SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/9369268 9369268 研究文章 线粒体Morphology-Related的表达变化的基因在小鼠胚胎干细胞的分化 李 宋Eon 1 搜索引擎优化 Bong郑大世 1 汉 分钟记 1 在香港 产小羊居 1 在香港 Kwonho 1 首歌 Hyuk 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2649 - 9677 李 宋Woong 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 6721 - 1441 做 宋Tae 1 萨奥尔 海因里希 1 干细胞和再生生物技术 KU科技学院 建国大学 120年Neungdong-ro Gwangjin-gu 05029年首尔 韩国 konkuk.ac.kr 2 Biotherapeutics转化研究中心 韩国生物科学和生物技术研究所 大田市305 - 806 韩国 kribb.re.kr 2020年 28 1 2020年 2020年 22 08年 2019年 17 12 2019年 07年 01 2020年 28 1 2020年 2020年 版权©2020年宋Eon李et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

在胚胎发育过程中,细胞进行基因表达的变化、信号通路的激活/失活,新陈代谢,和胞内细胞器结构,由线粒体。线粒体之间不断切换形态细长的管状通过线粒体融合与分裂和支离破碎的球状。线粒体融合是由蛋白质编码 Mfn1, 进行Mfn2, Opa1,而线粒体分裂是由蛋白质编码 Fis1和 Dnm1L。在这里,我们调查mitochondria-related基因的表达模式在小鼠胚胎干细胞的分化(ESCs)。多能的ESCs具备干细胞维持在白血病抑制因子(生活)通过JAK-STAT3途径但是失去多能性和区分的撤军生活。我们分析了线粒体融合- - - fission-related基因的表达水平在的ESCs的分化。我们假设线粒体融合基因是基因过表达而裂变是在ESCs的分化表达下调。尽管ESCs的线粒体表现出的细长的形态区分在撤退时,应对生活的表达 进行Mfn2增加的吗 Dnm1L正如所料,减少其他例外 Mfn1, Opa1, Fis1。接下来,通过比较基因表达和线粒体的形态,我们提出一个索引,可以精确地代表线粒体变化在多能干细胞的分化表达比率的分析三个融合——和两个fission-related基因。令人惊讶的是,增加 进行Mfn2/ Dnm1L比与伸长过程中线粒体的ESCs的分化。此外,应用指数和其他专门的细胞类型显示,神经干细胞(nsc)和小鼠胚胎成纤维细胞(mef)增加 进行Mfn2/ Dnm1LESCs比率相比。因此,我们建议 进行Mfn2/ Dnm1L比率可以反映线粒体形态的变化根据分化的程度。

 科技部、ICT和未来规划 2015年r15a1009701 2016年m3a9b6946835 1。介绍

在胚胎发育过程中,细胞进行各种基因表达的变化( 1, 2和信号通路 3]。代谢和细胞内细胞器结构发展和分化过程中也改变了( 4- - - - - - 6]。具体来说,organellar变化观察到多能性的恢复期间(也称为重组) 7]。例如,Folmes等人表明,线粒体的球状形状逐渐改变在胚胎发育从受精卵到细长的体节胚胎。因此,代谢丙酮酸氧化等特性,葡萄糖氧化、糖酵解、磷酸戊糖途径(PPP)也改变了动态( 6]。这些特性回归在重组过程中发育早期状态( 8]。一些最戏剧性的变化在细胞发育和分化发生在线粒体,细胞过程中发挥重要作用,包括能量代谢( 9,细胞凋亡 10),老化( 11)、活性氧生产、钙稳态和分化( 12]。

线粒体不断改变自己的形态通过聚变和裂变反应细胞的需求,这是线粒体质量控制的关键。此外,线粒体增加人口通过从现有的线粒体也有自我分裂;这被称为线粒体生物起源( 13- - - - - - 16]。线粒体动力学和生物起源不同的细胞类型和细胞环境。此外,线粒体的数量和质量会影响细胞行为和在细胞代谢中发挥关键的作用[ 17]。

在胚胎植入前的胚胎多能干细胞,不成熟的线粒体表现为一个小和不发达的球形嵴观察( 14, 18, 19]。与不成熟的细胞线粒体显示低氧消耗和高水平的糖酵解酶( 20.]。因此,未分化的胚胎干细胞(ESCs)也表现出低水平的ATP生产、适度水平的抗氧化酶,穷人和氧化剂能力( 14, 19, 20.]。ESCs分化后,这些细胞中线粒体变得细长,显示发达嵴和密度矩阵( 21];这导致高耗氧量和ATP生产更高效的细胞活动( 14, 18, 19]。

在哺乳动物中,线粒体形态开关之间的细长的管状和支离破碎的球状聚变和裂变,分别为( 22, 23]。线粒体融合是由dynamin家庭gtpase如mitofusin (MFN) 1,进行MFN2,视神经萎缩1 (OPA1) [ 24- - - - - - 26]。虽然确切的融合机制尚未被定义,MFN1进行MFN2形成二聚体,将自己插入到线粒体外膜,而OPA1位于线粒体内膜( 27, 28]。进行MFN2 MFN1, OPA1包含GTPase域,疏水七个重复(人力资源)域和跨膜域( 24, 29日]。进行MFN2 MFN1和线粒体融合中扮演类似的角色功能,因此可以相互替换,形式同型的或异形的二聚体( 25, 30.]。

相反,主要的蛋白质与线粒体分裂FIS1 ( 31日- - - - - - 33)和dynamin-related蛋白1 (DNM1L,也称为DRP1) ( 34- - - - - - 36]。DNM1L主要位于胞质和招募了线粒体的外膜,它诱发裂变 30.]。FIS1位于线粒体外膜和DNM1L密切相关 32, 33]。DNM1L可以与其他线粒体分裂的蛋白质,包括线粒体(MFF)和FIS1裂变因素。有趣的是,最近的一项研究表明,DNM1L可以与融合蛋白交互最惠国,促进MFN-mediated融合( 30.]。尽管许多研究已经评估了聚变和裂变的线粒体,线粒体动力学机制和信号通路决定仍不清楚。激活的哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)通路的撤军制药业诱导小鼠ESC分化等多能性基因的抑制 Klf4, Oct4, Nanog( 37]。多能干细胞分化时,他们需要更多的能量来满足他们的需求,新获得的功能( 6]。

