骨软骨损伤的组织是骨关节炎(OA)的主要原因之一,这是影响生活质量的~ 6120万人仅在中国( 1]。修复和重建骨软骨病变预防OA进展,复制的先天生理结构,功能,和生活环境的软骨和软骨下骨具有十分重要的意义。目前,临床骨软骨组织的再生策略如磨损关节成形术、微裂缝,关节软骨细胞移植在中期随访时期得到了积极的结果。然而,这些方法的长期疗效仍不满意,由于一代的纤维软骨移植和贫穷之间的集成和居民组织( 2]。此外,成人细胞疗法,如自体软骨细胞移植(ACI),限制了细胞的可用性和扩张能力。胚胎干细胞,最常见的发现,骨髓,脂肪组织,和滑膜,有分化能力向软骨细胞和成骨细胞在特定的生化和生物力学刺激下,为骨软骨再生提供了新的平台和OA治疗在临床前和临床情况。地方行政的msc、提供一个直接路径到目标站点,通常利用在OA临床适应症。例如,梅奥诊所使用culture-expanded的单个和多个注射自体脂肪间充质基质细胞(超导公司)为研究的安全性和可行性治疗轻微到严重膝OA,目前第一阶段的介入的临床试验。研究人员任冀医院和合作单位建立了临床前研究探索人类超导公司注入的疗效和安全性在关节内软骨缓解OA症状( 5 ∗ 10 7 msc)[显示最好的改善 3]。然而,治疗效果仍然阻碍;主要障碍是(1)需要大剂量的细胞(正常剂量范围从10⁶到10⁹细胞/注射),部分原因是短停留时间沉淀后组织网站( 4, 5),(2)低细胞存活率multireasons造成的,包括严重的剪切应力形成的过程中粘滞水凝胶前体注入( 6, 7),敌意和疾病免疫微环境的网站,和营养和氧气供应不足,综述了在其他地方( 8]。在本节中,我们将首先讨论不同的生物工程策略用于提高干细胞的存活率和保留骨软骨损伤和进一步讨论采用各种biomanufacture系统的潜力,如3 d生物打印,准确地存款干细胞和梯度复杂的组织形式。

msc的地方政府是支持交付方法相比,系统交付的疾病站点更容易访问和更好的治疗结果。然而,保留和生存不足移植msc的地点阻碍它的治疗效果。使用生物材料封装msc是一种很有前途的方法来增加保留和可行性梗塞部位( 9]。

电池封装在微凝胶(~ 1 - 1000 μ米)提供了许多优点相比封装散装水凝胶( 10),因为它可以提供一个ECM-like 3 d环境对细胞培养和扩张 11];之间的间隙空间微米大小的口袋微凝胶可以提供良好的营养和氧气扩散( 12];最重要的是,它可以身体保护封装细胞注射期间剪切应力。例如,在同样的注射速率(15毫升/小时),细胞的可行性bmsc封装在明胶/透明质酸混合微凝胶(67.5%)高于中暂停一个(15%),与此同时维持正常的细胞功能,如细胞增殖和chondrogenic能力(数据 1(一)和 1 (b))[ 13]。类似的现象也观察到在骨再生的研究。侯和同事的工作,聚(乙烯醇)的微凝胶为封装msc及开发BMP-2生长因子(GF)诱导成骨分化;细胞生物活性高、持续释放的女朋友是通过优化微凝胶的交联条件,保证一个特定的和调节成骨分化,从而更有效的骨再生( 14]。的免疫反应,一个有趣的研究发现,几何的植入微凝胶可能会影响外国身体免疫反应和纤维化在啮齿动物和非人灵长类动物模型( 15]。

虽然微凝胶可以提高干细胞生存能力,提高再生功效的软骨和骨骼通过实物保护和增加营养扩散,组装微凝胶的机械性能通常是弱不能承受生理机械载荷在骨软骨接口。研究人员最近公布了名为引发micropore-forming生物打印(图的新策略 1 (c)),提高细胞生存能力通过散装微观孔隙形成水凝胶,同时保留优越机械鲁棒性(图 1 (d))[ 16]。形成的微孔隙是temperature-triggered microphase分离和稳定的氢键壳聚糖。不牺牲机械鲁棒性、连通孔隙的打印的脚手架(~ 17.8 μ米)支持细胞扩散、迁移和增殖。令人印象深刻的是,支架的刚度和粘弹性可以通过一个垂直的控制pH值的微小变化和bioink挂钩。虽然这个系统尚未应用于软骨或骨软骨再生,它展示了潜在的改善干细胞生存能力和维护机械鲁棒性的同时多孔水凝胶。

