<我nline-formula> p < 0.01 ),具有较高的表达MRPL93 PTDSS2,和较低的表达SOCS2(图 S4a - b)。这些结果进一步验证了我们的分析结果在训练集。随后,我们使用ROC曲线评价风险评分的预测能力。如图 S4C, auc的风险分数对应0.5、1、2、3和5年生存率分别为0.723,0.639,0.673,0.640,和0.654,分别表明预测模型有较高的敏感性和特异性。

 3.9。生物标志物的表现“三基因签名在肝细胞癌

为了评估PTDSS2的性能,MRPL9,和SOCS2预后的生物标记,首先,我们验证了微分表达谱的三个发现基因在肝细胞癌组织和正常肝组织在多个肝癌一系列地理数据库。结果表明,PTDSS2的表达水平有显著差异,MRPL9, SOCS2之间肝细胞癌组织和正常肝组织(表匹配 S1、表 S2和表 S3)。与此同时,我们对这三个基因的表达趋势在不同病理阶段的HCC GEPIA数据集。PTDSS2和MRPL9的表达水平更高的更高级的TNM阶段(在肝细胞癌组织中<我nline-formula> p < 0.05 ;图 S5a - b),而SOCS2的表达水平低在更高级的TNM阶段(<我nline-formula> p < 0.05 ;图 S5C)。此外,我们使用kaplan meier曲线检查三个关键基因的表达和操作系统之间的联系,分别。我们HCC患者分为高和低表达组中值显示每个确定基因的表达式的值。结果表明,高PTDSS2表达式(<我nline-formula> 人力资源 = 2.1 ,<我nline-formula> p < 0.0001 ;图 S5D)和MRPL9 (<我nline-formula> 人力资源 = 1。8 ,<我nline-formula> p = 0.0016 ;图 S5E)与预后较差有关,而SOCS2的低表达与预后差(<我nline-formula> 人力资源 = 0.41 ,<我nline-formula> p < 0.0001 ;图 S5F)。

此外,我们把TCGA肝癌样本数据库分为高,风险和低风险组的分数计算基于“三基因的表达谱GSEA探索使用签名和高危人群的基因丰富的途径。结果表明,调节基因主要参与剪接体的途径,细胞周期,膀胱癌,DNA复制,RNA降解,蛋白酶体(图 S6)。相关的详细参数信号响应的upregulation基因在肝癌被显示在表中 S4。

 3.10。风险评分之间的相关性和免疫细胞渗透模式、三甲,MSI与相应的双因素分析生存预测

热量地图和执行kaplan - meier分析检测风险评分之间的相关性,与临床表现免疫细胞浸润。结果表明,风险评分相关免疫细胞浸润,MSI和三甲(图 5(一个))。结合风险评分和免疫细胞分数分析表明,肝癌患者得分低风险和高CD8 T细胞,B细胞、树突,CD4 T细胞,中性粒细胞、巨噬细胞细胞分数显示最好的操作系统(数字 5 (b)- - - - - - 5 (g))。小组得分高风险和低CD8 + T细胞或低B细胞分数显示预后差(数字 5 (b)和 5 (c))。众所周知,肿瘤相关巨噬细胞细胞与临床结果负相关。意料之中的是,该集团结合高风险分数和腹腔巨噬细胞高分数显示最糟糕的操作系统(图 5 (g))。三甲和MSI与基因组的不稳定。,结果表明,综合得分低风险和低三甲或MSI成绩显示更好的预后,同时结合高风险分数和高三甲或MSI分数显示预后差。

肝细胞癌患者的生存分析基于风险评分,免疫细胞渗透模式、MSI和三甲。(一)风险评分之间的相关性分析和免疫细胞,三甲,MSI。(我)双重生存分析的风险评分和免疫细胞渗透指标包括CD8 T细胞(b), b细胞(c),树突(d), CD4 T细胞(e),中性粒细胞(f)、巨噬细胞(g), MSI (h)和三甲(i)。MSI:微卫星不稳定;三甲:肿瘤突变的负担。

