1。介绍
间充质干细胞(msc)根据具备干细胞特征,能够分化成多种细胞类型,低免疫原性和致瘤性,和营养因子的分泌。基于这些有益的属性,msc被广泛用于细胞疗法(
1 ]。然而,他们通常被证明包括异构混合不同的亚种。重要的是,msc的异质性是各种条件的结果包括细胞大小、生长速率、形态、分化潜能,和衰老,导致发展的障碍MSC-based疗法(
2 - - - - - -
4 ]。这种异构性限制的一般理解的机制,通过msc保持增殖能力和经历对特定谱系分化潜力,以及方法与治疗性应用程序实现更好的结果。异构性主要受媒体增长,二维坚持塑料盘子,在文化和亚文化的方法。然而,这种处理可以重复获得大规模生产足够数量的msc。
在这种背景下,许多研究人员试图建立一套标准的标准来实现更多数量的同质msc。然而,很少有研究试图文化msc来自单个细胞或殖民地,和每个原始细胞不同于彼此
5 - - - - - -
7 ]。此外,这些获得msc包含混合种群表现出不同的形态特征和基因表达模式(
8 ),这可能意味着所有细胞培养在过渡文化环境。最近,几组开发协议隔离更均匀的细胞来自异类人群使用特定抗原(
9 - - - - - -
11 ];然而,这些过程都没有被广泛接受,因为没有独特的单一标记。其他研究表明细胞播种密度或融合作为主要贡献者改变在形态和大小
3 ,
12 ,
13 ]。然而,我们所知,这些程序没有影响MSC表型。尽管有这样的尝试,仍然没有定义文化协议可以克服MSC异质性。
虽然细胞异质性是由各种因素引起的,异构的细胞显示许多共同特征,使他们容易区分基于细胞的大小。msc在扩张显著增加的大小。重要的是,衰老细胞增加单元格大小,有时扩大超过两个相对的大小nonsenescent细胞(
14 ),这有助于解释一些衰老细胞的生物活性;SA
β 加活动和增长逮捕[
14 ]。此外,msc异质性大小显示为主要细胞培养时衰老。此外,一些研究表明一种优势利用小细胞来自异构msc的骨髓(BM)或脐带(UC)提高干细胞的功能由于以下原因:(i) msc包含小纺锤状细胞快速增长,而大型或扁平细胞扩大更慢;(2)迅速干细胞自我更新的细胞或回收的大小是在≤7 ~ 8
μ 米直径或更小;(3)小细胞(≤8 ~ 10
μ 米直径)multilineage分化潜力更大比大细胞种群丰富;及(iv)小的人口(≤11
μ 米直径)展品更快的增长和缓慢老化
15 - - - - - -
17 ]。
小的msc可以主要通过以下三种方法:分离流仪排序、逆流洗脱(
17 ,
18 ),和微流体排序
19 ]。然而,没有标记的特点为小细胞。此外,建立标记有助于形成强小msc,我们筛选小细胞表面蛋白的表达通过fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)分析242个不同的细胞表面抗体。检查表面蛋白中,我们发现最高的表皮生长因子受体(EGFR)的表达和整合素
α 6 (CD49f)人口规模小。在目前的研究中,我们旨在分析小型人口的干细胞特征的人类脐带blood-MSCs (UCB-MSCs)使用一个过滤器和离心机系统。我们的研究结果提供证据支持这个小数量的影响来源于UCB-MSCs和贡献新的小细胞表面标记,贡献者MSC异质性和治疗应用感兴趣的。
2。方法
2.1。细胞培养和生长动力学
UCB经脐静脉的处理婴儿新生儿分娩后24 h内的孤立和分离单核细胞(跨国公司)与Ficoll-Hypaque解决方案(
密度
=
1.077
克/厘米3 ;通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典),其次是先前的协议(
20. ,
21 ]。这个协议的机构审查委员会批准MEDIPOST有限公司有限公司(mp - 2014 - 07 - 1 - 1)。跨国公司与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)和最低基本培养基培养
α 介质(MEM -
α ,Gibco /表达载体,卡尔斯巴德,宏伟的岛,纽约,美国),补充10%胎牛血清(Gibco) 37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2 。培养基是每周更换2次。的基本表征UCB-MSCs总结了补充表
1 。主要BM-MSCs和人类AT-MSCs买来Promega (Gibco /表达载体,海德堡,德国)。增长动力学、台盼蓝排斥法进行分析活细胞的扩张。在每个通道(P), msc是培养5天,那么受移植者的细胞密度2000细胞/厘米2 。每个通道的PD计算除以2的对数(
20. ]。分析PD一直持续到细胞的增殖是停了下来。
2.2。在Multilineage分化潜能
评估multilineage潜力,细胞培养在特定条件下诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。分化后,multilineage潜力评估如前所述[
21 ,