因此,线粒体进行动态重构在分化,因此,线粒体形态和代谢改变。因此,我们推测,线粒体融合- - - fission-related基因的表达可能是改变朝着一个方向在ESCs的自发分化。在这里,我们量化聚变相关基因的表达水平 Mfn1, 进行Mfn2, Opa1和fission-related基因 Fis1和 Dnm1L在小鼠的ESCs的分化。在这里,我们研究了这些基因以确定他们是否可以作为一个索引的分化程度和线粒体形态的变化。

 2。材料和方法

在这项研究中使用的所有方法进行按照动物保健和使用指南,和所有实验协议批准制度建国大学动物保健和使用委员会。

2.1。细胞培养

鼠标的ESCs (E14tg2a)从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和培养文化菜分层和灭活mef ESC介质,由杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco)补充15%胎牛血清(的边后卫;HyClone), 1×青霉素、链霉素、谷氨酰胺(P / S / G;Gibco), 0.1毫米不必要的氨基酸(NEAAs;Gibco), 1毫米 β巯基乙醇(Gibco)与1000 U /毫升白血病抑制因子(ESGRO Chemicon国际)。MEF猪明胶培养基中培养涂以0.15%(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在MEF介质组成的DMEM (Gibco)补充15%的边后卫(HyClone), 1 x P / S / G (Gibco), 0.1毫米NEAAs (Gibco),和1毫米 β巯基乙醇(Gibco)。nsc在培养皿中培养猪明胶(σ)涂上0.15% NS介质组成的DMEM:营养混合物F-12 (Gibco), 0.5毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA;σ),1% N2补充(Gibco), 1 x NEAAs (Gibco), 1 x P / S / G (Gibco), 10 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF;研发系统),和10 ng / mL表皮生长因子(EGF);Gibco)。细胞系都在37°C的环境的氛围中5%的股份有限公司2对组织文化和维护菜(康宁,阿姆斯特丹,荷兰)。

 2.2。体外<斜体> < /斜体>分化

具备干细胞多能ESCs维持生活通过JAK-STAT3通路的存在。然而,当这条抑制反应生活,多能ESCs随机分化为内胚层的,外胚层和中胚层细胞。Cherepkova等人表明生活撤军诱导小鼠ESC分化通过mTOR通路的激活 37]。基于差异化协议,我们已经建立了一个ESC分化协议已经定制了我们实验室的条件。ESCs preplating过程中,与馈线细胞培养被trypsin-EDTA分离(0.25%)(Gibco)和转移到0.15% gelatin-coated菜和孵化37°C的氛围中5%的股份有限公司22 h将馈线细胞。因为支线细胞附着在gelatin-coated盘比ESCs更早,文化的上层清液主要包含的ESCs没有馈线细胞的污染。上层清液被转移到另一个gelatin-coated菜和用作分化实验。为 在体外分化, 1 × 10 5 ESCs被播种在100 mm细胞培养菜猪涂以0.15%明胶(σ)MEF媒介。媒介是分化的每天刷新15天。刮收集的细胞进行实验分析。

 2.3。RNA隔离和存在

总RNA分离使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。1毫克的互补脱氧核糖核酸是合成总RNA使用上标三世逆转录酶(表达载体)和低聚糖(dT) 20底漆(英杰公司)根据制造商的指示。qPCR进行复制与权力SYBR绿色主人混合(豆类、志贺、日本)和结果分析了罗氏LightCycler 5480(罗氏)。热循环进行了通过45周期10 s在95°C, 10 s 60°C, 20年代在72°C。的引物中存在如表所示 1。基因表达水平的规范化 Actb。

用于定量rt - pcr引物组。

基因 向前 反向
Mfn1 5 ′ -CATGGGCATCATGGTTGTTGGG-3 ′ 5 ′ -TCTCCACTGCTCGGGTGTAG-3 ′
进行Mfn2 5 ′ -CAAGTGTCCGCTCCTGAAGG-3 ′ 5 ′ -GAACCTCCTTGGCAGACACG-3 ′
Opa1 5 ′ -CAAGCATTACAGGAAGGTGTCAGAC-3 ′ 5 ′ -CACTGAGAGTCACCTTCACTGG-3 ′
Fis1 5 ′ -CATCGTGCTGCTGGAGAGC-3 ′ 5 ′ -GCAGAGAGCAGGTGAGGCTG-3 ′
Dnm1L 5 ′ -GGAGTTGAAGCAGAAGAATGGGG-3 ′ 5 ′ -CAGTGACGGCGAGGATAATGG-3 ′
Oct4 5 ′ -GATGCTGTGAGCCAAGGCAAG-3 ′ 5 ′ -GGCTCCTGATCAACAGCATCAC-3 ′
Nanog 5 ′ -CTTTCACCTATTAAGGTGCTTGC-3 ′ 5 ′ -TGGCATCGGTTCATCATGCTAC-3 ′
T 5 ′ -CCGGTGCTGAAGGTAAATGT-3 ′ 5 ′ -CCTCCATTGAGCTTGTTGGT-3 ′
Actb 5 ′ -CGCCATGGATGACGATATCG-3 ′ 5 ′ -CGAAGCCGGCTTTGCACATG-3 ′
2.4。免疫印迹分析

总细胞细胞溶解使用缓冲区里帕(热费希尔)根据制造商的指示。细胞溶解产物(20 μg蛋白)分离NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris凝胶(表达载体)和转移到聚乙烯二氟化物膜。膜被封锁使用屏蔽解决方案包含5%的脱脂奶粉和0.05%的渐变20磷酸盐(PBS)。本研究中使用的主要抗体如下:anti-OCT4(兔子,1:1000;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),anti-Nanog(兔子,1:1000;Abcam,剑桥,英国),anti-MFN2(鼠标,1:1000;Abcam)、anti-DRP1(兔子,1:1000;微孔),anti-MFN1(鼠标,1:1000;Abcam)、anti-FIS1(鼠标,1:500;Abcam)和反 β肌动蛋白(鼠标,1:10000;σ)。一夜之间,细胞膜被潜伏在这些抗体在4°C。二次抗体与anti-mouse共轭IgG-peroxidase (1: 10000;σ),抗体IgG-horseradish过氧化物酶(合),和anti-rabbit IgG-HRP (1: 10000;圣克鲁斯生物技术),膜是孵化这些抗体在室温下为90分钟。