 3.11。风险评分之间的相关性和免疫检查站与相应的双因素分析生存预测

免疫检查点是指一系列的分子表达的免疫细胞能够调节免疫激活的程度,在预防自身免疫的发生起着重要的作用。因此,热量地图和执行kaplan - meier分析检测风险评分之间的相关性和免疫分子检查站(包括PDCD1 CTLA4, CD80、CD86 CD274, PDCD1LG2,小鼠,和VTCN1)与临床表现。结果表明,风险评分与这些免疫分子检查站(图的表达 6(一))。结合风险评分和免疫分子表达分析表明,无论检查站的表达免疫分子检查站,肝癌高危患者得分显示预后差。此外,该集团PDCD1得分低风险和高表达,CTLA4, CD80、CD86, CD274, PDCD1LG2,小鼠或VTCN1显示最好的预后(数字 6 (b)- - - - - - 6(我))。

肝细胞癌患者的生存分析基于风险评分和一些免疫分子检查站。(一)风险评分之间的相关性分析和几个关键的几种分子。(我)双重生存风险评分的分析和免疫分子包括PDCD1检查站(b), CTLA4 (c), CD80 (d), CD86 (e), CD274 (f), PDCD1LG2 (g),小鼠(h)和VTCN1(我)。

 3.12。风险评分之间的相关性分析和Hypoxia-Related基因生存与相应的双因素分析预测

缺氧时间的形成是一个重要的因素。我们获得15个基因与缺氧时间从以前的文献和分析这些15基因的表达在高和低风险组。结果表明,SLC2A1的表情,LDHA, ALDOA,三,VEGFA, ACOT7, TPI1, CDKN3, MRPS17, MIF,和NDRG1高危人群明显高于低风险组,虽然TUBB6的表情,ADM, PGAM1, PGAM1没有显著不同于低风险组(图 7(一))。结合风险评分和hypoxia-related基因表达分析表明,无论缺氧基因的表达,该集团风险评分高和高表达SLC2A1, LDHA, ALDOA,三,VEGFA, ACOT7或TPI1最糟糕的预后(数字 7 (b)- - - - - - 7 (h)),而CDKN3的表情,MRPS17, MIF、NDRG1对预后无显著影响(数据 7(我)- - - - - - 7(左))。

肝细胞癌患者的生存分析基于风险评分和几个hypoxia-related基因。(a)表达谱的几个hypoxia-related基因在高风险和低风险组。(bl)双重生存风险评分的分析和免疫分子包括SLC2A1检查站(b), LDHA (c), ALDOA (d),三、(e), VEGFA (f), ACOT7 (g), TPI1 (h), CDKN3(我),MRPS17 (j), MIF (k)、NDRG1 (l)。

 3.13。风险评分的作用在预测免疫疗法的好处

这里的治疗由CTLA-4 / PD-1抑制剂在抗肿瘤治疗方面取得了重要进展。预测如TML, PD-L1和IPS被广泛用于评估免疫反应( 19]。我们的分析表明,CTLA-4 (+) & PD-1 (+), CTLA-4 (+) & PD-1(-),和CTLA-4 (-) & PD-1(+)免疫治疗组,IPS低风险组显著增加(<我nline-formula> p < 0.001 ,图 S7a - c)。这些发现间接证明“三基因签名在调节免疫应答发挥了重要作用。因此,将风险评分与免疫治疗的反应可以进一步预测患者的预后。

 3.14。连接图分析确定潜在化合物能够针对“三基因签名

连接映射城市规划机构(CMap)是一种数据驱动的方法,发现基因之间的相关性,化学物质和生物条件。因此,我们使用了提出搜索目标标识候选化合物stemness-related基因签名。结果表明,15个化合物具备干细胞相关明显丰富(表 S5)。这些化合物可能具备干细胞相关抑制肿瘤的效果,并针对肿瘤的潜在药物。

 3.15。建立一个列线图来预测HCC患者的操作系统

为了建立一个临床适用的方法预测肝癌患者的生存率,我们建立了一个计算图表结合风险评分和病理阶段预测1 -,3 -,肝癌患者的5年存活率(图 8(一个))。然后,我们分析了模型精度的校准曲线。结果表明,1 - 3,和5年生存概率预测的列线图是观察到的生存概率密切相关,证实的可靠性计算图表(图 8 (b))。

构建一个基于“三基因签名为生存预测列线图。(一)列线图结合“三基因签名与临床病理的特点。(b)校准情节表明nomogram-predicted生存概率大致接近实际观察到的比例。(c) ROC曲线显示的预测效率阶段模型,风险评分模型,并结合模型1年,3年,5年生存预测验证HCC队列。(d)决策曲线分析显示,净收益之间的关系和阈值概率为1年,3年,5年生存率的预测。