22 ]。简而言之,骨细胞形成评估通过测量水平的高山染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国);软骨细胞的形成是由番红精O染色(σ);脂肪细胞形成评估基于油红O染色积累的脂质空泡(σ)。
2.3。孤立的单元尺寸
msc被分为三组根据直径8
μ m: nonsieved人口(异类),
人口
>
8
μ (大)
人口
≤
8
μ 米(小)。Size-sieved样本处理方法总结补充图
1 。基于大小的隔离,我们准备好的过滤器考虑破坏msc的风险和安全使用孝感亚光的滤膜管(8
μ 孔隙大小,孝感,湖北省,中国)。首先,滤膜管是管插入到50毫升文化。接下来,
1
×
10
5
msc / mL被装载在一个过滤膜管。最后,管离心机1200 rpm 5分钟获得三个人口(异构:unsieved;大:上层的过滤器;和小:低层过滤器)。尺寸测量,细胞被收获,颗粒状,悬浮在媒体,用移液器吸取血细胞计数器。在100 x放大图像被收购(ECLIPSE TS100尼康仪器Inc .,梅尔维尔,纽约,美国)在多个地区。在拍摄区域,活细胞的大小进行了分析使用萨比亚(MeTooSoft,首尔,韩国)。细胞的光散射特性测量使用流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣地亚哥,CA)探测光束。向前散射分布直方图为每个细胞群在计算机上生成的流式细胞术从原始数据文件。
2.4。细胞粘附试验
细胞粘附试验进行使用IncuCyte(埃森生物科学,安阿伯市,MI)。细胞被播种在三个复制2000个细胞/厘米2 在6-well平坦的盘子,生长在37°C,公司为5%2 。图像获得在6、12、18、24小时使用自动化的图像采集软件。在每个时间点细胞数量也决定使用细胞计数器插件ImageJ [
23 ]。
2.5。细胞表面与Lysoplates抗体筛查
屏幕人类表面标记msc 242抗体在96孔板(冻干BD LysoplatesTM;BD生物科学)为0.5
μ g /好和孵化500000 msc /好。用20分钟调整在冰上,洗细胞染色的Alexa萤石®647 -共轭goat-anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(分子探针,尤金或)。流式细胞仪进行测量表面标记使用FACSCalibur仪器(BD生物科学)。流式细胞仪的数据分析了Excel 2013(微软,微软,佤邦)来产生热量地图(
20. ]。
2.6。流式细胞术和排序
评估和分析表面标记msc、彩色与人类细胞CD14、CD45、CD49b, CD49d,和HLA-DR (BD生物科学)异硫氰酸荧光素(FITC)抗体,人类CD29、CD44, CD90、CD340,表皮生长因子受体,HLA-ABC (BD生物科学)和CD105(英国Kidlington Serotec)藻红蛋白(PE)抗体,和人类CD49f (BD生物科学)alexa 647抗体。同形像匹配控制鼠标检测非特异性背景信号负控制。彩色的msc FACSCalibur仪器测定。使用特定的标记排序,msc与表皮生长因子受体或彩色CD49f单克隆抗体。表皮生长因子受体和CD49f排序95%纯度使用FACSVantage细胞分选系统(BD生物科学)。
2.7。Senescence-Associated <斜体>β< /斜体>加染色(SA) <斜体>β< /斜体>加染色)
评估的衰老msc、SA
β 加染色进行装备用组织化学染色(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)根据制造商的指示。的百分比
衰老
细胞
=
的
数量
的
积极
染色
细胞
/
总
数量
的
细胞
(
20. ]。
2.8。西方墨点法
•瑞帕缓冲细胞细胞溶解,以提取蛋白质。总共有10
μ 克的蛋白质提取电泳在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶,然后解决蛋白质转移到硝化纤维膜。屏蔽膜与初级孵化抗体phospho-p53 (pho-p53), p16, phospho-Rb (pho-Rb)、p53、p21, Rb(细胞信号),和p16 (Abcam,剑桥,英国),其次是辣根peroxidase-conjugated二级抗体。化学发光强度的免疫印迹乐队使用ChemiDoc可视化成像系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。每个乐队的强度是标准化的
β 肌动蛋白(罗福斯生物制剂,纪念,有限公司,美国)。
2.9。定量实时PCR和小干扰RNA实验
实时定量PCR (qPCR)进行普遍设计Oct4或Nanog TaqMan探针使用LightCyclerTM 480(罗氏,曼海姆,德国)。Oct4或Nanog mrna的相对表达水平正常化