抗原被发现使用皮尔斯ECL西方墨点法化学发光底物(热费希尔),根据制造商的指示。屁股被暴露在x射线胶片开发和剥膜的重用。反 β肌动蛋白抗体(鼠标,1:10000;σ)是用作控制。微乐队的蛋白质及其加载控件使用ImageJ 1.43 (NIH)执行软件。蛋白表达水平的规范化 Actb。

 2.5。免疫细胞化学

免疫细胞化学,细胞被固定用4%多聚甲醛在室温下20分钟。细胞用PBS洗净,然后用PBS包含3%牛血清白蛋白和0.03% Triton x - 100在室温下30分钟。细胞培养与以下主要抗体:anti-OCT4 (1: 500;圣克鲁斯生物技术)、anti-Nanog (1: 200;Abcam),反 βIII-tubulin (TUJ1;1:500;研发)、anti-SMA (1: 200;Abcam), anti-SOX17 (1: 300;研发),anti-TOM20 (1: 200;圣克鲁斯生物技术)。荧光标记(Alexa萤石488或647;Abcam)二级抗体被用于根据制造商的规格。图片anti-TOM20染色得到用共焦显微镜(蔡司)。

 2.6。电子显微镜

透射电子显微镜(TEM)实验中,样品固定在4%多聚甲醛(σ)和2.5%戊二醛磷酸(σ)0.1(σ)缓冲24 h。在0.1磷酸盐缓冲剂,洗后样品1 h后缀的1%四氧化锇(σ)准备在同一个缓冲区。样本与分级脱水一系列酒精浓度,嵌入在环氧树脂812,聚合60°C 3天。超薄部分(60 - 70海里)获得使用超微切片机(徕卡Ultracut节点),收集网格(200网),并分析了在TEM (JEM 1010)操作60 kV,由电荷耦合器件相机和图像记录(SC1000;Gatan)。

 2.7。线粒体长度分析

电子显微镜的图像进行了分析和测量ImageJ 1.43 (NIH)软件计算最大(Max) /最小/ (Min)比线粒体长度。至少有五十多个线粒体被测量和分析每个样本来获得数据。

 2.8。统计分析

所有实验进行了一式三份,和数据了 的意思是 ± 标准 错误 的 的意思是 扫描电镜 。差异评估使用单向方差分析与图基的诚实的显著差异(HSD)后的费雪的或至少显著不同(LSD)职位的适当为多个比较,和差异 p 小于0.05的值被认为是重要的。

 3所示。结果 3.1。多能性的变化,组织标记在鼠标的ESCs的分化

检查在ESCs的分化的基因表达的变化,我们随机分化鼠标ESCs撤军的生活没有馈线细胞为0,3、6、9、12、15天(图 1(一))。ESCs Dome-like殖民地的未分化变得平坦,显示形态学的变化。首先,我们检查的ESCs是否正确区分 在体外在分化培养基后15天。免疫细胞化学分析表明,Oct4、Nanog在未分化的ESCs表示,沉默在分化后15天。分化标记,特异性神经元第三类 β微管蛋白(Tuj1),平滑肌肌动蛋白(SMA),并为外胚层的SRY-box 17 (Sox17),中胚层,内皮细胞,分别在未分化的ESCs没有检测到第0天却发现分化后15天,表明ESCs失去多能性和分化成不同的细胞类型,包括所有三个胚芽层(图 1 (b))。

在体外分化和的ESCs的表征。(a)相差0 ESCs的图像和分化细胞在天,3、6、9、12、15。 规模 酒吧 = 200年 μ 米 。多能性的(b)免疫荧光图像标记Oct4 Nanog和为外胚层的分化标记(Tuj1),中胚层(SMA),内胚层的(Sox17)细胞未分化的ESCs ESC-derived分化细胞在0到15天。核与DAPI复染色。 规模 酒吧 = One hundred. μ 米 。ESCs (c, d)定量rt - pcr分析,区分细胞天0,3、6、9、12、15 (D0, D3, D6, D9 D12,和D15)。数据了 的意思是 ± 扫描电镜 为 n = 3 独立的实验。(c)多能标记 Oct4和 Nanog表达式在0到15天。(d)分化标记 T表达式从0到15天。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 而D0。

接下来,我们评估多能性和分化标记的表达水平定量逆转录聚合酶链反应(存在)分析(数据 1 (c)和 1 (d))。多能性标记的表达水平 Oct4( F = 34.18 , p < 0.001 ), Nanog( F = 1927.49 , p < 0.001 )逐渐减少的ESCs分化(图 1 (c))。相比之下,早期中胚层标记 T(也称为Brachyury)(单向方差分析与图基HSD F = 455.71 , p < 0.001 )表达增加,直到天6 postdifferentiation然后表达下调之后(图 1 (d)),表明早期中胚层细胞分化后出现在6天,然后进一步分化。综上所述,我们的研究结果表明,ESCs分化逐渐失去了多能性超过15天仍退出ESC的媒介。

 3.2。线粒体形态的变化在鼠标的ESCs的分化

线粒体形态将改变从分散到细长的形状在ESCs的分化。首先,我们调查了线粒体生物起源的疣状使用抗体针对移位酶外膜20 (TOM20),这是在线粒体外膜的ESCs的分化。在的ESCs,线粒体(绿点在补充图。 1均匀地分布在细胞质中。然而,绿点的数量一直在增加自ESCs的分化(补充图。 1)。接下来,我们观察到线粒体形态分化中准确地通过电子显微镜分析的ESCs(图 2(一个))。未分化的ESCs主要有球状线粒体与不成熟的嵴,这形态保持直到第三天的区别。从6到15天,线粒体逐渐拉长和显示成熟嵴(图 2(一个))。我们测量了线粒体的最大和最小轴(单向方差分析与图基HSD马克斯: F = 24.25 , p < 0.001 ;分钟: F = 31.87 , p < 0.001 )来量化线粒体(数据长度 2 (b)和 2 (c)(补充图)包括线粒体周边和区域。 2 a - b)。线粒体的最大/最小比率(单向方差分析与图基HSD F = 27.10 , p < 0.001 )是1.51,1.66,3.65,3.92,4.30,和6.87天0、3、6、9、12和15(图 2 (d))。这些数据清楚地表明,球状,不成熟的线粒体的ESCs变得细长,显示发达成熟的嵴后自发分化。

