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SCI据/journal-id>

干细胞国际据/journal-title>

1687 - 9678据/issn> 1687 - 966 x据/issn>

Hindawi据/publisher-name>

10.1155 / 2020/8810476据/article-id> 8810476.据/article-id>

研究文章据/subject>

CD133抗原作为黑色素瘤干细胞的潜在标记物:据italic> 体外据/italic>和据italic> 在活的有机体内据/italic>学习据/article-title>

https://orcid.org/0000-0001-5599-9315据/contrib-id> Kloskowski据/surname> 托马斯据/given-names> ^1据/sup>

Jarząbkowska据/surname> 乔安娜据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-7743-8540据/contrib-id> Jundziłł据/surname> Arkadiusz据/given-names> ^1据/sup> ^2据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-9620-0773.据/contrib-id> Balcerczyk据/surname> Daria据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0003-3010-2561据/contrib-id> 镶嵌细工据/surname> 蒙大利亚据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0003-2945-8771.据/contrib-id> Szeliski据/surname> 卡米尔据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0003-3748-1058据/contrib-id> ·博德纳尔据/surname> 马格达莱纳据/given-names> ^3.据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-6055-9151.据/contrib-id> Marszał埃克据/surname> andrzej.据/given-names> ^4.据/sup>

Drewa据/surname> 格拉德据/given-names> ^5.据/sup>

https://orcid.org/0000-0002-5529-4320据/contrib-id> Drewa据/surname> 托马斯据/given-names> ^1据/sup>

https://orcid.org/0000-0003-3259-087X据/contrib-id> pokrywczyńska.据/surname> 玛塔据/given-names> ^1据/sup>

Najimi据/surname> 幕斯塔法据/given-names>

^{1据/sup>

泌尿科和男科主任据/addr-line>

再生医学系据/addr-line>

细胞和组织银行据/addr-line>

执行管理委员会Medicum据/addr-line>

Nicolaus Copernicus大学据/addr-line>

Sklodowskiej-Curie 9据/addr-line>

85 - 094年彼得哥什据/addr-line>

波兰据/country>

umk.pl据/ext-link>} ^{2据/sup>

部门的塑料据/addr-line>

重建和美容外科据/addr-line>

执行管理委员会Medicum据/addr-line>

Nicolaus Copernicus大学据/addr-line>

台灯的据/addr-line>

波兰据/country>

umk.pl据/ext-link>} ^{3.据/sup>

临床病理形态学据/addr-line>

执行管理委员会Medicum据/addr-line>

Nicolaus Copernicus大学据/addr-line>

台灯的据/addr-line>

波兰据/country>

umk.pl据/ext-link>} ^{4.据/sup>

临床病理科据/addr-line>

波兹南医科大学和大波兰癌症中心据/addr-line>

波兹南据/addr-line>

波兰据/country>

ump.edu.pl据/ext-link>} ^{5.据/sup>

大学拜托斯扎据/addr-line>

台灯的据/addr-line>

波兰据/country>}

2020据/year>

23据/day> 12据/month> 2020据/year>

2020据/volume> 25据/day> 6.据/month> 2020据/year> 23据/day> 9.据/month> 2020据/year> 3.据/day> 12据/month> 2020据/year> 23据/day> 12据/month> 2020据/year>

这是在Creative Commons归因许可下分发的开放式访问文章，其允许在任何介质中不受限制地使用，分发和再现，只要正确引用了原始工作。据/license-p>