β 肌动蛋白mRNA的表达。表皮生长因子受体、CD49f和控制小干扰RNA (siRNA)从Dharmacon购买(美国芝加哥,IL)。siRNAs EGFR siRNA, CD49f核,或者炒siRNA被转染24小时使用DharmaFECT试剂(Dharmacon)根据制造商的指示。四个不同的核工器被描述在补充表
2 。当细胞被检查在多个段落,新创的转染siRNAs在每个通道进行。
2.10。肺气肿动物模型
综述了所有动物实验和批准的机构动物保健和使用委员会MEDIPOST有限公司有限公司(mp - 2015 - 6 - 5)。C57BL / 6小鼠购自Samtako BioKorea有限公司(乌山、韩国)。生成elastase-induced模型,6周大女性C57BL / 6 j小鼠气管内的灌输与猪胰弹性蛋白酶(0.4 U /鼠标)(σ)。然后小鼠静脉注射
1
×
10
4
UCB-MSCs的第七天。7天之后,所有肺组织程序只幸存的动物演出做准备。组织病理学评价,肺灌注了磷酸盐(PBS)通过右心室和膨胀通过气管与PBS。气管的结扎,和肺被移除,沉浸在相同的固定剂在室温下过夜。固定肺嵌在石蜡和切割到4
μ 米厚度。基于六部分从石蜡块化验不重叠的随机领域每节与苏木精和伊红染色())。alveolarization决心通过测量均值水平线性拦截(多层互连)。意味着牙槽间的距离测量多层互连,除以总长度的线画在肺部分遇到拦截的数量,所述[
24 ]。免疫荧光,肺部分在4°C在一夜之间被孵化主要抗体包括鼠标anti-surfactant蛋白C (SP-C Abcam),鼠标anti-von血友病因子(vWF、细胞信号),和人类的反
β 2-microglobulin (
β 2毫克,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国),可视化使用FITC或Cy3-labeled二级抗体(杰克逊ImmunoResearch欧洲有限公司纽马克特,英国)。核与4复染色
′
6-diamino-2-phenylindoled (DAPIσ)。
2.11。统计分析
与SPSS统计分析进行了18(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)使用单向方差分析其次是最低(LSD)事后测试的区别。数据表示为
的意思是
±
标准
偏差
(SD)的值在实验中获得至少执行一式三份。
p
<
0.05
被认为是显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。UCB-MSCs显示一个异构单元尺寸
UCB-MSCs扩张依赖于坚持塑料水瓶,这是关于异构性的问题。用显微镜观察细胞形态,单个细胞被胰蛋白酶化了。UCB-MSCs都成形态和异质性就在P5(图的形状和大小
1(一) )。我们分析了细胞UCB-MSCs基于细胞直径的大小。正如所料,UCB-MSCs表现出不同的细胞大小,从3
μ 米到25
μ 米直径(图
1 (b) )。此外,随着长时间的使
在体外 UCB-MSCs显示,单元尺寸的增加,成为形态学扩大和夷为平地,SA
β 加活动,称为复制衰老的标志(图
1 (c) )。这些结果表明,UCB-MSCs与细胞衰老的细胞大小。与先前的研究报道,细胞
直径
≤
7
~ 10
μ m(细胞或小尺寸)回收茎细胞迅速增殖,而在其他细胞群(
14 ,
15 ]。在这项研究中,小细胞≤8
μ 米直径。之间的联系进一步确认UCB-MSCs能力较小的规模和增长,我们分析了累积人口翻倍(PD)和细胞大小UCB-MSCs来自10个不同的捐赠者。由计数细胞细胞扩张生长动力学评估在每个通道。我们测量单元尺寸单个细胞图像的基础上从四个领域的早期阶段和分析的比例较小的细胞(补充表
3 在长期的文化。接下来,我们这些分类分为两组。特别是,msc组我停止增长更快,更快的衰老过程较低累积PD比第二组(组我,
24.0
±
6.2
与第二组,
59.7
±
7.8
;
p
<
0.01
;图
1 (d) 和补充图
2 )。有趣的是,这些组织显示,细胞大小显著差异(组我,
13.6
±
5
%与第二组,
10.1
±
5
%;
p
<
0.01
;图
1 (e) 部分小细胞(集团)和我,
37.7.5
±
5
%与第二组,
15.5
±
5
%;
p
<
0.01
;图
1 (f) 在P2)。总的来说,这些结果表明,细胞大小与异质性的细胞生长和衰老UCB-MSCs。
图1
UCB-MSCs细胞大小分布。(一)观察UCB-MSCs spindle-like成细胞异质性有关形状(上半部分)和单个细胞在P5(下图)。(b)细胞大小的分布进行了分析。(c)细胞的大小是增加在单个细胞扩张。这些细胞被沾染了SA
β 加。基于细胞生长(d), 10很多UCB-MSCs分为两组表现出显著差异累积PD,组我(UCB # 1 - # 4)和组II (UCB # 5 # 10)。(e)细胞大小和测量(f)的比例较小的细胞在第二组我和组早期(P2) (
的意思是
±
SD
,
∗
∗
p
<
0.01
而我)。
规模
酒吧
=
10