在分化的ESCs线粒体形态的变化。(a)电子显微镜图像未分化的ESCs的线粒体和细胞分化的ESCs天0、3、6、9、12、15。黄色虚线代表线粒体形态。 规模 酒吧 = 0.5 μ 米 。(b)测量的最大(Max)和最小(最小值)轴的线粒体。(c)线粒体长度(nm)在天的ESCs 0, 3、6、9、12和15的区别(量化 n = 128年 0天,28日21细胞细胞的第三天,一天6日16个细胞15细胞的9天,15天的细胞12和17细胞一天15)。(d) ESCs的最大/最小比率和分化细胞在天0,3、6、9、12、15。数据了 的意思是 ± 扫描电镜 对于一个实验。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 而D0。

 3.3。线粒体的变化Morphology-Related基因在鼠标的ESCs的分化

因为线粒体是细长的ESCs的分化期间,我们预测,聚变相关基因是调节和fission-related基因是在这分化表达下调。因此,我们研究了线粒体morphology-related基因中存在分析。出乎意料,聚变相关的基因 Mfn1(单向方差分析与图基HSD F = 604.95 , p < 0.001 )是逐步下调,而 进行Mfn2(单向方差分析与图基HSD F = 11.10 , p < 0.001 ), Opa1(单向方差分析与图基HSD F = 85.53 , p < 0.001 在第三天)表达模式波动postdifferentiation(图 3(一个))。接下来,我们评估两种fission-related基因的表达, Dnm1L和 Fis1(图 3 (b));符合减少线粒体分裂,导致增强线粒体伸长,Dnm1L的表达(单向方差分析与图基HSD F = 385.64 , p < 0.001 )降低鼠标的ESCs经历了自发分化(图 3 (b))。然而, Fis1(单向方差分析与图基HSD F = 2.57 , p = 0.083 )表达式并没有减少,而是在差别后轻微的增加对这些基因的分化(图的开始 3 (b))。这个结果支持先前的调查结果,FIS1不如DNM1L线粒体相关裂变和功能招募DNM1L线粒体( 38, 39]。总的来说,我们的结果表明, 进行Mfn2和 Dmn1L信使rna表达水平反映线粒体伸长与ESC分化。

表达水平的变化线粒体融合- - - fission-related基因和索引的融合,fission-related基因的组合。定量rt - pcr分析(一)线粒体聚变相关基因( Mfn1, 进行Mfn2, Opa1)和(b)线粒体fission-related基因( Fis1和 Dnm1L)天0、3、6、9、12、15后的ESCs的分化。基因表达水平的规范化 Actb。(c) 6个组合比率分析的基因表达水平之间的三个融合和两个分裂的基因。(d)的表达蛋白免疫印迹OCT4、进行MFN2, DNM1L。 β肌动蛋白是用来控制其他蛋白质。(e)进行MFN2 / DNM1L蛋白比率逐渐增加根据ESC分化后的运行时间。所有数据了 的意思是 ± 扫描电镜 为 n = 3 独立的实验。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 而D0。

进行MFN2因此,我们接下来研究的水平和DNM1L蛋白免疫印迹的ESCs分化细胞(0)和天0、3、6、9、12、15(图 3 (d))。作为ESC控制自发分化,多能性标记的表达OCT4逐渐减少在分化和几乎检测不到15天。进行MFN2 ESCs表示在一个较低水平,但显示出显著增加表达在自发分化。此外,蛋白质含量表现出波动中进行MFN2表达式模式在分化,类似于存在数据(数据 3(一个)和 3 (d))。DNM1L ESCs的分化期间蛋白质含量逐渐减少,类似于存在分析(数据的结果 3 (b)和 3 (d))。因此,我们观察到类似的mRNA和蛋白水平的变化这两个目标。

 3.4。建立索引代表的分化程度

鉴于许多基因参与线粒体融合与分裂不与线粒体形态,我们下一个试图找到索引代表线粒体形态。基于存在的数据,我们分析了三个融合之间的比率,和两个fission-related基因在ESCs的分化。总共6组合比率三个融合——和两个fission-related基因进行了分析(图 3 (c))。其中的一个, 进行Mfn2 / Dnm1L比(单向方差分析与图基HSD F = 31.24 , p < 0.001 ),是有趣的,因为它是类似于线粒体长度最大值/最小值比在ESCs的分化(数字 2 (d)和 3 (c)在红场)。为进一步评价,我们进行了相关分析 进行Mfn2 / Dnm1L比和线粒体长度(补充图。 3)。接下来,我们证实了蛋白表达水平 进行MFN2 / DNM1L比(单向方差分析与图基HSD F = 25.56 , p < 0.001 )(图 3 (e)补充图。 4)。事实上,进行MFN2 / DNM1L比率也类似于mRNA表达和线粒体长度最大值/最小值比率。因此,我们得出结论,ESC自发分化过程中线粒体的变化可以反映在逐步增加 进行Mfn2 / Dnm1L比率。