总的来说,微型胶囊的方法和micropore-forming生物打印可以促进干细胞疗法的疗效通过增加存活率,减少所需剂量的干细胞。

软骨周围是滑液和作为承载缓冲保护骨骼和分散冲击和压力。实现干细胞的再生性能,保持动态的注入干细胞缺陷网站成功的组织再生是至关重要的。策略也已经被开发出来,以提高干细胞原位保留通过不同形式和类型的生物材料( 17]。

一个策略是将mussel-inspired粘合剂干细胞移植。例如,韩寒等人开发了一个polydopamine (PDA)修改后的硫酸软骨素- (CS)聚丙烯酰胺(PAM)水凝胶与组织粘性软骨再生(见图 2(一个)和 2 (b))。复合水凝胶表现出良好的弹性和韧性,因为非共价相互作用PDA和CS和PAM共价交联网络 18]。

类似于mussel-inspired儿茶酚化学、gallol半个具有芳香环有三个羟基最近被纳入cell-carrying水凝胶来实现粘结力。Shin et al。 19]发达gallol-modified ECM凝胶油墨表现出快速的共价交联并组织粘连。制造bioink维护~ 95%的细胞生存能力可以印刷在印刷和后组织基质由于gallol团体ECM的附着力。然而,gallol修改ECM凝胶的机械性能远低于本地软骨。此外,高剂量gallol集团的细胞毒性细胞,已在同一研究小组先前的研究的报道 20.]。因此,使用gallol合成胶粘剂cell-loading油墨应该进一步仔细评估在临床前研究。

另一种机制用来延长停留时间的干细胞是开发一个细胞载体与特定的官能团(如醛)这可能与氨基反应组织表面的软骨组织。周等人研究了一个基于氧化葡聚糖- (ODex)构建软骨缺损修复( 21]。在这项研究中,ODex不仅构成了脚手架网络通过反应与明胶优越的机械性能,但也形成了良好的组织粘附与氨基反应组织现有的软骨,这进一步促进了集成的移植和宿主骨软骨病变。然而,高度的醛替代右旋糖酐骨干是有害的细胞;因此,有必要缩短持续时间的干细胞醛环境。杨等人和他的同事们准备了一个小说phototriggered亚胺反应来解决上述的局限性(见图 2 (c))。在此系统中,o-nitrosobenzene (NB)可以被转移到NB-aldehyde 365海里的照射下光与nh立即交联₂在聚合物表面或周围组织( 22]。这种phototriggered胶机制提供了一个良好的时空控制细胞生存能力,组织粘连,和组织集成,提供一个新的策略来延长保留时间的干细胞在宿主组织和骨软骨再生组织促进无缝集成。

将来,有机会赋予胶特性的微凝胶体系。这将是有趣的和有意义的内源性修复胶粘剂微凝胶可以坚持目标组织,同时促进内源性细胞渗透微凝胶支架。

骨软骨组织展览空间梯度从阐明表面底层骨,软骨细胞的密度分级,肥厚性软骨细胞和成骨细胞。这些分级细胞群在骨软骨组织分泌不同的ECM组件为组织提供空间梯度机械性能承受动态承载环境。因此,制造生物材料与细胞渐变复制本机梯度结构的骨软骨组织是至关重要的功能性骨软骨组织工程( 5]。

3 d生物打印(3)类似,可以印刷在生物材料或细胞biomaterial-free bioink,已经在制造业广泛调查所需的地形的骨软骨组织( 23, 24]。3使用多线程来精确地存款multibioinks类似;因此,不同的生长因子和细胞类型可以印刷缺陷网站根据定义的模式和层。例如,一个特定数量的msc和软骨细胞精确地沉积在精心设计和印刷microchambers形成软骨,拥有类似的结构、组成、和生物力学性能本机软骨组织根据组织学,免疫组织化学和力学分析。此外,该系统也适用于整个人工骨软骨组织的构建基于软骨内骨的构造,显示分层区域软骨和骨骼的插科打诨和钙沉积的重要不同的内容( 25]。