μ m;帕金森病:人口增加了一倍。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.2。的小细胞群UCB-MSCs具有增强干细胞特性
后分离不同大小的数量(异性恋、大型和小型),我们比较他们的干细胞属性包括形态、immunophenotype,分化能力,具备干细胞,附着力潜力。类似纺锤状形态观察的三种群(图
2(一个) )。Immunophenotypic分析显示,三个种群呈阳性表达CD29、CD44, CD90、CD105,和人类HLA-ABC,但消极CD14、CD34、CD45、或HLA-DR,根据国际社会细胞疗法(ISCT)标准(
25 )(表
1 )。调查multilineage分化、细胞培养在刺激媒体和评估通过对碱性磷酸酶(ALP)染色,番红精啊,和油红O,作为成骨的阳性标记,chondrogenic,和脂肪形成的分化(图
2 (b) )。小细胞其他人群的直接比较了相似的分化潜能为chondrogenic或脂肪形成的血统。值得注意的是,对成骨细胞、小细胞表达了强烈的高山活动和广泛的染色,相比其他细胞(图
2 (b) )。关于stemness-related基因(
Oct4 ,
Nanog ),在小细胞中表达水平明显高于其他人群(图
2 (c) )。检查粘附的潜力,我们分析了使用IncuCyte融合各种文化时期。数据显示的依从性差异小的细胞培养瓶相比,与异性或大细胞(图
2 (d) )。总的来说,这些结果表明,小型人口具备干细胞等增强属性,附着力和成骨的谱系分化。
图2
干细胞的特征differentially-sized人群。(一)细胞形态学分析了显微镜(
规模
酒吧
=
10
μ 米)。三个人口和梭形形态学观察。(b)在专门的感应媒体孵化期间,multilineage分化被评估为典型的谱系标记染色。分析了这三个人群,成骨细胞基于bone-type高山(上半部分)。全方位的图片是盒装插入所示。Chondrogenic细胞积累硫酸蛋白多糖对红色染料染色积极O(中间面板)。脂肪形成的细胞显示增强的脂质空泡在细胞质内,这是沾油红O(降低面板;
规模
酒吧
=
50
μ 米)。核与苏木精复染色。(c)具备干细胞基因(
Oct4 ,
Nanog )被qPCR量化。所有基因的表达水平是规范化的
β 肌动蛋白,表达水平规范化异构细胞中观察到,定义为1-fold表达式(
的意思是
±
SD
,
n
=
3
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。(d)的融合三个细胞群决定是基于坚持培养瓶在不同文化(
的意思是
±
SD
,
n
=
3
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
表1
表面标记表达在不同的干细胞数量。
标记
CD14
CD34
CD45
HLA博士
CD29
CD44
CD90
CD105
HLA ABC
异构
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
+
+
+
+
+
大
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
+
+
+
+
+
小
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
- - - - - -
+
+
+
+
+
+:超过95%;-:不到5%。
3.3。小细胞群具有较高的增长潜力和较低的衰老速度
用于治疗,更高的增殖潜力和减少衰老是重要的参数。在这里,我们调查的生长动力学和细胞衰老三个大小不同的人群。所有细胞在培养瓶不断通过定期直到停止增长。PD测量每段MSC从四个不同的捐赠者。在文化、小细胞表现出明显更大的扩张能力,而大细胞显示最低的增长率通道(图
3(一个) )。确定各种功能细胞衰老的三个人群相似,我们测试了SA
β 加染色和伴随老化蛋白表达。SA
β 加没有阳性细胞染色显示小型人群,而意味着异构和大细胞
11.7
±
2.8
%,
16.3
±
3所示。8
%通过票数。此外,SA
β 加在所有人口P12表达显著增加,但在小细胞水平显著低于其他组(图
3 (b) )。因为细胞周期调控与细胞衰老,我们评估pho-p53 pho-Rb, p21和p16通过免疫印迹。p21的表达pho-p53、p16和在小细胞低,而pho-Rb水平增加,相比在P12异构和大细胞(图
3 (c) )。因此,小型人口表现出最高的增长潜力和最低的衰老。
图3
增殖能力和衰老的大小不同的人群。(a)增长动力学的三种群被监测评估PD直到细胞增殖停止。黑色箭头表示孤立点的大小(
的意思是
±
SD
,
n
=
4
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。(b)衰老阶段明显是基于积极的SA
β 加在票数和P12染色。量化了染色阳性细胞计数。误差线代表
意味着
±
SD
,
n
=
4
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