 3.5。进行Mfn2 / Dnm1L指数代表线粒体形态分化的程度

调查这个索引是否适用于其他细胞,我们这个比率的ESCs相比,神经干细胞(nsc)和小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。我们选择这些细胞类型,因为ESCs是无差别的,nsc不太专业,和mef是有区别的。只有ESCs表达高水平的 Oct4与费雪的LSD(单向方差分析, F = 33.18 , p < 0.001 ), Nanog与费雪的LSD(单向方差分析, F = 2051.34 , p < 0.001 )(图 4 (b))。虽然线粒体聚变相关基因的信使rna表达水平 进行Mfn2与费雪的LSD(单向方差分析, F = 7.12 , p < 0.05 在这些细胞类型)是稍微改变,线粒体fission-related基因的信使rna表达水平 Dnm1L与费雪的LSD(单向方差分析, F = 804.07 , p < 0.001 nsc和mef(数据)是逐渐减少 4 (c)和 4 (d)),符合观察线粒体形态(图的变化 4(一))。接下来,我们应用了 进行Mfn2 / Dnm1L比(单向方差分析与费舍尔的迷幻药, F = 50.42 , p < 0.001 这些细胞类型),调整1.0的ESCs的比率。有趣的是,调整后的 进行Mfn2/ Dnm1LESCs比率分别为1.0、2.97和3.86,nsc, mef,分别。接下来,我们还证实进行MFN2 DNM1L蛋白质表达(图 4 (f))。正如所料,DNM1L蛋白表达水平下降在nsc mef,相比之下,那些ESCs。有趣的是,蛋白质中进行MFN2表达水平逐渐增加在nsc, mef。的 进行MFN2 / DNM1L蛋白表达率(单向方差分析与费舍尔的迷幻药, F = 19660.5 , p < 0.001 ESCs)分别为0.16、2.94和4.61,nsc, mef,分别。因此,我们得出结论 进行Mfn2 / Dnm1L比在mRNA和蛋白表达水平与线粒体(数据的长度 4 (e)- - - - - - 4 (g))。

进行Mfn2/ Dnm1L比率的ESCs, nsc, mef。(一)电子显微镜图像未分化的ESCs的线粒体,nsc, mef。黄色虚线代表线粒体形态。 规模 酒吧 = 0.5 μ 米 。定量rt - pcr分析,(b)多能,线粒体融合,(c)和(d)线粒体fission-related ESCs基因,nsc, mef。基因表达水平的规范化 Actb。(e) 进行Mfn2/ Dnm1L基因表达的ESCs比率,nsc, mef。(f)的表达式进行MFN2 DNM1L和免疫印迹的ESCs, nsc, mef。 β肌动蛋白是用来控制其他蛋白质。(g)进行MFN2 / DNM1L ESCs蛋白质比例,nsc, mef。所有数据了 的意思是 ± 扫描电镜 为 n = 3 独立的实验。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 而D0。

 4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了线粒体动力学morphology-related基因,负责线粒体融合与分裂,在鼠标的ESCs的分化。鉴于分化细胞包含ESCs细长的线粒体和线粒体含有球状( 9),我们将观察增加线粒体聚变相关基因的表达( Mfn1, 进行Mfn2, Opa1)和减少fission-related基因的表达( Fis1和 Dnm1L)。

这是因为一些报告表明,聚变相关基因的超表达等 进行Mfn2 Mfn1 /( 25), Opa1( 40)诱导线粒体mef伸长。在这种背景下,fission-related基因的超表达等 Drp1( 41), Fis1( 42)诱导线粒体碎片在mef和海拉细胞,分别。然而,只有细微的表达水平的变化 Mfn1和 Opa1在分化和表达的变化 Fis1与预期的结果。实际上,FIS1据报道有一个较弱的影响线粒体分裂比DNM1L mef但不是在海拉( 39, 41, 42)可能是由于不同的线粒体形态调控机制在人类和老鼠。先前的研究表明,功能丧失的实验 Mfn1或 进行Mfn2缺乏导致分散线粒体形态和损失 进行Mfn2比失去更有戏剧性的效果吗 Mfn1( 25]。此外,OPA1蛋白酶同功酶和OMA1线粒体融合的处理,可能不会反映线粒体的形态( 43]。这是因为各种蛋白质影响的处理OPA1线粒体融合蛋白的功能。

接下来,我们旨在确定一个特殊指数逐渐增加在ESC自发分化。我们发现逐渐增加 进行Mfn2/ Dnm1L比密切相关的线粒体伸长ESCs的分化后的运行时间。此外,我们进行了相关分析 进行Mfn2 / Dnm1L和 Mfn1 / Fis1(单向方差分析与图基HSD F = 463.54 , p < 0.001 与线粒体长度)的比率,因为这些比率一致的模式,如增加或减少。有趣的是, 进行Mfn2 / Dnm1L( R 2 = 0.8874 )比模式更与线粒体的长度比 Mfn1 / Fis1( R 2 = 0.4149 )比(补充图。 3 a - b)。此外,我们发现这个索引可以应用到其他类型的细胞,包括国家安全委员会和mef。更专业的细胞显示更高 进行Mfn2/ Dnm1L比率比ESCs。

我们的研究也有一些局限性。首先,技术含量高成像和机器学习等最近开发的分析线粒体的形状 44]。这一技术方法允许线粒体通过进一步细分的分析线粒体的形状,例如,支离破碎,棒,网络,和大/圆。然而,基因的功能,影响线粒体的动态还没有确定,因此无法解释线粒体如何形成一个网络 9]。因此,我们专注于线粒体在两类分类,即:、分散和细长。在进一步的研究中,结合高通量基因筛选利用RNA序列进行排序相关的基因集线粒体动力学将是必要的;机器学习的高分辨率成像系统依赖于线粒体形态根据细胞类型。然后,我们最终将能够理解各种现象与线粒体的形状和我们如何监管它。第二,一些细胞在分化的最后阶段如红血球生成的细胞( 45, 46和肝细胞 47)分散的线粒体。如果ESCs被生活撤军分化,各种类型的细胞将分化细胞中观察到的人口( 37, 48),包括红血球生成的细胞和肝细胞。线粒体的分裂与细胞的特定角色不能局限于基因表达,控制线粒体的动态。否则,我们表明,线粒体周边和地区补充图。 2 a - b。这些逐渐扩大的误差根据时间的流逝。这意味着有不同的细胞类型,不同的线粒体的形态区分15天。

因此,基因表达模式的趋势只能被解释为索引,预测的分化程度和线粒体的形状,由于随机(即分化过程。,没有lineage-specific分化)。因此,我们的研究结果表明,这一比率也可以用作线粒体形态指数在分化。