黑素瘤是最危险的皮肤癌类型。癌症干细胞(CSCs)被怀疑是癌症复发和癌症治疗失败的原因。CD133是一种检测黑色素瘤CSCs的潜在标志物。在小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10上进行实验。采用免疫磁细胞分选技术分离CD133+细胞。分离后评价CD133+、CD133-和CD133+/-的增殖和克隆潜能。在C57BL/6J小鼠模型上观察CD133+和CD133-细胞诱导肿瘤的潜能。测试了三种不同的细胞数量(100、1000、10000)。分析肿瘤形态、有丝分裂数和肿瘤坏死面积。平均分离到0.12%的CD133+细胞。 Compared to CD133- and unsorted CD133+/- cells, CD133+ cells were characterized by the higher proliferative and clonogenic potential. These properties were not confirmed据italic> 在活的有机体内据/italic>，作为CD133 +和CD133-细胞诱导小鼠模型中的肿瘤生长。观察到有丝分裂数和肿瘤坏死区域的统计学差异。同时检测与其他标记的CD133抗原是准确鉴定这些黑素瘤癌症干细胞所必需的。据/p> 1.介绍据/title> <p>黑素瘤是最危险的皮肤癌类型。全球每年约有132000例黑色素瘤新病例被诊断[据xref ref-type="bibr" rid="B1"> 1据/xref>］.澳大利亚的发病率最高;在欧洲，瑞士和斯堪的纳维亚国家的发病率最高，希腊和罗马尼亚的发病率最低[据xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>］.黑素瘤只占皮肤恶性肿瘤的4%，但在这些癌症类型造成的死亡中，黑素瘤是79%的原因[据xref ref-type="bibr" rid="B4"> 4.据/xref>］.据/p> <p>在文献中，我们可以找到不同的癌症发展理论;其中之一包括癌症干细胞的贡献。包括CSCs在内的假说认为肿瘤肿块是高度异质性的，由许多分化水平不同的细胞组成[据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>］.CSCs可导致许多不同癌症的发展、进展和无效治疗。直接针对这种细胞类型的治疗可以导致完全切除肿瘤。与其他形成肿瘤团块的细胞相比，CSCs对化疗更有抵抗力，这就是为什么它们可能导致癌症复发[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>］.的CSC可以通过特征性标志物被识别;它们中的一个是CD133（prominin1，AC133），本许多正常祖细胞和癌细胞的表面上的细胞的膜糖蛋白，包括黑色素瘤[据xref ref-type="bibr" rid="B8"> 8.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10据/xref>］.CSCs也被称为致癌细胞，这意味着这些细胞的植入可以导致肿瘤的发展，而不是注射。CSCs需要适当的环境和干细胞生态位来控制其功能，这就是为什么CSCs在注射后产生肿瘤的效率不同，取决于选择的植入位置[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12据/xref>］.据/p> <p>该研究的目的是将CD133阳性细胞（CD1333 +）分离小鼠黑素瘤细胞系（B16-F10），并将它们的形态和生长特征与阴性（CD133-）和异源（CD133 +/-）细胞系进行比较。此外，据italic> 在活的有机体内据/italic>在小鼠模型上进行了一项实验，以检查表达CD133标记物(CD133-)的黑色素瘤细胞与不表达该标记物(CD133-)的人群相比，是否具有不同的肿瘤诱导特性。据/p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2.材料和方法据/title> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。B16-F10细胞培养据/title> <p>B16-F10小鼠黑色素瘤细胞系购自美国型培养库(ATCC, Mannassas, VA, USA)。细胞在DMEM/Ham’s F12培养基中培养(Dulbecco’s Modified Eagle培养基，HyClone, Chicago, IL, USA)，该培养基中添加10%胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)和抗生素(青霉素100 U/ml，链霉素100据italic> μ.据/italic>g/ml，两性霉素b5据italic> μ.据/italic>g/ml, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)，在标准条件下37°C, 5% CO据sub>2据/sub>和98%的湿度。每2-3天更换一次培养基。使用标准的0.05%胰蛋白酶溶液(Biomed, Lublin，波兰)和0.5 mM的EDTA (POCH, Gliwice，波兰)，当细胞达到70-80%的融合时传代。台盼蓝染色计算细胞数。据/p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>２.２.CD133+黑色素瘤细胞的分离据/title> <p>使用CD133 MicroBeads Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)分离出具有潜在CSC表型的细胞。按方案经胰蛋白酶分解、离心，并计算细胞数，300据italic> μ.据/italic>l缓冲液(含PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)， 100据italic> μ.据/italic>FcR阻断试剂100据italic> μ.据/italic>分别加入l的CD133 MicroBeads到最终体积500据italic> μ.据/italic>l(值据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞）。在每步后，混合细胞悬浮液。在4℃温育30分钟后，向制备的混合物中加入4.5ml缓冲液后。将混合物离心（10分钟，700×G，4℃），并将得到的细胞沉淀重悬于500 据italic> μ.据/italic>l缓冲液(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)。CD133居群分离自平均水平据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mn> 25据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 7.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>B16-F10细胞。据/p> <p>采用免疫磁分选技术分离CD133+细胞。细胞被应用于放置在磁场中的分离柱上。与珠链连接的阳性细胞保留在柱中，而CD133细胞通过。最后，将色谱柱从磁场中去除，用适量的缓冲液冲洗CD133+种群。为了进一步的实验，我们分别检测了三个群体(CD133+、CD133-和CD133+/-异质性群体)。据/p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。流式细胞仪据/title> <p>为证实CD133+细胞分离成功，采用流式细胞术检测其表型。所有三个群体均用CD133-PE抗体(克隆AC141;Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach，德国)。染色细胞立即用BD FACSCanto II (BD Biosciences, USA)进行分析。至少收集了50000个事件，除了分离的CD133+细胞，由于细胞数量少，收集了20000个事件。使用FlowJo v10 (Becton, Dickinson and Company, USA)对获得的数据进行分析。据/p> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>2.4。实时细胞生长分析据/title> <p>使用X-Celligence系统（Accela，Prague，Czech）进行实时细胞生长分析。在两种不同的密度下将细胞接种在E-Plates 16（Accela，Prague，捷克共和国）（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/ cm.据sup>2据/sup>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 4.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/ cm.据sup>2据/sup>)，每种密度分别印在单独的印版上。