。
规模
酒吧
=
10
μ m。(c)的表达senescence-associated蛋白(pho-p53, pho-Rb、p21和p16)测定在P12免疫印迹分析。表达水平正常化
β 肌动蛋白水平,表达水平的异质群体定义为1-fold (
的意思是
±
SD
,
n
=
3
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
);帕金森病:人口增加了一倍。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.4。表皮生长因子受体和CD49f调解各种小细胞的特征
各种表面蛋白的治理提出了MSC等特性具备干细胞和分化的潜能。因此,我们假设小细胞可能利用细胞表面蛋白质积极控制干细胞的特性。为了验证这个假设,我们利用一个表面标记数组包含242 CD标记抗体筛选差异表达异构或小细胞(补充表
4 )。结果,我们确定了五个细胞表面蛋白显著调节的小细胞,包括CD49b CD49d, CD49f CD340, EFGR(图
4(一) )。进一步考察这些筛查结果,我们测量了这五个表面蛋白的表达水平从三个不同的捐赠者通过流式细胞术。图中所示的数据
4 (b) 证实,EGFR和CD49f显著调节小细胞相比,水平异构或大型细胞。此外,EGFR的表达或CD49使后显著下降。在细节中,EGFR的表达+ CD49+ 对小细胞显著下降70%通过3到40%,通过7(补充表
5 )。验证表皮生长因子受体的作用或CD49f干细胞特性,我们沉默他们使用核小细胞(补充图
3 )。
图4
筛查细胞表面标记UCB-MSCs表达水平改变了基于细胞的大小。(a)热图分析显示小细胞相比,调节细胞表面抗原水平异质细胞。(b)确认筛选期间观察到的表面蛋白的增加,CD49b的蛋白表达,CD49d, CD49f, CD340,表皮生长因子受体是评估通过流式细胞术使用细胞从三个不同的捐助者(
意味着
±
SD
,
n
=
3;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。CD49f和表皮生长因子受体增加小细胞表达相比其他细胞(灰色框)。
(一)
![]()
(b)
![]()
相比在争夺siRNA-transfected细胞(si Con),从三个不同的捐赠者转染细胞对EGFR siRNA或CD49f评估形态、细胞大小、生长速率、具备干细胞粘附潜力,衰老表型。首先,在EGFR-silenced细胞,大的形态和细胞大小观察(增加数据
5(一个) 和
5 (b) )。进一步,他们表现出显著降低扩张产能,而对照组(天真,si Con)有较高的增长率(图
5 (c) )。基于衰老表型,SA
β 加活动显著增强EGFR-silenced细胞(图
5 (d) ),pho-p53伴随的变化,pho-Rb, p21, p16表达P12(图
5 (e) )。此外,EGFR-silenced细胞成骨分化显示恢复基于高山染色(图
5 (f) )。相比之下,具备干细胞和粘附潜在影响EGFR siRNA(数据没有显示)。接下来,CD49f-silenced细胞被奉承和显示大小的增加(数据
6(一) 和
6 (b) )。具备干细胞基因水平(
Oct4 ,
Nanog CD49f-silenced细胞)明显低于对照组(天真,如果案子,图
6 (c) 。更大的附着力可能也观察到,在对照组相比,和细胞迅速坚持培养瓶相比,CD49-silenced细胞(图
6 (d) )。CD49f沉默也导致显著降低骨生成,证实了高山染色(图
6 (e) )。相比之下,细胞生长和衰老表型没有改变CD49 siRNA组(数据没有显示)。确定表皮生长因子受体或CD49f表达式与干细胞属性在小细胞,我们基于排序的细胞表皮生长因子受体或CD49f表达式使用一种抗体。排序细胞纯度≥95%(补充图
4 ),排序组验证通过评估高山效率作为成骨细胞标记。SA
β 加活动作为衰老的指标分析。我们发现表皮生长因子受体+ 成骨的潜力,降低衰老细胞显示高于表皮生长因子受体- - - - - - 细胞(补充图
5 )。此外,更高的高山CD49f活动检测+ 细胞比CD49− 细胞(补充图
5 b )。因此,这些数据表明,抑制表皮生长因子受体或CD49f影响标记控制小型种群的生物活性,表明他们的效用作为潜在的标记。
图5
表皮生长因子受体击倒诱发衰老和导致失去分化能力。小型的间充质干细胞(msc)转染与小干扰rna (si Con)或EGFR siRNA争夺(si表皮生长因子受体)。(一)显微镜观察形态差异的附着力(上半部分)或单个细胞(较低的面板,
规模
酒吧
=
10
μ 米)。(b)细胞大小的三个人口扩张期间进行评估。表达水平是幼稚细胞,观察到的规范化定义为1-fold表达式(
的意思是
±
SD
,
n
=
45
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。(c)细胞培养常规条件下和人口翻倍(PD)评估直到细胞生长停止(
意味着
±
SD
,