 数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

 伦理批准

在这项研究中使用的所有方法进行按照动物保健和使用指南,和所有实验协议批准制度建国大学动物保健和使用委员会。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

凝胶,毕加索、KH和JTD写主要的手稿文本和设计研究。凝胶,毕加索,YJH MJH进行实验和分析数据。凝胶,毕加索,HS和JWL进行数据分析。所有作者回顾了手稿。宋Eon李和Bong Jong Seo的贡献同样这项工作。

 确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部,ICT和未来规划大韩民国(批准号2016 m3a9b6946835和2015 r15a1009701)。

 补充材料

补充图1:表达模式的TOM20天0、3、6、9、12、15后的ESCs的分化。绿点代表线粒体。核与DAPI复染色。 规模 酒吧 = 10 μ 米 。补充图2:(a)线粒体周长( μ0米)在区分的ESCs天,3、6、9、12、15。(b)线粒体区( μ米2)在区分的ESCs天0、3、6、9、12、15。数据了 的意思是 ± 扫描电镜 为 n = 50 独立的实验。 ∗ p < 0.05 , ∗ ∗ p < 0.01 , ∗ ∗ ∗ p < 0.001 而D0。补充图3:(a)之间的相关分析进行Mfn2 / Dnm1L比率和线粒体规范化的最大长度的ESCs (D0)。(b)之间的相关分析Mfn1 / Fis1比率和线粒体规范化的最大长度的ESCs (D0)。补充图4:(a)规范化DNM1L蛋白质的蛋白质含量在0,3、6、9、12、15后的ESCs的分化。(b)规范化进行MFN2蛋白质水平的蛋白质在天0,3、6、9、12、15后的ESCs的分化。蛋白表达水平正常化Actb。所有数据了 的意思是 ± 扫描电镜 为 n = 3 独立的实验。 ∗ ∗ ∗ p < 0.001 而D0。