CD133+和CD133-分别培养5个重复，未分类细胞4个重复;每个盘子上的两个孔只填满作为背景的培养基。细胞在培养箱的标准条件下培养。以细胞增殖为指标。电池指数是由置于e板底部的电极测量的无单位参数。电极测量粘附细胞引起的电子流的阻抗。阻抗会受到细胞数量、大小和形态等参数的影响。每30分钟测量一次。为10天。 Cell growth curves were plotted as a dependence of cell index from the time of culture.据/p> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。克隆源性测定据/title> <p>分别分析CD133+、CD133-和未分选细胞(CD133+/-)。每个细胞片段接种在6孔培养板上，每孔含有10、100或1000个细胞。每个实验共6个重复。培养皿在标准条件下孵育6天。培养基换了两次。实验结束后，去除培养基，在每孔中加入0.5%中性红(Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)进行菌落可视化。细胞与染料在37°C孵育10分钟。然后，去除中性红，用PBS冲洗孔。倒置光镜下观察和计算细胞菌落。结果显示为克隆生成指数，该指数由菌落数除以初始种子细胞数得到。 Three colony types were analyzed. Cells can grow in the compact and round colonies (holoclones), loose irregular colonies (paraclones), or can have intermediate features (meroclones) [据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13据/xref>］.据/p> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。CD133+细胞启动肿瘤能力的体内评价据/title> <p>的目的是据italic> 在活的有机体内据/italic>实验是根据CD133表面标记物的表达来确定潜在CSCs的肿瘤启动能力。将细胞移植到C57BL/6J小鼠体内，该小鼠是推荐的B16-F10细胞受体。这项研究是在78只平均体重20克、6-8周的雄性小鼠身上进行的。所有实验都得到了波兰地方伦理委员会的批准，许可号为29/2009。据/p> <p>动物被分为6个相等的组(每组13只)。CD133+或CD133- 3种不同数量的细胞(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>那据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>,据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mn> 10据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>)悬浮在0.5 ml PBS中，在小切口手术过程中植入腹腔。随访6周;之后，采用腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg安乐死。腹层沿中线切开。癌症肿瘤被分离，称重(所有从一个病灶分离的肿瘤和一只动物一起称重)，并放入4%磷酸缓冲福尔马林进行进一步的组织病理学分析。材料包埋在石蜡中，切开，并用苏木精和伊红染色。据/p> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。有丝分裂数据/title> <p>有丝分裂指数由两个独立的调查人员评估。使用40x放大倍率的三个视野中的光学显微镜在光学显微镜下计算有丝分子分数。对样品蒙蔽了用于分析的研究人员。结果作为平均值呈现为至少11个独立的测量，这取决于B16-F10 CD133 +或CD133-细胞植入后形成的肿瘤的数量。分析所有肿瘤以进行有丝分子指数检查。据/p> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。肿瘤坏死的面积据/title> <p>肿瘤坏死区域由两个独立的研究人员评估。使用100倍放大率在光学显微镜下进行分析。对样品蒙蔽了用于分析的研究人员。结果呈递至少11个独立的测量（百分比），这取决于B16-F10 CD133 +或CD133-细胞植入后形成的肿瘤的数量。分析所有肿瘤的坏死区域检查。据/p> </sec> <sec id="sec2.9"> <title>2.9。统计分析据/title> <p>两组比较采用Kołmogorow-Smirnow检验(Mann-Whitney检验)，>2组比较采用Kruskal-Wallis检验)。数据使用IBM SPSS 23.0 (SPSS，波兰克拉科夫)进行分析。的显著性水平据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>作为有意义的。据/p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3.结果据/title> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。CD133 + B16-F10细胞的成功分离据/title> <p>磁激活细胞分选(MACS)获得据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mn> 0．12据/mml:mn> <mml:mi> ％据/mml:mi> <mml:mo> ±据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> <mml:mi> ％据/mml:mi> </mml:math> </inline-formula>CD133+表型的细胞。这些结果以8种不同分离物的平均值表示。流式细胞术分析证实CD133+细胞分离成功(图据xref ref-type="fig" rid="fig1"> 1据/xref>)．据/p> <fig id="fig1"> <label>图1据/label> <p>确认适当的磁性分离。用抗CD133-PE抗体染色的未分离和分离细胞的流式细胞术分析结果。据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.001"></graphic> </fig> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。测试细胞群体之间缺乏细胞形态的差异据/title> <p>显微镜观察显示在B16-F10细胞的形态没有差异24之后，48，72，以及分析人群（CD133 +，CD133-和CD133 +/-）之间96小时。48小时后，细胞生长在所有分析组是相同的。四天之内，所有的文化达到100％汇合（图据xref rid="fig2c" ref-type="fig"> 2 (c)据/xref>)．据/p> <fig-group id="fig2"> <label>图2.据/label> <p>后免疫细胞分选黑素瘤细胞特征：使用具有不同的细胞密度接种实时细胞分析三种细胞种群（A，B）的生长的比较：据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/ cm.据sup>2据/sup>(一)和据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:mn> 4.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/ cm.据sup>2据/sup>（b）;（c）48小时和96小时后CD133阳性（CD133 +），阴性（CD133-）和未蚀刻（CD133 +/-）B16-F10细胞的细胞形态。据/p> <fig id="fig2a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.002b"></graphic> </fig> <fig id="fig2c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.002c"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。与CD133和未侵蚀B16-F10细胞相比，CD133 +的不同增长模式据/title> <p>B16-F10 CD133 +，CD133和CD133 +/-细胞以密度接种据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/厘米据sup>2据/sup>最初显示出均匀的对数增长(图据xref rid="fig2a" ref-type="fig"> 2(一个)据/xref>)．但从第2天开始，CD133-和未分选细胞(CD133+/-)的生长速度略快于CD133+细胞。在试验的第3和第4天，各群体间的细胞生长只有很小的差异。细胞同时达到最大的生长高峰，大约在观察的第6天。