人类骨骨髓来源获得msc Corestem Inc .(首尔,韩国) 15]。总之,骨髓是吸气后髂嵴的健康的捐赠者和单核细胞被密度梯度离心法收集。这些细胞被培养在CSMB-A06介质(Corestem Inc .)含10%胎牛血清(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国),2.5毫米 l谷氨酰胺,青霉素和链霉素(WelGene、京畿道、韩国)5%的股份有限公司₂为3 - 5个段落孵化器在37°C。洗不依从细胞后,贴壁细胞保留规范化msc (CD29表型⁺CD44⁺CD73⁺CD105⁺CD90⁺CD34⁻CD45⁻HLA-DR⁻实验中使用的),( 16]。所有人类MSC研究汉阳大学医院的机构审查委员会批准,并依法进行指导方针批准;所有参与者提供书面知情同意。

女性推广 .Fas^lpr老鼠从杰克逊实验室购买(美国马巴尔港)。老鼠被安置在特定的无菌条件21°C和40 - 60%相对湿度下12 h光/暗周期。女性推广 .Fas^lpr小鼠静脉注射与PBS(车辆, n = 6 )或 4 × 10 5 hMSCs /鼠标( n = 6 )一旦12周时 14]。每周存活率和体重检查。每3周血清收集并存储在−70°C到使用。的水平anti-dsDNA免疫球蛋白和总血清中免疫球蛋白测定用ELISA试剂盒购自阿尔法诊断国际(美国圣安东尼奥,德克萨斯州)和eBiosciences(美国圣地亚哥,CA),分别根据制造商的指示。动物研究都是来自韩国忠北国立大学动物实验伦理委员会批准,并按照批准的指导方针。

siRNAs针对鼠标趋化因子是从Bioneer购买(大田、韩国)。使用下面的序列:CCL2(基因库加入数量002982.3 NM), 5 ′ 中联科利注册会计师AGA CUU棉酚CAC UdTdT-3 ′ ,5 ′ 棉酚ACA UCC AAU UCU CAA AdTdT-3 ′ ,5 ′ gcu部件公司治理文化GAG CUA UAG亚美大陆煤层气有限公司AdTdT-3 ′ ;CXCL10(基因库加入数字001565.3 NM), 5 ′ -GGU CAC CAA AUC AGC UGC UdTdT-3 ′ ,5 ′ gag AUC AUU GCU部件ACA AdTdT-3 8月 ′ ,5 ′ 标出棉酚UCA AAC UGC标出UdTdT-3 ′ ;CXCL12(基因库加入数字199168.4 NM), 5 ′ 高斯UCU的煤炭AAA GCC UdTdT-3 8月 ′ ,5 ′ CCA GAG CCA ACG UCA AGC AdTdT-3 ′ ,5 ′ caa CAG ACA AGU的贵港市标出UdTdT-3 ′ 。以下使用负控制siRNA: 5 ′ 情事属实者ACG CCA CCA AUU煤炭UdTdT-3 ′ 。msc与100 nM转染siRNAs使用Lipofectamine RNAiMAX试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国制造商的协议。在37°C细胞孵化有限公司5%₂孵化器48 h ( 17]。

在transwell化验,B细胞(100 μl)被添加到上井transwell板5 μm插入(美国康宁公司那里,MA)。各种趋化因子浓度或msc被添加到600年较低的井 μl (RPMI 1640年完成媒介。B细胞的数量已经迁移到低超过1.5 h数使用流式细胞分析仪( 14]。

延时成像,msc (70 μl ( 0.3 × 10 6 细胞/毫升)被播种到左室和B细胞(70 μl ( 1 × 10 6 细胞/毫升)到正确的culture-insert室 μ菜^35毫米文化菜(ibidi GmbH, Martinsried,德国)。显微镜成像方法进行了BioStation IM-Q配备了10倍放大目标(数值孔径0.5)在一个环境室保持在37°C和5%的公司₂(尼康公司,梅尔维尔,纽约,美国)。菜是preincubated室3 h,然后,插入删除很仔细。图像获得每2分钟12 h ( 18]。