 卡特 m·G。 Hamatani T。 Sharov 答:一个。 卡马克 c, E。 钱 Y。 Aiba K。 Ko n . T。 Dudekula d·B。 Brzoska p . M。 黄 美国年代。 Ko m . S。 在小说situ-synthesized微阵列优化老鼠干细胞和发育早期表达分析 基因组研究 2003年 13 5 1011年 1021年 10.1101 / gr.878903 2 - s2.0 - 0038781861 12727912 Hamatani T。 卡特 m·G。 Sharov 答:一个。 Ko m . s . H。 全球基因表达的动态变化在老鼠胚胎植入前的发展 细胞发育 2004年 6 1 117年 131年 10.1016 / s1534 - 5807 (03) 00373 - 3 2 - s2.0 - 0347763875 14723852 王 问:T。 Piotrowska K。 Ciemerych m·A。 Milenkovic l 斯科特 m P。 戴维斯 r·W。 Zernicka-Goetz M。 全基因组基因活性的研究揭示了发展信号通路在胚胎植入前的老鼠胚胎 细胞发育 2004年 6 1 133年 144年 10.1016 / s1534 - 5807 (03) 00404 - 0 2 - s2.0 - 0345872510 Leese h·J。 在胚胎植入前的代谢控制哺乳动物发展 人类生殖更新 1995年 1 1 63年 72年 10.1093 / humupd / 1.1.63 2 - s2.0 - 0029171260 9080207 范Blerkom J。 线粒体在人类卵子发生和胚胎植入前的胚胎发生:引擎的新陈代谢,离子调控和发育能力 繁殖 2004年 128年 3 269年 280年 10.1530 / rep.1.00240 2 - s2.0 - 4544353776 15333778 Folmes c。d . L。 Dzeja p。P。 纳尔逊 t。J。 Terzic 一个。 代谢可塑性干细胞体内平衡和分化 细胞干细胞 2012年 11 5 596年 606年 10.1016 / j.stem.2012.10.002 2 - s2.0 - 84868347607 23122287 崔 h·W。 金 j . H。 钟 m·K。 在香港 y . J。 张成泽 h·S。 搜索引擎优化 b . J。 荣格 t·H。 金 j·S。 钟 h . M。 Byun 美国J。 汉 s G。 搜索引擎优化 h·G。 做 j . T。 线粒体和代谢重构在重组和重新编程细胞的分化 干细胞与发展 2015年 24 11 1366年 1373年 10.1089 / scd.2014.0561 2 - s2.0 - 84925762051 25590788 Panopoulos 答:D。 严 O。 鲁伊斯 年代。 智库 y S。 Diep D。 Tautenhahn R。 更好地 一个。 Batchelder e . M。 Plongthongkum N。 鲁茨 M。 伯格伦 w·T。 张 K。 埃文斯 r·M。 Siuzdak G。 Belmonte j . c。I。 诱导多能干细胞的代谢物揭示代谢变化发生在体细胞重编程 细胞研究 2012年 22 1 168年 177年 10.1038 / cr.2011.177 2 - s2.0 - 84855490988 22064701 搜索引擎优化 B。 尹 年代。 做 J。 线粒体动力学在干细胞和分化 国际分子科学杂志》上 2018年 19 12 3893年 10.3390 / ijms19123893 2 - s2.0 - 85058263581 30563106 孙 d F。 诺里斯 k . L。 Youle r . J。 线粒体动力学和细胞凋亡 基因与发展 2008年 22 12 1577年 1590年 10.1101 / gad.1658508 2 - s2.0 - 45349094984 18559474 Bratic 一个。 拉赫松 n G。 线粒体在衰老的作用 《临床研究杂志》上 2013年 123年 3 951年 957年 10.1172 / JCI64125 2 - s2.0 - 84874591240 23454757 Wanet 一个。 阿诺德) T。 Najimi M。 里纳德 P。 连接线粒体、新陈代谢和干细胞的命运 干细胞与发展 2015年 24 17 1957年 1971年 10.1089 / scd.2015.0117 2 - s2.0 - 84939238182 26134242 科· B。 生物能量学线粒体融合与分裂的作用 Biochimica et Biophysica学报 2012年 1817年 10 1833年 1838年 10.1016 / j.bbabio.2012.02.033 2 - s2.0 - 84864669289 22409868 赵 y . M。 Kwon 年代。 Pak y K。 Seol h·W。 崔 y . M。 公园 d . J。 公园 k . S。 李 h·K。 动态改变线粒体生物起源和抗氧化酶在自发的人类胚胎干细胞的分化 生物化学和生物物理研究通信 2006年 348年 4 1472年 1478年 10.1016 / j.bbrc.2006.08.020 2 - s2.0 - 33747875396 16920071 陈 H。 陈 d . C。 在哺乳动物的线粒体动力学 当前主题在发育生物学 2004年 59 119年 144年 10.1016 / s0070 - 2153 (04) 59005 - 1 2 - s2.0 - 2142758117 陈 d . C。 在哺乳动物的线粒体融合与分裂 细胞和发育生物学的年度审查 2006年 22 1 79年 99年 10.1146 / annurev.cellbio.22.010305.104638 2 - s2.0 - 33750445482 傅 W。 刘 Y。 阴 H。 线粒体动力学:生物起源、裂变、聚变和mitophagy干细胞行为的监管 干细胞国际 2019年 2019年 15 10.1155 / 2019/9757201 2 - s2.0 - 85071083563 31089338 9757201 圣约翰 j . C。 Ramalho-Santos J。 灰色的 h·L。 Petrosko P。 Rawe 诉Y。 Navara c·S。 施麦尔 c·R。 Schatten g . P。 线粒体DNA转录因子的表达在早期心肌细胞从人类胚胎干细胞体外分化 克隆和干细胞 2005年 7 3 141年 153年 10.1089 / clo.2005.7.141 2 - s2.0 - 27744563079 16176124 钟 年代。 Dzeja P P。 Faustino r S。 Perez-Terzic C。 贝法尔 一个。 Terzic 一个。 线粒体氧化代谢需要心脏干细胞的分化 自然临床实践。心血管药物 2007年 4 增刊1 S60 S67 10.1038 / ncpcardio0766 2 - s2.0 - 33846501510 Kondoh H。 Lleonart m E。 中岛美嘉 Y。 Yokode M。 田中 M。 伯纳德 D。 吉尔 J。 海滩 D。 高糖酵解通量支持小鼠胚胎干细胞的增殖潜力 抗氧化剂和氧化还原信号 2007年 9 3 293年 299年 10.1089 / ars.2006.1467 2 - s2.0 - 33846420629 17184172 朗尼 T。 Bavister B。 布伦纳 C。 线粒体在干细胞 线粒体 2007年 7 5 289年 296年 10.1016 / j.mito.2007.05.002 2 - s2.0 - 34548124849 17588828 冈本 K。 肖 j . M。 线粒体形态和动力学在酵母和多细胞真核生物 年度回顾的遗传学 2005年 39 1 503年 536年 10.1146 / annurev.genet.38.072902.093019 2 - s2.0 - 27544466847 科· B。 线粒体融合与分裂细胞的生活和死亡 自然评论分子细胞生物学 2010年 11 12 872年 884年 10.1038 / nrm3013 2 - s2.0 - 78649413837 21102612 Santel 一个。 富勒 m . T。 人类mitofusin线粒体形态的控制 《细胞科学 2001年 114年 867年 874年 11181170 陈 H。 Detmer 美国一个。 埃瓦尔德 a·J。 格里芬 E·E。 弗雷泽 s E。 陈 d . C。 进行Mfn2 Mitofusins Mfn1和协调调节线粒体融合,对于胚胎发育至关重要 《细胞生物学》杂志上 2003年 160年 2 189年 200年 10.1083 / jcb.200211046 2 - s2.0 - 0037455575 12527753 Delettre C。 Lenaers G。 Griffoin j . M。 Gigarel N。 洛伦佐 C。 Belenguer P。 Pelloquin l Grosgeorge J。 Turc-Carel C。 Perret E。 Astarie-Dequeker C。 Lasquellec l Arnaud B。 Ducommun公司 B。 卡普兰 J。 哈默尔 c·P。 核基因_OPA1_编码线粒体dynamin-related蛋白质,是显性突变视神经萎缩 自然遗传学 2000年 26 2 207年 210年 10.1038/79936 2 - s2.0 - 20244381365 11017079 Meeusen 年代。 