然后,基于时间的ROC曲线是用来评估列线图的预测精度。固体黄线表示该组合模型。如图 8 (c)列线图的AUC,结合病理阶段和风险是最大的,和所有的列线图的AUC预计1 -,3 -,和5年生存预测高于0.75,这表明,诺模图由集成多个预后因素是一个更好的模型来预测肝癌患者的存活率比模型由一个单一的预后因子。此外,如图 8 (d),我们绘制了计算净收益对患者的阈值概率1 - 3 - 5年生存率。这些结果表明,列线图的净效益优于其它模型。

 4所示。讨论

二者发挥重要作用在HCC的转移和复发 20.]。因此,基于mRNAsi综合预测模型,二者的定量指标,可以更准确地预测肝癌患者的总生存期。

在这项研究中,我们专注于肝细胞癌的预后模型基于建设“三基因签名与癌细胞具备干细胞有关。首先,生存分析的结果表明,肝细胞癌患者更高的mRNAsi分数比肝癌患者预后差mRNAsi的得分越低。然后,三个模块采用WGCNA确定mRNAsi显著相关。蓝色、黄绿色模块与mRNAsi呈正相关,而黑色模块与mRNAsi负相关。接下来,所有的基因在上面的三个模块由单变量分析,套索和多元回归分析,进一步筛选出关键基因与预后价值。PTDSS2、MRPL9 SOCS2随后被确认。值得一提的是,使用地理和GEPIA数据库交互验证的结果表明PTDSS2和MRPL9在肝癌组织中,而SOCS2减少在肝细胞癌组织。和较高的表达水平PTDSS2和MRPL9 SOCS2以及表达水平较低,肝细胞癌患者的预后较差。随后,生存分析的结果使用TCGA和ICGC数据库确认风险评分基于“三基因签名在肝细胞癌预后的独立预测指标。与此同时,风险评分显著相关免疫细胞渗透模式、MSI,三甲,几个免疫分子,检查站和hypoxia-related基因。 Besides, the risk score was related to immunotherapy response and fifteen compounds targeting the three-gene signature were identified. Finally, we combined the risk score and pathological stage to construct a nomogram for clinical practice. The calibration plot, ROC curve, and decision curve analysis showed that the nomogram had a good ability to predict the OS of HCC patients.

病理分期是一种常用的方法来评估肝细胞癌患者的预后,但其精度容易受肝细胞癌的临床异质性。肝细胞癌生存预测模型的预测能力优于基于prognosis-related生物标志物病理阶段。prognostic-related生物标记的识别是建立multigenic生物标记的基础。由于肿瘤干细胞在肿瘤进展的重要作用,基于癌症干细胞的基因生物标志物特征可能有更好的预测能力。事实上,几个stemness-related生物标志物已报告直到现在。这些生物标志物包括mrna和非编码rna,例如,Artemin缺氧反应因素,起着重要的作用在低氧诱导CSC放大( 21]。Sox2是重要的二者的自我更新和不良预后的预测肝癌肝切除术后患者( 22]。Sox9对于维持干细胞特性二者[是必要的 23]。过度的SALL4和Cripto-1与预后较差有关 24, 25]。非编码rna,小分子核糖核酸和lncRNAs验证在扮演一个角色在肝癌干细胞特征的采集和维护。例如,mir - 137是肝癌肝细胞癌患者预后的生物标志物( 26]。miR-25的基因数可以促进肝癌干细胞的凋亡由PTEN / PI3K / Akt /坏信号通路( 27]。mir - 106 b - 5 - p具备干细胞能促进维护在肝细胞癌( 28]。mir - 150的超表达会导致周期阻滞和细胞凋亡的CD133(+)肝癌细胞和负调控CD133(+)肝癌干细胞( 29日]。此外,长非编码rna lnc-DILC和lncRNA-DANCR等潜在stemness-related预后生物标志物在肝细胞癌( 30., 31日]。此外,还有潜在的圆形rna和二者之间的相关性 32]。

尽管许多单个基因可以被认为是肝细胞癌预后标志物,许多专家认为,临床医生应该小心使用单个生物标记作为一个预后参数( 33]。据报道,尽管CD90和OCT4是独立的和可靠的生物标记物预测肝癌患者肝切除手术后的预后,两者的结合生物标志物可以更好地预测肝癌的预后比单独使用任何一个生物标志物 34]。此外,PTEN加上CD133的表达或EpCAM可以更好地监测肝癌的复发和预后预测( 35]。