从脾细胞B细胞纯化的推广 .Fas^lpr老鼠负损耗方法使用B细胞隔离设备(Miltenyi研究,赤褐色,CA,美国)。T细胞是纯化使用T细胞隔离设备(Miltenyi研究)。纯度的细胞类型 通常 > 90年 % 。测量B细胞增殖,提纯B细胞( 1 × 10 5 细胞/)和msc ( 0.01 - - - - - - 0.1 × 10 5 细胞/ 96 -孔板)涨跌互现。在一些实验中,msc被培养上,B细胞在低transwell板(康宁)避免接触信息 14]。B细胞被激活与脂多糖(LPS, 1 μg / ml)在0天( 19]。³H-Thymidine (113 Ci / nmol;美国欧宁,波士顿,MA)添加到文化的浓度为1 μCi / 54 h LPS刺激后,使用自动细胞和B细胞收获收割机(Inotech、Dottikon、瑞士)LPS刺激后72 h。的数量³H-thymidine纳入细胞测量使用Wallac Microbeta闪烁计数器(Wallac,图尔库,芬兰)。IgM积累的水平在72 h的培养基是由使用酶联免疫试剂盒(热费希尔科学)。测定T细胞增殖,伴刀豆球蛋白(Con, 1 μg / ml)被用来专门激活T细胞( 19]。T细胞衍生IFN -的水平 γ使用酶联免疫试剂盒测定(Bio-Techne,明尼阿波利斯,美国)。

为西方墨点法,细胞溶解产物如前所述[ 20.]。Detergent-insoluble材料移除,等量的蛋白质10% sds - page和被分级分离转移到纯粹的硝化纤维膜。膜被封锁TBS /渐变20包含5%牛血清白蛋白1 h,然后用一个适当的稀释孵化主要抗体在同一个缓冲2 h。墨迹是孵化与生物素化的二次抗体1 h,然后HRP-conjugated链霉亲和素1 h。增强化学发光信号进行检测(Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。Anti-mouse或反抗体STAT1 phospho-STAT1,被罩,GAPDH从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国)。

rt - pcr,总RNA分离msc使用试剂盒试剂(热费希尔科学)。RNA是量化使用分光光度计和储存在-80°C的浓度为1毫克/毫升。3的互补脱氧核糖核酸合成 μg总RNA使用RT工具包(Bioneer)。PCR用于检查以下mrna的表达水平:cox - 2, TGF - β、被罩、CCL2 CCL3、CCL5 CXCL10, CXCL12 [ 21]。PCR产品1%琼脂糖凝胶上分离和染色0.5 μg / ml溴化乙锭( 21]。

定量PCR进行SYBR绿色主混合(Elpis生物技术。,Daejeon, Korea) in a StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Relative mRNA levels in a sample were based on its threshold cycle in comparison with that of the housekeeping gene β肌动蛋白( 22]。

ELISA, msc培养24 h,文化收集上层清液,铂族元素的浓度₂TGF - βCCL2, CXCL10, CXCL12用ELISA试剂盒测定根据制造商的指示(Bio-Techne)。

给出的数据 的意思是 ± 扫描电镜 至少三个独立 在体外实验进行了一式三份或六个老鼠。确定统计学意义, p 值计算使用单向方差分析(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

我们检查了hMSCs治疗活动的推广 .Fas^lpr老鼠。hMSC-treated小鼠存活至少24周的年龄,这是更长的时间比控制老鼠(图 1(一))。hMSCs并不影响体重(图 1 (b))。的血清水平anti-dsDNA(图 1 (c)(图)和总免疫球蛋白抗体 1 (d)(图)和蛋白尿水平 1 (e)hMSC-treated老鼠)均明显低于对照小鼠。正如所料,免疫抑制剂环磷酰胺,用作积极控制改善疾病(图 1)。总的来说,我们的数据表明,hMSCs改善系统性红斑狼疮在推广的进展 .Fas^lpr老鼠。

我们从推广的肾脏孤立的总RNA。 Fas^lpr老鼠在16周的年龄(hMSC注射后4周或车辆注入)。作为额外的控制,我们孤立肾的总RNA推广。 Fas^lpr老鼠在9周的年龄(hMSC注入之前)。9周的年龄相比,所有细胞因子的表达水平检查了16周和增加减少hMSC注入(图 2)。这些数据表明,hMSCs可能抑制炎性免疫细胞的功能包括T细胞。