DeVay R。 块 J。 Cassidy-Stone 一个。 还有Wayson 年代。 McCaffery j . M。 Nunnari J。 线粒体等内膜融合和冠维护要求dynamin-related GTPase Mgm1 细胞 2006年 127年 2 383年 395年 10.1016 / j.cell.2006.09.021 2 - s2.0 - 33749991592 17055438 首歌 Z。 Ghochani M。 McCaffery j . M。 弗雷 t·G。 陈 d . C。 Mitofusins在线粒体膜融合和OPA1调解顺序步骤 细胞的分子生物学 2009年 20. 15 3525年 3532年 10.1091 / mbc.e09 - 03 - 0252 2 - s2.0 - 68149103297 石原 N。 藤田 Y。 奥卡河 T。 历经甲级 K。 通过蛋白水解的乳沟OPA1调节线粒体形态 在EMBO杂志 2006年 25 13 2966年 2977年 10.1038 / sj.emboj.7601184 2 - s2.0 - 33746299692 16778770 Shirihai o年代。 首歌 M。 多恩 g·W。 二世 线粒体活力协调mitophagy如何 循环研究 2015年 116年 11 1835年 1849年 10.1161 / CIRCRESAHA.116.306374 2 - s2.0 - 84938660246 25999423 张 Y。 陈 d . C。 线粒体的结构依据招聘裂变Fis1复合物 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2007年 104年 47 18526年 18530年 10.1073 / pnas.0706441104 2 - s2.0 - 36749075083 尹 Y。 克鲁格 e·W。 奥斯瓦尔德 b . J。 McNiven m·A。 线粒体蛋白hFis1调节线粒体分裂在哺乳动物细胞与dynamin-like蛋白DLP1的交互 分子和细胞生物学 2003年 23 15 5409年 5420年 10.1128 / mcb.23.15.5409 - 5420.2003 2 - s2.0 - 0043092647 12861026 詹姆斯 d . I。 Parone p。 Mattenberger Y。 Martinou j . C。 hFis1,小说组件的哺乳动物线粒体分裂机械 《生物化学》杂志上 2003年 278年 38 36373年 36379年 10.1074 / jbc.M303758200 2 - s2.0 - 0141592470 12783892 Smirnova E。 Shurland d . L。 Ryazantsev s . N。 van der Bliek a . M。 人类dynamin-related蛋白质控制线粒体的分布 《细胞生物学》杂志上 1998年 143年 2 351年 358年 10.1083 / jcb.143.2.351 2 - s2.0 - 0032547754 9786947 Otsuga D。 基冈 b R。 Brisch E。 撒切尔夫人 j·W。 赫尔曼 g . J。 Bleazard W。 肖 j . M。 dynamin-related GTPase Dnm1p,控制在酵母线粒体形态 《细胞生物学》杂志上 1998年 143年 2 333年 349年 10.1083 / jcb.143.2.333 2 - s2.0 - 0032547797 9786946 Legesse-Miller 一个。 Massol所说 r·H。 科切豪斯 T。 收缩和Dnm1p招聘在线粒体分裂不同的流程 细胞的分子生物学 2003年 14 5 1953年 1963年 10.1091 / mbc.e02 - 10 - 0657 2 - s2.0 - 0037910318 12802067 Cherepkova m . Y。 Sineva g S。 珀斯佩洛夫 诉。 白血病抑制因子(生活)撤军激活mTOR信号通路在小鼠胚胎干细胞通过MEK / ERK / TSC2通路 细胞死亡和疾病。 2016年 7 1 e2050 10.1038 / cddis.2015.387 2 - s2.0 - 84955137243 张 Z。 刘 l 吴 年代。 兴 D。 Drp1、Mff Fis1, MiD51协调在紫外线irradiation-induced凋亡调节线粒体分裂 美国实验生物学学会联合会杂志 2016年 30. 1 466年 476年 10.1096 / fj.15 - 274258 2 - s2.0 - 84973449037 26432782 Loson o . C。 首歌 Z。 陈 H。 陈 d . C。 Fis1、Mff MiD49, MiD51调解Drp1招聘在线粒体分裂 细胞的分子生物学 2013年 24 5 659年 667年 10.1091 / mbc.e12 - 10 - 0721 2 - s2.0 - 84874639591 23283981 Frezza C。 Cipolat 年代。 Scorrano l 测量线粒体形态变化及其影响线粒体在细胞凋亡参与 分子生物学方法 2007年 372年 胡玛纳出版社 405年 420年 10.1007 / 978 - 1 - 59745 - 365 - 3 - _29 Yamamori T。 艾克 年代。 薄 T。 Sasagawa T。 酒井法子 Y。 铃木 M。 山本 K。 Nagane M。 Yasui H。 Inanami O。 抑制线粒体的分裂蛋白dynamin-related蛋白1 (Drp1)损害线粒体分裂和细胞有丝分裂灾难x-irradiation之后 细胞的分子生物学 2015年 26 25 4607年 4617年 10.1091 / mbc.e15 - 03 - 0181 2 - s2.0 - 84951130958 26466676 Otera H。 王 C。 克莱兰德 M . M。 Setoguchi K。 横田 年代。 Youle r . J。 历经甲级 K。 Mff Drp1线粒体招聘是一个重要的因素在哺乳动物细胞中线粒体分裂 《细胞生物学》杂志上 2010年 191年 6 1141年 1158年 10.1083 / jcb.201007152 2 - s2.0 - 78650167618 21149567 ehs 年代。 Raschke 我。 曼库索 G。 Bernacchia 一个。 盖默 年代。 Tondera D。 Martinou j . C。 科· B。 Rugarli e . I。 兰格 T。 OPA1处理和调节线粒体融合m-AAA蛋白酶同功酶和OMA1 《细胞生物学》杂志上 2009年 187年 7 1023年 1036年 10.1083 / jcb.200906084 2 - s2.0 - 76149140917 20038678 伦纳德 答:P。 卡梅隆 r B。 实在 j·L。 狼 b . J。 彼得森 y K。 Schnellmann r·G。 Beeson C . C。 Rohrer B。 线粒体形态的定量分析使用高含量和膜电位在活细胞成像,机器学习,形态装箱 Biochimica et Biophysica学报(BBA)分子细胞的研究 2015年 1853年 2 348年 360年 10.1016 / j.bbamcr.2014.11.002 2 - s2.0 - 84913580346 25447550 刘 X。 张 Y。 倪 M。 曹 H。 签名者 r·a·J。 李 D。 李 M。 顾 Z。 胡 Z。 迪克森 k . E。 温伯格 s E。 昌德尔 n S。 DeBerardinis r . J。 周 F。 邵 Z。 徐 J。 调节红细胞生成的线粒体生物起源mTORC1-mediated蛋白质翻译 自然细胞生物学 2017年 19 6 626年 638年 10.1038 / ncb3527 2 - s2.0 - 85020272686 28504707 詹森 e . L。 Gonzalez-Ibanez a . M。 门多萨 P。 鲁伊斯 l . M。 里德尔 c。 西蒙 F。 Schuringa J·J。 Elorza 答:一个。 铜deficiency-induced贫血引起的线粒体代谢在红血球生成的细胞重新编程 Metallomics 2019年 11 2 282年 290年 10.1039 / c8mt00224j 2 - s2.0 - 85061873424 30358789 达斯 年代。 Hajnoczky N。 安东尼 a . N。 Csordas G。 廉价香烟 l D。 克莱门斯 d . L。 隐谷 j·B。 Hajnoczky G。 在肝细胞线粒体形态和动力学从正常和ethanol-fed老鼠 弗鲁格Archiv-European生理学杂志》上 2012年 464年 1 101年 109年 10.1007 / s00424 - 012 - 1100 - 4 2 - s2.0 - 84863528013 22526459 杜瓦 D。 莱因哈特 B。 保证了 C。 牛 H。 作用,抑制细胞因子信号(soc)的白血病抑制因子(生活)端依赖胚胎干细胞的生存 美国实验生物学学会联合会杂志 2000年 14 11 1577年 1584年 10.1096 / fj.14.11.1577 10928992