n
=
3
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。(d)与SA细胞被染色
β 加,活动是通过计算测量positively-stained细胞在票数或P12 (
意味着
±
SD
,
n
=
3
;
∗
p
<
0.05
,
规模
酒吧
=
10
μ 米)。(e)的表达senescence-associated蛋白质免疫印迹分析和测定
β 肌动蛋白在P12被用作控制。表达水平是幼稚细胞,观察到的规范化定义为1-fold表达式(意味着±SD,
n
=
3
;
∗
∗
p
<
0.01
)。(f) 2周成骨诱导后,ALP水平取决于染色(
规模
酒吧
=
50
μ 米)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
图6
沉默CD49f抑制干细胞特性。小细胞治疗小干扰rna (si Con)或争夺CD49f核(si CD49f)。(一)显微镜观察形态差异的附着力(上半部分)或悬浮细胞(较低的面板,
规模
酒吧
=
10
μ 米)。(b)细胞大小的三个人口扩张期间进行评估。表达水平是幼稚细胞,观察到的规范化定义为1-fold表达式(
的意思是
±
SD
,
n
=
70年
;
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
)。(c)具备干细胞基因(
Oct4 ,
Nanog )被qPCR量化。所有基因的表达水平是规范化的
β 肌动蛋白,观察到的水平正常化幼稚细胞,定义为1-fold表达式(
的意思是
±
SD
,
n
=
3
;
∗
∗
p
<
0.01
)。(d)粘附潜力分析是基于融合不同文化的培养瓶(
的意思是
±
SD
,
n
=
3
;
∗
∗
p
<
0.01
)。(e)成骨细胞是衡量bone-type高山染色(
规模
酒吧
=
50
μ 米)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.5。小型细胞在不同成人组织的影响
调查是否来源于msc (BM-MSCs)或脂肪的骨头tissue-derived msc (AT-MSCs)从不同的成人来源有小细胞特性,我们分析了他们的形态学和细胞大小。如补充图所示
6 BM -和AT-MSCs显示关于形状和细胞大小的异质性。BM - AT-MSCs表现出不同的细胞大小和UCB-MSCs相比更大。UCB-MSCs被用作控制和细胞的平均直径
15.5
±
3所示。5
μ m (BM),
17.7
±
3所示。5
μ (在)
11.5
±
3所示。5
μ 在P2(补充图米(UCB)
6 b )。分析显示更大的潜在增长能力的小细胞相比,异构msc的三个来源。增加速度和小细胞持续的长期的关系,至少直到通道6(补充图
6摄氏度 )。接下来,我们测量效力标记包括CD49b CD49d, CD49f, CD340, EGFR msc的流式细胞仪的三个来源。有趣的是,数据证实表皮生长因子受体和CD49f显著调节水平相比,UCB-MSCs BM -或AT-MSCs(补充图
6 d )。集体,小型人口从BM - AT-MSCs也具有增长潜力高于异质细胞。
3.6。小细胞增强UCB-MSCs在动物模型的治疗潜力
然后,我们假设小msc可以用于组织再生。比较小型的治疗潜力人群与异构或肺大细胞疾病,我们分析了治疗结果与这些人群使用elastase-induced肺气肿小鼠模型。动物被注射了弹性蛋白酶,通过静脉注射UCB-MSCs大小不同的人群(
1
×
10
4
弹性蛋白酶注入后7天)。在小鼠肺组织的形态学分析是由测量均值线性拦截(多层互连),血管生成是评估基于血管性血友病因子(vWF)表达式,而肺修复被表面活性剂分析蛋白质C posttransplantation 7天(SP-C)水平。elastase-induced增加多层互连明显减毒与异构或小细胞治疗,最大的减少使用小型细胞。具体来说,肺泡治疗小细胞表型,表现戏剧性的再生,和多层互连回到一个正常的范围(
70.9
±
2.3
μ 米,图
7(一) )。elastase-induced减少vWF或SP-C表达显著增强了注入异构或小细胞,但不是大细胞(数字
7 (b) 和
7 (c) )。vWF的表达和小细胞治疗SP-C是高于异质细胞。注入的移植细胞,我们测试了道细胞的数量与抗体染色肺组织特定的人类
β 2毫克(绿色)3、5、7天,注射后,和小型msc导致更大的肺移植能力(图
7 (d) )。在一组不同的实验中,我们比较治疗效果基于小型细胞的比例使用elastase-induced肺气肿小鼠模型。两个MSC线使用,与MSC-I大很多(我的图
1 (d) ),小细胞的比例是9.2%。MSC-II组(组二世图的小很多
1 (d) ),小细胞率为35%。elastase-induced形态变化和受损的血管生成是减毒与这两个MSC移植组。多层互连显著低于肺注射MSC-II比肺部接收MSC-I(补充图
7一个 )。此外,动物的vWF水平MSC-II处理显著高于老鼠MSC-I处理(补充图