检查是否hMSCs直接抑制小鼠T细胞和B细胞,我们建立了一个异种的试验系统coculturing hMSCs和免疫细胞与推广 .Fas^lpr老鼠。hMSCs并不影响的扩散或IgM生产LPS-activated B细胞(图 3(一个))。然而,hMSCs抑制或干扰素-扩散 γ由ConA-activated T细胞(图生产 3 (b))。肾脏的肾表达高水平的炎性细胞因子,包括干扰素- γ,这可能提高msc的抑制能力( 2]。因此,我们hMSCs与干扰素治疗 γ在剂量(数字 3 (c)和 3 (e))和时间依赖方式(数字 3 (d)和 3 (f))。干扰素- γ激活hMSCs (IFN-hMSCs)抑制IgM生产LPS-activated鼠标B细胞(数字 3 (c)和 3 (d))和干扰素- γ生产ConA-activated T细胞(数字 3 (e)和 3 (f))。这些数据表明,天真只hMSCs抑制T细胞干扰素-如果他们被激活 γ,他们可以抑制T细胞和B细胞。

有了更多了解T细胞抑制的机制msc、而对msc在B细胞的影响。因此,我们调查了IFN-hMSCs对老鼠的影响B细胞进行更详细的。评估是否IFN-hMSCs抑制小鼠B细胞可溶性因子——或者contact-dependent方式,我们使用一个transwell化验。当我们添加IFN-hMSCs和鼠标B细胞较低的井,从而使信息接触,IFN-hMSCs强烈抑制IgM由B细胞(图生产 4(一))。当我们添加IFN-hMSCs上部井和鼠标B细胞较低的井,从而防止直接接触信息,抑制较弱(图 4(一))。这些数据暗示IFN-hMSCs抑制小鼠B细胞功能在接触,和可溶性因子依赖礼仪。天真hMSCs表示免疫抑制可溶性因子cyclooxygenase-2 (cox - 2)、铂族元素₂,TGF - β,IFN-hMSCs另外表示被罩(数字 4 (b)- - - - - - 4 (d)),这表明IFN-hMSCs可能使用语言为B细胞抑制。干扰素- γ通过磷酸化的STAT1增加语言表达时间的方式(图 4 (e));STAT1抑制剂氟达拉滨抑制STAT1磷酸化和语言表达(图 4 (f))。的能力IFN-hMSCs转染抑制B细胞被废除的IFN-hMSCs伊多核(图 4 (g))和被罩抑制剂治疗1 mt(图 4 (h)),或氟达拉滨(图 4(我))。这些数据表明,IFN-hMSCs IDO-dependent地抑制小鼠B细胞功能。

接下来,我们研究如何IFN-hMSCs接触鼠标B细胞。IFN-hMSCs坚持菜肴和鼠标B细胞在悬浮生长,表明B细胞可能迁移后向IFN-hMSCs传感IFN-hMSC-derived趋化因子。因此,我们评估的资料IFN-hMSCs表达的趋化因子和趋化因子受体在小鼠B细胞。天真hMSCs表示CCL2 CXCL12和IFN-hMSCs另外CXCL10表达,暗示的潜在作用CXCL10 MSC-B细胞相互作用(数字 5(一个)和 5 (b))。来证明这一假设,我们撞倒了CCL2, CXCL10,或与各自siRNAs CXCL12(图 5 (c))。IFN-hMSCs转染CCL2或CXCL12核,但不是IFN-hMSCs转染CXCL10 siRNA,诱导小鼠B细胞迁移在transwell试验(图 5 (d))。我们进行了成像方法来评估小鼠B细胞迁移对IFN-hMSCs在单细胞水平。我们把IFN-hMSCs成像室和鼠标的左侧右侧B细胞和获得图像每2分钟12 h(补充视频 1)。代表图像和鼠标B细胞的数量通过选择区域(白盒)如图 5 (e)。IFN-hMSCs转染与负控制或CCL2核诱导B细胞迁移,而CXCL10 siRNA-transfected IFN-hMSCs没有(图 5 (e))。总的来说,这些数据表明,IFN-hMSCs吸引老鼠CXCL10-dependent方式contact-dependent抑制B细胞。