密度下的细胞对数生长期差异有统计学意义据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/厘米据sup>2据/sup>在CD133 +细胞和CD133和异质CD133 +/-细胞群之间显示（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．据/p> <p>细胞生长的实时分析，在播种密度据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:mn> 4.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/厘米据sup>2据/sup>表明所有测试的群体最初在同一水平上增殖（图据xref rid="fig2b" ref-type="fig"> 2 (b)据/xref>)．第2天，CD133+细胞开始快速增殖，第3天达到稳定期(平台期)，而CD133-和未分类的CD133+/-细胞继续呈现对数增长，第5天达到稳定期。CD133+细胞生长速度越快，进入静止期越早，可能由于细胞脱离导致增殖减少。CD133-和未分类的CD133+/-细胞之间的细胞生长没有差异。在对数生长期，以据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:mn> 4.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>/厘米据sup>2据/sup>， CD133+细胞与其他测试群体之间的差异有统计学意义(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．据/p> </sec> <sec id="sec3.4"> <title>3．4．B16-F10 CD133+群体的菌落数量最多，全克隆菌落形成率最高据/title> <p>根据细胞的表型及其播种密度的克隆潜力如图所示据xref rid="fig3" ref-type="fig"> 3.据/xref>．在表达CD133标记的细胞群中观察到最多的菌落。CD133+群体的单细胞集落形成率最高(88.3%)。CD133+细胞与CD133-细胞间差异有统计学意义(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．为种子组据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>在细胞中，显示CD133抗原存在的细胞和其他群体之间产生的菌落数量有统计学意义的差异。克隆原性潜力最低的组为据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞的种子。然而，不同菌落数量的差异没有统计学意义(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.566据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．据/p> <fig-group id="fig3"> <label>图3.据/label> <p>克隆原性检测:(a)根据B16-F10细胞群(CD133+、CD133-、CD133+/-)和细胞数量(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>）;（b）经测试细胞群产生的核心含量的百分比（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>）;（c）麦克风和帕拉酮形态，取决于测试细胞的表型，倒置显微镜，据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:mtext> 酒吧据/mml:mtext> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 400据/mml:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ.据/mml:mi> <mml:mtext> m据/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>．据/p> <fig id="fig3a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.003a"></graphic> </fig> <fig id="fig3b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.003b"></graphic> </fig> <fig id="fig3c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.003c"></graphic> </fig> </fig-group> <p>除了CD133细胞外，每个细胞群都形成了全克隆形态的菌落，使用最低的细胞数量(10个细胞)播种(图)据xref rid="fig2c" ref-type="fig"> 2 (c)据/xref>)．在未分选的CD133+/-细胞和CD133-细胞中，只有1.9%和1.3%的菌落是完全克隆。CD133+细胞的全克隆集落形成率最高(2.3%)。组间差异有统计学意义(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M25"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.047据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．据/p> </sec> <sec id="sec3.5"> <title>3．5．CD133+与CD133- B16-F10细胞间肿瘤形成差异无统计学意义据/title> <p>可触及的肿瘤开始出现后9天植入小鼠据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M26"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞和12天后的小鼠植入据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M27"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞。14 ~ 17 d后，15只动物(CD133+组8只，CD133-组7只)因肿瘤发展死亡据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M28"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>注射后，细胞和18只动物（包括CD133 +组中的10个动物和8中的8个）据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M29"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞。20-22天后，肿瘤是致命从2小鼠据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M30"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133 +组和2从据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M31"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133 -组。其余动物在随访6周后存活据xref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> S1据/xref>)．在用的小鼠组中发现了最多的诱导肿瘤据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M32"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133-基团CD133 +基团中的细胞（12/13个体（92％）和10/13（77％））。肿瘤迅速达到大尺寸，在植入部位生长，并迅速导致动物死亡。在对待的群体中据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M33"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133+组9/13(69%)和CD133-组7/13(54%)小鼠发生肿瘤过程。这些小鼠也显示出最晚期的癌症，大量转移到肾脏、肝脏和横膈膜。在其他组中，肿瘤最常见的是在腹膜腔，在植入部位，转移病灶较少。植入细胞数最少的组发病率最低(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M34"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>)， CD133+组为7/13 (54%)，CD133-组为5/13(38%)。