包含bioink内的细胞可以直接制作细胞渐变定义,尽管时空控制的细胞向软骨细胞和成骨细胞分化bioink仍然是一个巨大的挑战。作为一种替代方法,首先msc可以分化成chondrogenic和成骨的球状体,分别,然后准确地定位模拟骨软骨结构。东印度缎木和同事最近开发出一种scaffold-free生物打印的方法来制造一个双层融合骨软骨界面通过自制aspiration-assisted生物打印(艺术展)设备(图 3(一个))[ 26]。重建骨软骨组织,成骨的球状体和chondrogenic首次单独生成的球状体人类脂肪干细胞的分化(ADSCs) 3 d文化。OC接口是由第一沉积一层然后打印的成骨的球状体上牺牲支持材料(由CaCl海藻酸交联₂蒸汽)。随后,另一层chondrogenic被放置在前一个球状体成骨的层。值得注意的是,在个别层球状体可以融合到一起,表型在这两个区域可以通过研究(图维护 3 (b))[ 27]。类似于细胞球状体,不同的微凝胶封装可以利用干细胞作为构建块,形成一个预定义的组织与空间控制的细胞类型和梯度结构( 12, 28, 29日]。

简而言之,生物材料或biomaterial-free 3 d生物打印承诺重建梯度生物化学或生物力学结构的骨软骨组织。然而,一些应用程序的挑战仍然存在这些人工骨软骨结构在诊所。例如,杨氏模量( 13大多数生物材料的干细胞移植是明显低于天然关节软骨(0.5 - -1.5 MPa)和骨组织(15 - 20 MPa) [ 30., 31日]。集成工程软骨和软骨下骨之间以及与潜在的本地组织工程骨软骨组织是不够的。此外,肤浅和大规模干细胞组装技术需要开发创建个性化的构造在诊所。然而,干细胞的精确装配有或没有的生物材料提供了一个有前途的方法来模拟的空间复杂性骨软骨组织,不仅可以利用组织工程还在药物检测和疾病建模。

多向分化潜能使得msc成为一个足够的骨软骨组织工程的种子细胞来源和其他疾病的治疗,但细胞分化的精确控制体外和体内被一个巨大的挑战 32, 33]。的成功分化干细胞包括许多方面,如骨髓间充质生物材料支架的相互作用,我们讨论的部分 2生物分子线索(生长因子、细胞因子、营养因素,等等),和应用文化系统( 34, 35]。在开发一个集成的多相组织,相声不同阶段之间的信号或潜在的干扰有显著影响工程质量的组织。例如,codelivery BMP-2基因和TGF - β3和建立一个骨软骨构建可获得软骨形成不足或钙沉积相比,个人交付,因为chondrogenic之间可以有拮抗作用,成骨生长因子( 36]。在这方面,细胞工程方法包括时空控制转基因超表达扮演增加角色控制细胞生长和分化,我们会检查下面几个例子解决这些重要问题。