7 b )。曾有一些报道说关于旁分泌作用的msc治疗各种疾病模型,包括肺气肿(
26 - - - - - -
28 ]。同时,道msc在急性呼吸窘迫综合征的肺上皮细胞分泌旁分泌因子,如KGF(角质细胞生长因子),VEGF(血管内皮生长因子),和HGF(肝细胞生长因子),促进肺血管通透性的保护作用和上皮细胞的增殖
29日 ]。此外,PGE2(前列腺素E2)由msc分泌抑制炎性细胞因子和抗炎细胞因子刺激肺泡巨噬细胞分泌,il - 10 (
27 ,
28 ]。解释小细胞的治疗效果,我们分析了蛋白质表达水平与人类抗体荧光数组比较小和异质的细胞之间的蛋白表达。在生物处理(补充图
8 ),分泌蛋白的结果已经表明,VEGF, EGF, TIMP-2(金属蛋白酶2组织抑制剂),TSP-1(血小板反应蛋白- 1的),和Decorin由小细胞分泌增加,明显(补充图
8 b )。总的来说,我们的结果表明,小型人口增加有益肺再生在肺部疾病模型的结果。
图7
提高疗效的小型人口在一个elastase-induced肺气肿模型。(a - c)小鼠暴露于弹性蛋白酶7天然后血管内注射细胞大小不同的来自UCB-MSCs。7天(a)的组织学评估基于肺部分沾染了)。的形态学分析量化平均线性拦截(多层互连)(
的意思是
±
SD
,
n
=
40
;
∗
∗
p
<
0.01
)。(b)代表免疫荧光显微照片vWF染色的每组的肺。vWF是用FITC标记(绿色)和原子核与DAPI标记(蓝色)。vWF-positive细胞的数量是6个随机选择的字段数。vWF-positive细胞的百分比是规范化的基于核的数量(
的意思是
±
SD
,
n
=
6
;
∗
∗
p
<
0.01
)。(c) SP-C与Cy3标记(红色)和核用DAPI标记(蓝色)。SP-C-positive细胞的数量是6个随机选择的字段数。SP-C-positive细胞的百分比量化是基于核的数量(
的意思是
±
SD
,
n
=
6
;
∗
∗
p
<
0.01
)。(d)人类的数量
β 2 mg-stained细胞分析了至少六个随机选择的字段3,5,7天后细胞注入(
的意思是
±
SD
,
n
=
5
;
∗
∗
p
<
0.01
)。
规模
酒吧
=
50
μ m。D:一天;H:异构;L:大;学生:小。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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4所示。讨论
MSC文化的简单有担忧的异质性产生的细胞群,这是overpassaging直到获得足够数量的MSC供临床使用。这种异质性仍是一大问题,不仅对获得的生物功能的一般理解msc保持其具备干细胞,增长潜力,衰老,并接受对特定谱系分化特性,还对实现更好的结果在细胞疗法。为了克服这种异质性,我们专注于细胞大小和评估增长率之间的关系和msc的大小。这里,根据小细胞的比例,UCB-MSCs表现出异质性在生长和衰老亚文化。
尽管先前的研究表明,小型人口BM -或UC-MSCs具有增殖能力,分化,延缓衰老
15 - - - - - -
17 ),隔离协议为小细胞并不完全由于良好生产规范要求建立临床试验。在目前的研究中,我们应用一个隔离策略作为一个简单的方法,获得了小细胞和与安全问题方面的优势和产量在大小分离。无菌处理是成功最重要的因素之一的GMP的安全。在这里,我们在一个封闭的系统中使用过滤和离心分离作为一种新的战略,成功地解决以前的污染问题。此外,小型的影响人口从UCB-MSCs干细胞特性以前从未被报道。在这里,我们提供第一个演示这个人口展品增强干细胞特性,相比异构和大型细胞群。有趣的是,我们观察到小型细胞UCB-MSCs更广泛地分化成成骨细胞,增加评估的高山染色,BM-MSCs与先前的报告相一致。塑料的依从性是一个定义良好的特性msc在保持基本的使用培养瓶培养条件。我们的数据表明,小型人口表现出最好的粘附。接下来,我们具备干细胞包括调查
Oct4 和
Nanog ,这些基因的表达是需要保持分化潜力和增长的活动(
30. ,
31日 ]。然而,这些标记细胞大小的影响没有特点。在我们的研究中,水平的
Oct4 和
Nanog 在小型人口相比大大丰富了在异构或大型人口。
小型人口的增长能力显著提高,这些细胞可以延长时期文化比其他人群。临床应用,msc的能力迅速传播文化和细胞的数量
1
×
10
9 细胞是可取的(
32 ),使小型人口在同种异体设置一个有用的模型。此外,小型人群可以扩大超过15通道正常核型(补充图
9 )。广泛的文化扩张后,细胞衰老是一个主要障碍;这主要是描述为增长逮捕和分化能力的损失在msc (
20. ,
32 ,
33 ]。在这项研究中,我们表明,衰老的小型人口低于异构或人口多,建议小型细胞的优越性。此外,SA
β 加染色显示显著降低衰老标记在小型人口的表达式。两个主要的蛋白质、p53和Rb,已经衰老的主要贡献者。当细胞衰老进展,p53蛋白激活转录目标如p21 [