这些组的肿瘤体积很大，但生长缓慢，不会导致动物的快速死亡。CD133+组肿瘤总数约高出27% (133 vs. 105;据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M35"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.490据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．在存活率的情况下，CD133组完成随访的小鼠大约多了15% (据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M36"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.651据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．据/p> <p>我们决定将所有动物分析在一起，无论存活率如何，因为较高的死亡率表明疾病的显着进展。另外，所有动物组合每组的所有动物允许获得适当数量的动物进行统计分析。据/p> <p>在组之间比较了发育肿瘤的数量（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M37"> <mml:mi> N据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 78据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>、表据xref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> S1据/xref>)．注射CD133 +细胞在受体生物体中引发了56个肿瘤灶的出现，约22％（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M38"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.190据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>）在注射CD133-级分（46个肿瘤焦点）之后。据/p> <p>肿瘤位于给药部位，腹腔(47例)，膈(17例)，肾(15例)，肝(14例)，精囊(7例)，肺(3例)。据/p> <p>无论植入细胞的数量如何，肿瘤发生的起始潜能都要高出约15% (据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M39"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.238据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)在表达CD133标记的细胞群中与CD133-细胞群比较。没有统计学上的显著差异，但在所有组中观察到类似的趋势。据/p> <p>各组肿瘤位置的例子见图据xref rid="fig4" ref-type="fig"> 4.据/xref>．所有肿瘤呈典型的黑色，并伴有黑色素积聚。肿瘤在植入部位形成，位于肠系膜的肿瘤体积相当大。位于肝脏、肾脏或横膈膜等器官区域的肿瘤体积较小，形状也不同(更椭圆形)。据/p> <fig id="fig4"> <label>图4.据/label> <p>肿瘤的发展依赖于密度和植入B16-F10细胞的表型。肿瘤放置的例子：（a）腹膜注射部位，（b）中肠系膜，（C）隔膜，（d）肝脏，以及（e）肾脏。据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.004"></graphic> </fig> </sec> <sec id="sec3.6"> <title>3.6。在测试的人群之间观察到肿瘤质量，坏死区域和异常有丝分裂的差异据/title> <p>肿瘤的平均质量在注射了该药物的小鼠组中最高据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M40"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>B16-F10 - CD133-细胞，注射后最低据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M41"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133 +细胞。在测试的细胞基团之间没有统计学上显着的差异（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M42"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.248据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．肿瘤质量与植入细胞数量和表型的关系如图所示据xref rid="fig5a" ref-type="fig"> 5(一个)据/xref>．CD133+组平均肿瘤质量为0.74 g, CD133-组平均肿瘤质量为0.78 g (据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M43"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.877据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>）（数字据xref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> S1据/xref>)．据/p> <fig-group id="fig5"> <label>图5.据/label> <p>随访结束后的肿瘤特征:(a)肿瘤的平均体积取决于表型和植入细胞的数量;(b)肿瘤坏死区域的平均值，取决于表型和植入细胞的数量;(c)肿瘤中有丝分裂计数的平均值，视表型和植入细胞的数量而定;(100 +)据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M44"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>表达CD133抗原的B16-F10细胞植入小鼠;(100 -) -据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M45"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>不表达CD133抗原的B16-F10细胞植入小鼠。据/p> <fig id="fig5a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.005a"></graphic> </fig> <fig id="fig5b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.005b"></graphic> </fig> <fig id="fig5c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.fig.005c"></graphic> </fig> </fig-group> <p>组织病理学评估表明，所有测试的肿瘤都是恶性黑色素瘤。肿瘤坏死的区域介于0到90％之间。在注射的小鼠组中观察到分离肿瘤中坏死区域的最高平均值据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M46"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133细胞在小鼠体内的含量最低据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M47"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>和据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M48"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>CD133 -细胞。此外，两组间坏死面积无显著差异(据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M49"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.676据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．图中显示了植入细胞数和植入细胞数与坏死区域的平均值之间的关系据xref rid="fig5b" ref-type="fig"> 5 (b)据/xref>．据/p> <p>在所有肿瘤中均发现大量异常的有丝分裂(图据xref rid="fig5c" ref-type="fig"> 5（c）据/xref>，无花果。