骨软骨缺损的修复包括同时骨骼和软骨的再生。相应地,msc需要分化成软骨细胞和骨细胞。传统上,msc,分别predifferentiated包含特定生长因子的培养基。最近,这些生物活性蛋白质,驱动msc向特定的细胞类型直接嵌入到生物材料支架。然而,很难控制剂量和生长因子的空间分布在支架装置,和蛋白质在体内半衰期相对较短( 37, 38]。因此,通过病毒或病毒基因传递方法吸引了越来越多的关注。这种转基因有潜力产生高水平的长期增长和转录因子的表达( 39]。仍然很难分别对特定血统(即直接细胞命运。,cartilage and bone) using only one biomaterial scaffold from the same cell source, in a single culture system. To address this challenge, Huynh et al. [ 40)开发了一种方法来诱导成骨的和msc chondrogenic分化两个独立的三维编织PCL支架在一个单一的文化系统。一般来说,TGF - β3和BMP-2用于诱导MSC软骨形成和骨生成,分别为( 41, 42]。然而,母亲反对民进党同族体3 (SMAD3)下游的TGF - β3信号通路可以抑制Runt-related转录因子(Runx2),拥有伟大的成骨的能力( 43, 44]。因此,在这项研究中,TGF - β3在一个特定的补充chondrogenic环境促进生产呕吐和坳二世在一个支架。脚手架,抑制的影响chondrogenic-inducing TGF - β3信号,设计msc overexpressing RUNX2的击倒SMAD3基因准备生成一个矿化矩阵相同的文化条件。这种方法可以开发一个双层支架带有软骨层的上面一层下面的骨头。理论上,DNA质粒编码的交付组织诱导因素从多相支架空间可以促进细胞分化的再生过程,进一步复杂的组织结构( 45]。另一个研究表明,在不同层也可以诱导msc分化成软骨细胞和成骨细胞形成一个双层体外骨软骨结构。这个脚手架由一个chitosan-gelatin支架层激活质粒TGF - β1 chondrogenic和其他羟磷灰石/ chitosan-gelatin支架层激活成骨的质粒BMP-2,分别。它能够促进关节软骨和软骨下骨的再生体内同时[ 46]。

时空上的又一次努力控制干细胞治疗基因的表达,Gonzalez-Fernandez和他的同事们( 47)开发出一种新造孔bioink结合DNA质粒编码chondrogenic或成骨的基因。通过混合快速和缓慢降解水凝胶,bioinks与孔隙度随着时间的增加。研究人员发现,封装pDNA的释放率成孔bioink高于固体墨;因此,它是可能实现的转染或宿主细胞转染快速瞬态方式或慢和更可持续的方式调制这些bioinks的孔隙度。此外,这些3 d打印的组织可以形成血管,双层,稳定的骨软骨植入体内。

另一个重大的挑战在发展中骨软骨缺损修复成功的构造是neotissue形成的支架降解速率相匹配。朝着这个目标,罗兰和他的同事们( 48)最近开发结构抑制异常炎症反应细胞因子诱导的interleukin-1 (il - 1)。他们开发了融合同心cartilage-derived矩阵(CDM)半球播种与msc、分别overexpressing BMP-2和TGF - β3除了与doxycycline-inducible il - 1受体拮抗剂(IL-1Ra)转基因通过慢病毒颗粒的交付。他们的研究结果表明,基因传递和释放IL-1Ra有效地促进了骨软骨组织的形成和保护结构免受退化引起的异常炎症(图 4)。

总之,时空的治疗基因在本地控制干细胞的分化体内骨软骨组织的再生是一个有前途的方法。然而,需要进一步的努力集中在提高转染细胞的转染效率和固定的行动。此外,转基因组合和控制基因传递需要优化来获得更好的结果在组织再生过程中( 49, 50]。

尽管干细胞的管理和工程本身是重要的细胞疗法,宿主因素(本地或系统的细胞毒性反应,炎症条件下,微环境,等等)也被证明有相当影响生物的命运和功效的干细胞临床试验( 51]。例如,受体细胞毒性响应对注入msc在介导细胞治疗中起着重要的作用。一项研究表明,hMSCs被单核细胞吞噬后注入小鼠模型后24 h,这进一步促进了免疫耐受系统性免疫调节表型在主机 52]。疾病进展的不同阶段和微环境也会导致不同的MSC治疗的影响。在疾病的发展过程中,内部微环境的炎症、缺氧,和许多其他病理因素是动态的,很难把样品经常从严重的病人( 53]。因此,必须充分考虑主机动态微环境的影响在msc在治疗应用它们。