34 ]。Rb维护其磷酸化形式在衰老和E2F结合蛋白家族成员压制他们的转录活动
35 ]。我们之前的数据表明,pho-p53的水平,p16, p21和扩张期间明显增加,而pho-Rb水平下降(
34 ]。这些蛋白质是强烈表达异构和大细胞,但他们在小细胞表达明显降低。在UC-MSCs Majore等人证明了小种群表现出低股价
β 加活动,这表明小型人口可能是成熟的和更大的细胞的前身(
17 ]。
目前,细胞表面蛋白质是使用最广泛的制造商(
36 ,
37 ),不仅是最小的标准来定义msc也作为质量控制指标选择功能msc。此外,大量的研究表明,这些表面抗原基因表达控制各种生物功能的msc包括(
36 ,
37 ]。在这里,我们评估使用流式细胞仪检测细胞表面标记表达式在小型人群。我们确定了五个蛋白质,增加小细胞。基于我们的研究结果,UCB-MSCs的小尺寸是由表皮生长因子受体和CD49f,治疗激活的主要介质,由可拆卸的确认或排序。首先,表皮生长因子(EGF)是一个著名的生长因子/细胞因子结合表皮生长因子受体,和这些机制增加细胞生长和分化而不影响多能性(
38 ,
39 ]。当EGFR趋于减少衰老期间,它是早期的细胞类型中高度表达的调节细胞衰老通过磷酸肌醇3-kinase PI3K信号,这是表皮生长因子受体(下游的主要途径之一
40 - - - - - -
42 ]。我们的研究结果还表明,表皮生长因子受体在小型细胞与生长,分化、衰老。接下来,整合素
α 6 (CD49f)是一种细胞表面抗原,控制多种细胞活动。值得注意的是,据报道,CD49f提高具备干细胞分化潜能和维护通过Oct4的直接监管和Sox2在spheroid-form msc (
43 ]。另一份报告建议CD49f早期祖细胞的标记在培养BM-MSCs;CD49f高 msc被发现比CD49f克隆细胞和分化低 细胞(
44 ]。在胚胎干细胞,CD49f扮演主要角色在最初的依恋的细胞ECM (
45 ,
46 ]。我们证明CD49f具备干细胞介导细胞粘附,并在小型种群分化。综上所述,我们的数据提供了实验证据,EGFR和CD49f都是质量控制指标和预测体积小。
有趣的是,我们的研究结果表明,UCB-MSCs表达EGFR和CD49f msc的水平明显高于其他两个来源。先前的报道表明,在UCB-MSCs CD49f水平高于BM-MSCs [
47 ]。几个报告建议新生儿组织表现出特定的生物属性,不同于msc源自成人来源(
47 ,
48 ]。因此,我们的研究结果表明,从新生儿UCB-MSCs组织通常小于细胞从成人组织。也报道,胎儿msc保持一贯小和多功能即使扩张(
12 ]。
事实上,我们首先显示小UCB-MSCs有利影响导致了更大的提高,不仅改善了干细胞的移植能力但也通过减少在肺气肿肺损伤小鼠模型。血管内的干细胞一直最受欢迎的路线细胞疗法在临床应用
49 ]。MSC移植和移植损伤网站测试之前在一些疾病模型(
50 - - - - - -
52 ]。然而,静脉注射移植细胞的数量仍然很低,即使msc显示,肺气肿模型[有利影响
53 ]。经常报道,大细胞引起严重的血管阻塞在大鼠中风(
54 ]。此外,金等人表明,注射的分布AT-MSCs才发现肺部静脉注射后1天(
55 ]。重要的是,小型人群保持更高的细胞数量较长时间比其他组。在这项研究中,虽然不同种类的细胞提供了部分和防止elastase-induced肺损伤最小
在活的有机体内 、小细胞导致最大的衰减。例如,促进功能的肺小细胞再生,防止受损alveolarization和血管生成。然而,最佳剂量移植成功的临床试验需要解决。大多数报告建议的治疗疗效不同剂量的BM - AT-MSCs (
1
×
10
5
或
5
×
10
5
细胞)进行静脉注射在肺气肿模型(
26 ,
56 - - - - - -
58 ),而我们的研究结果表明一剂
1
×
10
4
小细胞足够的治疗效果。日积月累,我们的研究表明,小型人口是最适合未来的临床使用。曾有一些报道说关于旁分泌作用的msc治疗各种疾病模型,包括肺气肿(
26 - - - - - -
28 ]。先前的报道也支持emphysema-secreted道msc的旁分泌因子,VEGF等和EGF促进机制从弹性蛋白酶肺组织损伤的保护作用[
26 ,
59 ]。在我们的数据中,结果表明,VEGF抗体数组,EGF, TIMP-2, TSP-1,和Decorin由小细胞分泌增加,明显。最近,我们发现Decorin也是关键因素之一的免疫调节msc、修复受损相关肺部通过抑制炎症反应(
60 ]。
在这种背景下,小型的数量变大在一般单层培养细胞扩张。因此,保持这小尺寸已成为一个重要的参数进行进一步的细胞疗法的基础上
在体外 文化的小种群。最近的报告表明,悬浮培养生产规模较小的msc是至关重要的。例如,相对于单层培养的msc、各种方法包括球体形成、聚集,和生物反应器开发维护msc的较小的规模,和这些方法显著提高了治疗潜在的在几个疾病模型(
61年 - - - - - -
63年 ]。进一步的工作需要确定小型人群基于悬浮方法也有实际的细胞治疗的潜力。