据xref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> S2据/xref>)．在团中，据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M50"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>植入细胞，观察到含有丝分裂指数的最多肿瘤数量（表据xref rid="tab1" ref-type="table"> 1据/xref>)．所有研究的群体之间没有统计学上的显着差异（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M51"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 0.239据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)．据/p> <table-wrap id="tab1"> <label>表格1据/label> <p>肿瘤有丝分裂指数(%)取决于表型和被检查细胞的数量。据/p> <table> <thead> <tr> <th></th> <th align="center" colspan="3"> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M52"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></th> <th align="center" colspan="3"> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M53"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 3.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></th> <th align="center" colspan="3"> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M54"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula></th> </tr> <tr> <th align="left">规模据/th> <th align="center">0-3据/th> <th align="center">3 - 5据/th> <th align="center">> 5据/th> <th align="center">0-3据/th> <th align="center">3 - 5据/th> <th align="center">> 5据/th> <th align="center">0-3据/th> <th align="center">3 - 5据/th> <th align="center">> 5据/th> </tr> </thead> <tbody> <tr> <td align="left">CD133 +据/td> <td align="center">40.9据/td> <td align="center">4.6据/td> <td align="center">4.6据/td> <td align="center">36.2据/td> <td align="center">8．5据/td> <td align="center">6.4据/td> <td align="center">42.4据/td> <td align="center">18.2据/td> <td align="center">3.0.据/td> </tr> <tr> <td align="left">CD133 -据/td> <td align="center">40.9据/td> <td align="center">9.1据/td> <td align="center">0.据/td> <td align="center">34.0据/td> <td align="center">10.6据/td> <td align="center">4.3据/td> <td align="center">21.2据/td> <td align="center">15.2据/td> <td align="center">0.据/td> </tr> </tbody> </table> </table-wrap> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4.讨论据/title> <p>恶性黑色素瘤是侵袭性最强的癌症类型之一，近年来发病率迅速上升[据xref ref-type="bibr" rid="B14"> 14据/xref>］.黑色素瘤治疗的主要问题之一是肿瘤的侵袭性和转移能力[据xref ref-type="bibr" rid="B15"> 15据/xref>］.晚期疾病患者的治疗效果有限，提示黑色素瘤含有大量对全身治疗有耐药性的细胞。这一概念证明了CSCs的存在，它可以在癌症复发和转移中发挥重要作用[据xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B16"> 16据/xref>］.CSC受孕假设肿瘤可以从单个CSC开发，这就是为什么所有在治疗期间都必须消除。许多研究正在处理开发有效的CSC识别方法，未来可以打开新的治疗观点[据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17据/xref>］.本研究旨在评估CD133表面标记物在黑素瘤CSCs鉴定中的适用性。据/p> <p>允许流式细胞术的研制检测表面标记，其又允许CSC搜索和识别。第一次潜在检测到的CSCS之一是CD34 + CD38-髓性白血病细胞[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18据/xref>］.在实体肿瘤中，首先在乳腺癌中描述为CD44 + CD24−/低谱系的癌症干细胞[据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19据/xref>］.CD133是在第一次鉴定为造血祖细胞和神经干细胞的标记物，但在许多其他癌症包括黑色素瘤中也检测到该标记物的存在[据xref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21据/xref>］.据/p> <p>CSCs占整个黑色素瘤细胞的比例非常小(<1%)，这与本研究的结果(0.12%)一致[据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B22"> 22据/xref>］.我们使用了来自B16-F10细胞系的CD133 +黑素瘤细胞分离的磁细胞分选。类似的技术已成功用于将相同的细胞群分离，与BLM，MV3和A375（A375）的其他黑素瘤细胞分离据xref ref-type="bibr" rid="B23"> 23据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B25"> 25据/xref>］.在我们的实验中，我们观察到CD133 +细胞和其它两种试验群体之间细胞增殖的差异。当细胞密度更高用于分析这种差异尤其明显。在其他研究中，已显示同时表达CD133和CD44抗原的细胞中建立异种移植物黑素瘤血管利基[据xref ref-type="bibr" rid="B26"> 26据/xref>］.2 d细胞培养据italic> 体外据/italic>与...相比，强制不同的增长特征据italic> 在活的有机体内据/italic>由于干细胞从生态位微环境中退出而造成的条件。对于在平面上生长的细胞来说，细胞与细胞的接触非常重要，这一特征因细胞类型而异，这意味着某些细胞系必须以更高的密度播种;否则，由于缺乏来自邻近细胞的信号，可能会发生增殖抑制。众所周知，表达CD133标记的细胞在分裂和分化过程中会失去它，这就是为什么在单独分离CD133+细胞后，我们也不能获得更多的阳性细胞[据xref ref-type="bibr" rid="B27"> 27据/xref>］.密度越大，CD133+细胞分裂速度越快，分化速度越快，CD133阴性细胞数量越多，阳性细胞数量也就越多(图)据xref rid="fig2b" ref-type="fig"> 2 (b)据/xref>)．第一次分裂周期后CD133+细胞密度降低，可恢复异质群和CD133-群中类似的CD133+细胞池，其中阳性细胞出现可能是脱分化的结果。这就是为什么在这种情况下，所有三个测试群体的增长特征是相似的(图据xref rid="fig2a" ref-type="fig"> 2(一个)据/xref>)．CD133+细胞在更高的密度下生长更快，这也是由全克隆的产生引起的，其特征是广泛的增殖和自我更新潜能[据xref ref-type="bibr" rid="B28"> 28据/xref>］.