我们的研究结果表明,“三基因签名包括PTDSS2 MRPL9, soc是良好的预后价值。PTDSS2蛋白质编码基因参与glycerophospholipids的生物合成和代谢途径。MRPL9是线粒体的蛋白编码基因翻译和病毒mRNA翻译途径。和SOCS2 IL10信号转导通路中的蛋白编码基因。先前的研究表明,沉默SOCS2能促进肝癌的进展,虽然PTDSS2和MRPL9 HCC的角色尚未完全理解( 36]。同时,研究中的富集分析结果表明,高风险的浓缩途径得分集团基于three-gene签名包括剪接体、细胞周期,膀胱癌,DNA复制,RNA降解,蛋白酶体。这些结果表明,PTDSS2的机制,MRPL9, SOCS2参与肿瘤恶化值得进一步研究。

近年来,肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗领域的一个热点,和时间起着重要的作用在抑制或增强免疫反应。因此,基因签名相关的时间和免疫治疗的反应不仅是重要的生物标志物探索肿瘤发生和发展的机制也将提供新的方法来改善当前免疫疗法的治疗效果。据我们所知,这个新的three-gene与癌细胞具备干细胞相关的签名,时间,和免疫反应可以作为一个新的生物标志物,丰富了对肝癌病人生存预测的评价方法。然而,需要进一步的研究来阐明这个three-gene签名所涉及的分子机制。

 5。结论

总之,我们发现了一个新的three-gene签名包括PTDSS2 MRPL9, soc,可以作为潜在的肝细胞癌预后的生物标志物。此外,基于“三基因签名的诺模图是一个可靠的工具,可以帮助临床医生开发更多个性化治疗肝癌患者。

 数据可用性

当前的研究的数据集分析TCGA可用的存储库( http://cancergenome.nih.gov/),ICGC ( https://icgc.org/)、地理( https://www.ncbinlm。国家卫生研究院。gov /地理/)。

 的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系,可以视为一个潜在的利益冲突。

 作者的贡献

李设计的研究和修订后的手稿。刘骏收集和分析数据。陆Jianjun解释数据并起草了手稿。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。刘骏和陆Jianjun同样这个工作和co-first作者。

 补充材料

看到数字S1基因coexpression加权网络的补充材料与肝癌之间的度和匹配的正常组织。参见图S2辅料的风险评分基于“三基因签名是一种预后生物标志物。参见图S3的辅料不同子组的生存分析除以临床病理的因素。参见图S4补充材料中一个独立的HCC队列从GEO数据库用于验证的预后价值风险评分基于“三基因签名。参见图S5的辅料与mRNA表达PTDSS2 kaplan meier生存分析,MRPL9, SOCS2。参见图S6补充材料丰富通路的调节基因被GSEA肝癌。参见图S7补充材料的免疫疗法的好处与风险评分有关。见表S1-S3 PTDSS2补充材料比较,MRPL9,和SOCS2表达水平之间的肝细胞癌和匹配相邻nontumor组织在地理数据库,分别。见表S4补充材料丰富通路的调节基因在肝细胞癌中使用GSEA。见表S5的补充材料中提出的潜在治疗化合物为高危人群。

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Y。 关 P。 李 B。 秦 Y。 的预后价值CD90和OCT4治疗后肝细胞癌切除 赘生物 2016年 63年 2 288年 298年 10.4149 / neo_2016_036 2 - s2.0 - 84969651818 26674131 苏 r . J。 南 h . C。 郭 H。 阮 z . P。 江 L . L。 首歌 Y Y。 南 k·J。 关联的组件的PTEN / AKT / mTOR通路与癌症干细胞标记和这些生物标志物在肝细胞癌的预后价值 肝脏病学研究 2016年 46 13 1380年 1391年 10.1111 / hepr.12687 2 - s2.0 - 84962809934 26932478 程ydF4y2Ba M。 魏 l 法律 c . T。 曾荫权 f . H。 沈 J。 程 c . L。 曾荫权 l . H。 何 d . W。 赵 d·K。 李 j . M。 黄 c . c . L。 Ng i o . L。 黄 c . M。 RNA N6-methyladenosine methyltransferase-like 3促进肝癌进展通过YTHDF2-dependent SOCS2转录后的沉默 肝脏病学 2018年 67年 6 2254年 2270年 10.1002 / hep.29683 2 - s2.0 - 85045848486 29171881