许多研究表明,为了提高体内免疫调节功能和临床效果,MSC可以影射与促炎细胞因子或生长因子( 54, 55]。例如,可溶性促炎细胞因子干扰素- γ可能会影响脂肪形成和骨生成的msc ( 56]。几个干扰素- γ诱导基因如Runx2被发现在早期成骨分化的bmsc移植( 57]。此外,干扰素, γ扮演着一个重要的角色在促进msc的抗炎活性。报道,启动与干扰素 γ、鼠标msc (mMSCs)调节酶的表达indolamine 2, 3-dioxygenase (IDO),已被证明能够抑制t细胞在早期阶段的活动。和一些重要的免疫调节分子,包括CCL2 PGE2、TGF - β分泌和HGF影射mMSCs [ 58]。另一个研究表明STAT1 / STAT3信号通路的激活和抑制mTOR的信号通路促进mMSC影射与干扰素的免疫抑制特性 γ。此外,免疫调节能力增强了镇压hMSCs (mTOR通路的 59]。至于其他细胞因子,msc的碱性磷酸活动和骨矿化是提升与有限合伙人/ TNF -启动时 α( 60, 61年]。Redondo-Castro等人发现,当条件对待媒体的il - 1影射MSC,小鼠BV2细胞分泌更多的营养因素,如g - csf和il - 10等抗炎介质,但不促炎细胞因子il - 6和TNF - α( 62年]。此外,msc源自、BM或包皮表现出不同的免疫调节基因表达水平(IDO1、SEMA4D FGL2, SEMA7A,和加)启动时促炎细胞因子(IFN -混合物 γ,il - 1 β干扰素- α和肿瘤坏死因子- α)[ 63年, 64年]。

由于msc是高度敏感的严酷的环境和低温贮藏后会损失函数在临床前或临床试验,启动可能有助于改善骨髓间充质目标的治疗潜力的生物属性msc。在临床翻译,MSC启动仍有很多局限性,如成本高、免疫原性的伤害,不稳定的影响取决于MSC的来源和捐助,和致瘤的潜在影响的MSC治疗启动方法在长期试验。

除了骨软骨缺损,全身和局部炎症也可能对OA的发病机制有一个深远的影响和其他疾病。虽然适当的预处理与细胞因子有利于msc的免疫调节作用,异常,不断提高水平的促炎细胞因子如interleukin-1 (il - 1)、il - 6, IL-17,和肿瘤坏死因子(TNF)可以导致cartilage-specific基因和蛋白多糖形成的抑制,除了细胞外基质(ECM)的退化。此外,IL-1-mediated炎性环境抑制chondrogenic干细胞的分化,导致快速退化软骨来源于干细胞( 65年, 66年]。因此,增加调查治疗炎症环境中可能是有益的。鉴于各种蛋白质疗法的成功的框架,开发和应用于类风湿性关节炎(RA)、新方法,编辑的关键转录anticytokine分子在内源性启动子序列已被应用于控制细胞炎症信号周围微环境的动态响应。Pferdehirt et al。 67年)开发了一个综合系统设计使用一个启动子与几个识别元素的核转录因子kappa-light-chain-enhancer激活B细胞(NF - κB)放大和诱导表达和释放IL-1Ra anticytokine蛋白质。使转染基因电路在诱导多能干细胞(万能)通过慢病毒交付、工程细胞能够分化成工程软骨病变组织的再生和减轻炎症反应中il - 1(图自动调整的方式 5(一个))。在最近的研究中,由于具有高度针对性的性格和致瘤性的低风险,CRISPR-Cas9系统彻底改变了适用于哺乳动物细胞( 68年]。研究表明,小鼠诱导多能干细胞(万能)工程功能删除il - 1受体I ( Il1r1)使用CRISPR-Cas9系统。这些修改细胞产生更多的蛋白多糖矩阵和保护inflammation-induced组织方面表现出显著的退化比野生型细胞( 69年]。另一个类似的设计则包含回馈控制基因电路可以被诱导产生生物活性药物。同样,基本序列表达IL-1Ra或可溶性TNFR1 (sTNFR1)插入启动子的下游基因CCL2构造一个动态负反馈电路激活使用CRISPR il - 1、TNF基因编辑(图 5 (b))[ 70年]。在后者的研究过程中,结合3 d PCL编织支架的细胞则被改造,形成一个稳定的软骨移植减轻风湿性关节炎的炎症模型( 71年]。工会组织工程和合成生物学承诺的范围广泛的潜在的治疗应用治疗慢性疾病,如OA和RA通过生产特别设计的干细胞不仅可以分化成特定组织的细胞,还可以调节转基因的表达分子直接反应体内动态病理变化信号。在未来,这种高度响应和自动调整的治疗策略使用设计师干细胞治疗OA可能克服传统生物anticytokine药物或疗法的局限性,最终减少患者不良事件的风险。