全克隆表达与干细胞能力相关的生存和自我更新基因[据xref ref-type="bibr" rid="B28"> 28据/xref>］.在我们的研究中进行的克隆菌测定表明，在所有测试密度中，在CD133 +基团中可见较数较多的核。另外，在CD133-群体中，以最低密度播种，观察到缺乏荷罗酮（图据xref rid="fig3b" ref-type="fig"> 3 (b)据/xref>)．我们的据italic> 体外据/italic>实验表明，CD133+黑色素瘤细胞与不表达该标记物的细胞相比具有不同的特性。根据获得的结果，CD133+黑色素瘤细胞与CD133-和未分类细胞相比的优势可能表明CD133+的干细胞特性。与CD133细胞相比，表达这种标记物的黑色素瘤细胞对咖啡酸苯乙酯、紫杉醇或福莫司汀等药物的耐药性增强[据xref ref-type="bibr" rid="B23"> 23据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B25"> 25据/xref>］.据/p> <p>CD133作为干细胞标记物的存在更为复杂，并且在不同的黑色素瘤细胞系之间存在差异。Zimmer等人的研究分析了9种不同的人类黑色素瘤细胞系;CD133+细胞百分率在1 ~ 90%之间，但只有从D10细胞系分离的阳性细胞具有明显较高的克隆潜能[据xref ref-type="bibr" rid="B29"> 29据/xref>］.黑色素瘤癌症干细胞识别可能更复杂，并且对于其适当的检测，需要分析几个标记的分析。在CD133 +，CD44 +和与B16-F10细胞系中分离的CD24 +细胞中观察到较高的克隆潜能[据xref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.据/xref>］.具有这种表型的细胞也不同于形态（在外观上更圆润），而没有表达那些三个标记的细胞是主轴形状的。在我们的研究中，我们没有观察到三种测试群体之间的形态的变化，仅使用CD133抗原分离，这支持用于CSC隔离的多于一个标记的论证是必要的。据/p> <p>我们的研究结果表明CD133 +人口是性能观察据italic> 体外据/italic>没有确认据italic> 在活的有机体内据/italic>．在Monzani等人的研究中，仅CD133 +注入到在数NOD / SCID小鼠后，从人黑色素瘤（表达水平相似象在我们的1％以上的研究）分离据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M55"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 5.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>40天后诱发可触及肿瘤。CD133-细胞诱导肿瘤4个月后仍未见[据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21据/xref>］.在对9个不同的黑色素瘤细胞系进行的另一项研究中，同样地，只有表达CD133标记的细胞在植入SCID小鼠细胞系后诱导肿瘤形成[据xref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.据/xref>］.另一组的结果与我们的研究结果相似，显示27%的黑色素瘤细胞有形成肿瘤的能力。我们分析了50种不同的人类黑色素瘤表面标记物，从中选择了15种(包括CD133)作为潜在的致癌标记物。将表达不同标记物的细胞植入NOD/SCID和NOD/SCID Il2rg-/-。在免疫系统受损程度较高的第二个小鼠品系中，所有植入细胞均产生肿瘤生长[据xref ref-type="bibr" rid="B31"> 31据/xref>］.大多数处理CSC检测和鉴定研究的来自于其中的人类细胞植入到免疫缺陷动物异种移植研究。这些结果的解释可能是困难的，因为种间屏障的影响，环境和免疫学相互作用在一起。在我们的研究中，细胞植入到同基因动物，可能是肿瘤发生的双方分析黑素瘤人群的原因。与之前描述的一起研究，我们的研究结果表明，对于其他标志物的共表达的黑色素瘤CSC鉴定分析是必要的。相比与其他表型的细胞B16-F10黑素瘤细胞与CD133，CD44，和CD24的表达产生最快的肿瘤形成，尽管它们在五次较小密度[植入据xref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.据/xref>］.其可用于黑色素瘤的CSC的识别其他潜在标记物是ABC家族（ABCG2，ABCB5），CD166，和巢蛋白[成员据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B32"> 32据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B33"> 33据/xref>］.有趣的候选物也是CD271表面标记物（P75中腹部）[据xref ref-type="bibr" rid="B34"> 34据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B35"> 35据/xref>］.在黑色素瘤播散的肿瘤细胞（HMB-45 +和CD45 - ），也观察到CD133标志物的表达。缺乏CD45抗原的使为在骨髓中这些细胞的鉴别[据xref ref-type="bibr" rid="B36"> 36据/xref>］.据/p> <p>细胞注射在肿瘤发生发展中也起着重要作用。钟等人的研究表明，至少注射据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M56"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>在C57BL/6小鼠中，肿瘤发生需要静脉或皮下注射B16-F10细胞，而80%的小鼠腹腔植入后仅10个细胞就足以形成肿瘤[据xref ref-type="bibr" rid="B37"> 37据/xref>］.在我们的研究中，在相同的动物模型进行的，腹腔注入据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M57"> <mml:mn> 1据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 2据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>54%和38%的病例中，CD133+和CD133-细胞分别导致了肿瘤的形成。CD133阴性B16-F10细胞植入后的肿瘤生长可能是由于该细胞群通过积累遗传变化或环境因素和来自受者机体生态位的信号获得干细胞特性的能力[据xref ref-type="bibr" rid="B38"> 38据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B39"> 39据/xref>］.对黑色素瘤患者切片的meta分析显示，CD133单独并不是识别黑色素瘤CSCs的合适的生物标志物。分析包括299例黑色素瘤患者，采用免疫组化分析[据xref ref-type="bibr" rid="B8"> 8.据/xref>］.当研究了两个或更多个标记的共表达时，高CD133表达和黑素瘤进展之间的相关性更为显着。据/p> </sec> <sec id="sec5"> <title>5.结论据/title> <p>综上所述，CD133标记物的表达促进了B16-F10黑色素瘤细胞的生长据italic> 体外据/italic>．在植入动物模型后，CD133+和CD133-人群都导致了肿瘤的发展。CD133与其他标记物共表达的分析对于正确鉴定黑色素瘤CSCs是必要的。据/p> </sec> <back> <glossary> <title>缩写据/title> <def-list> <def-item> <term> CSCS：据/term> <def> <p>癌症干细胞据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> DMEM / HAM的F12媒体：据/term> <def> <p>杜尔贝科的改良版鹰牌据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> 的边后卫:据/term> <def> <p>胎牛血清据/p> </def> </def-item> <def-item> <term> mac:据/term> <def> <p>磁性活性细胞分选。据/p> </def> </def-item> </def-list> </glossary> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性据/title> <p>所有数据都在手稿中呈现。据/p> </sec> <sec> <title>同意据/title> <p>不适用。据/p> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>的利益冲突据/title> <p>两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。据/p> </sec> <sec> <title>作者的贡献据/title> <p>TK参与了调查，数据分析，起草手稿，并给予最终批准。JJ参与了调查，数据分析，并最终批准。AJ参与了调查，数据分析，起草手稿，并给予最终批准。DB参与了调查，起草了手稿，并给予了最终批准。KS参与了调查，起草了手稿，并给予了最终批准。MBu参与了调查，起草了手稿，并给予了最终批准。MBo参与了调查，并给予了最终批准。AM参与了调查，修改了手稿，并最终批准了。GD参与了对稿件的修改并最终批准。TD贡献了概念和设计，数据分析，修改手稿，并给予最终批准。 MP contributed to the concept and design, data analysis, revising the manuscript, and given final approval. All authors have read and approved the final manuscript.据/p> </sec> <sec> <title>资金据/title> <p>本研究由第296号法定活动框架下的研究课题资助。据/p> </sec> <sec sec-type="supplementary-material" id="supplementary-material-1"> <title>补充材料据/title> <supplementary-material xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.f1.pdf" id="supp-1" mimetype="application/pdf"> <label>补充1据/label> <p>图S1。肿瘤性质分布。平均肿瘤肿块、坏死面积和有丝分裂计数用小提琴图表示，以说明其在试验组之间的分布(CD133+ vs. CD133-)。据/p> </supplementary-material> <supplementary-material xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.f2.pdf" id="supp-2" mimetype="application/pdf"> <label>补充2据/label> <p>图S2。有丝分裂指数的评估。肿瘤中有丝分裂的例子(箭头)取决于表型和植入细胞的数量，光学显微镜，据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M58"> <mml:mtext> 酒吧据/mml:mtext> <mml:mo> =据/mml:mo> <mml:mn> 50据/mml:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mi> μ.据/mml:mi> <mml:mtext> m据/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>．据/p> </supplementary-material> <supplementary-material xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2020/8810476.f3.docx" id="supp-3" mimetype="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.document"> <label>补充3据/label> <p>表S1。根据CD133标记的表达和植入细胞数量的体内肿瘤内酯的详细分布。据/p> </supplementary-material> </sec> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1据/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Karimkhani据/surname> <given-names> C。据/given-names> </name> <name> <surname> 雷据/surname> <given-names> 经过。据/given-names> </name> <name> <surname> Dellavalle.据/surname> <given-names> r P。据/given-names> </name> <name> <surname> Sundararajan据/surname> <given-names> S.据/given-names> </name> </person-group> <article-title> 用于不可切种和转移性黑素瘤的新疗法据/article-title> <source> <italic> BMJ据/italic> <year> 2017据/year> <volume> 359年,文章j5174据/volume> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1136 / bmj.j5174据/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 85042781624据/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2据/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 读据/surname> <given-names> r . L。据/given-names> </name> <name> <surname> Madronio据/surname> <given-names> 厘米。据/given-names> </name> <name> <surname> 卡斯特据/surname> <given-names> A. E.据/given-names> </name> <name> <surname> Goumas据/surname> <given-names> C。据/given-names> </name> <name> <surname> 瓦特据/surname> <given-names> C。据/given-names> </name> <name> <surname> 孟席斯据/surname> <given-names> S.据/given-names> </name> <name> <surname> 截图据/surname> <given-names> 一种。据/given-names> </name> <name> <surname> 曼据/surname> <given-names> G。据/given-names> </name> <name> <surname> 汤普森据/surname> <given-names> J。据/given-names> </name> <name> <surname> 莫顿据/surname> <given-names> R.据/given-names> </name> </person-group> <article-title> 后续原发性皮肤黑色素瘤的诊断后建议：在新南威尔士州，澳大利亚的人口为基础的研究据/article-title> <source> <italic> 外科肿瘤学年鉴据/italic> <year> 2018据/year> <volume> 25据/volume> <issue> 3.据/issue> <fpage> 617.据/fpage> <lpage> 625.据/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1245 / s10434-017-6319-z据/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2-S2.0-8504000307078据/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 29299710据/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B3" content-type="article"> <label>3.据/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Forsea据/surname> <given-names> 是。据/given-names> </name> <name> <surname> 德尔Marmol据/surname> <given-names> V.据/given-names> </name> <name> <surname> 德弗里斯据/surname> <given-names> E.据/given-names> </name> <name> <surname> 贝利据/surname> <given-names> E·E。据/given-names> </name> <name> <surname> 盖勒据/surname> <given-names> A. 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