SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/5142797 5142797 研究文章 间充质干细胞结合组织融合技术在猪肠道吻合促进伤口愈合 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9878 - 6838 锅 在香港 1 2 林 平马 1 通 看到W。 1 梁 凯文·K。 1 销量 安东尼Y。 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7219 - 5810 Ng 恩德斯K。 1 Siniscalco 达里奥 1 外科学系 医学院 香港中文大学 香港 中国 cuhk.edu.hk 2 普通外科学系 上海国际医院 上海 中国 jiahui.com/en 2020年 12 2 2020年 2020年 05年 08年 2019年 21 11 2019年 10 12 2019年 12 2 2020年 2020年 版权©2020年香港锅等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

客观的。评估可能的生物效应的同种异体的间充质干细胞(msc)结合组织融合技术吻合。 方法。16头猪被分为7 d组和14 d组,每个被进一步细分为一个MSC-treated组和一个对照组。5吻合动物建立了使用LigaSure ForceTriad(美国马Covidien),组织密封系统。细胞迁移和组织分化能力,除了潜在的细胞因子和基因变化,进行调查。 结果。没有明显差异在术后并发症和吻合爆破压力。的数量增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞明显高于MSC-treated组与对照组( P = 0.021 )。标签msc被发现在粘膜层,绒毛,固有层,以及叶片粘膜肌层,他们表现出平滑肌细胞的特征。 结论。移植msc显著促进上皮和结缔组织细胞增殖和维护他们的细胞迁移能力和分化潜力融合吻合的组织,而不造成严重的术后并发症。

 香港中文大学 1。介绍

创新的手术器械的发展导致了重大进展在泌尿、结直肠、妇科和普通外科。自1990年代末以来,组织融合技术导致LigaSure的广泛应用,一个组织密封系统,已被证明是比传统的容器密封方法安全,尤其是对血管< 7毫米的直径( 1- - - - - - 7]。在过去的十年中,外科医生试图用这个密封系统在动物模型和人类临床程序消化肠道密封或吻合 8- - - - - - 15]。不幸的是,这些研究得出任何结论,无论哪种类型的系统或原型设备使用了基于组织融合技术。

在初步研究中,我们评估的可行性和安全组织融合技术在使用LigaSure装置在小肠吻合 在活的有机体内猪模型。我们取得了积极的结果,表明这种方法可以用于增加这种类型的吻合的安全性,没有外国材料的风险。生物技术,特别是那些促进细胞因子的生产,提供了一个有前途的替代伤口愈合由于缺乏金属的主食,胶水或缝合。干细胞的多功能潜力吸引了大量关注,主要研究者和临床医生进行 在体外, 体外, 在活的有机体内实验以及一些临床前试验( 16- - - - - - 22]。在干细胞研究方面,最活跃的领域是内分泌,骨科,神经学、颌面外科。许多这些领域的临床试验已获批准,干细胞研究的很有前景的伤口愈合的影响( 19, 20., 22- - - - - - 30.]。

本研究的目的是评估可能的生物效应的同种异体的间充质干细胞(msc)吻合,与组织融合技术相结合。

 2。材料和方法 2.1。MSC准备

干细胞移植之前,脂肪间充质干细胞(ADMSCs)是从猪的皮下脂肪组织。组织与无菌磷酸盐广泛洗(PBS)和处理0.1%胶原酶(I型;Sigma-Aldrich) PBS为30分钟37°C,温柔的风潮。通过一个100后过滤 μm筛网过滤器移除碎片,滤液清洗三次,悬浮在杜尔贝科修改鹰的媒介,补充10%胎牛血清,青霉素100单位/毫升,100 μ克/毫升的链霉素,2毫米谷酰胺。文化是保持在一个孵化器在湿润的气氛中5%的二氧化碳(图 S1A)。

验证的分化潜能ADMSCs,细胞被播种密度5000细胞/厘米2和培养脂肪形成的、chondrogenic和成骨分化培养基,根据制造商的协议(美国生命科技™表达载体)。分化的脂肪细胞是沾油红O(图 印地),软骨细胞与阿尔新蓝染色(图 就是S1C),和骨细胞染色茜素红S染色(图 S1D)来识别胞浆内脂质、细胞外粘多糖和钙沉积。所有的化学品都购自Sigma-Aldrich公司(美国)。

将培养ADMSCs化学染料后跟踪, 1 × 10 6 dmsc标有5 μL (CM-Dil荧光染料(表达载体)20分钟在孵化器37°C,然后用PBS三次。在1500转离心5分钟后,细胞颗粒在PBS resuspended,随时可以使用。

的ADMSCs种植三到五段,然后用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸收获和特征使用流式细胞分析仪FACScan氩激光器(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。短暂,使胰蛋白酶化细胞被洗,低速离心10分钟 1 × 10 6 细胞被固定在3%多聚甲醛在4°C 30分钟。细胞被贴上phycoerythrin-conjugated抗体CD166 CD13、CD29、CD44、CD105、CD45、CD34 (Abcam Inc .,剑桥,英国)。Isotype-matched负控制被用来评估背景荧光(数字 S1E-S1H)。数据分析使用CellQuest软件(正)。

 2.2。动物和组

十六岁健康猪的重量大约25公斤。动物保健是按照卫生部的指导方针,香港和动物实验动物实验伦理委员会批准的医学院的香港中文大学。

动物们被分成两组:7 d组和14 d组(幸存到7或14 d)。每组又进一步细分为MSC-treated组和对照组(没有MSC治疗)( n = 4 在每个子群)。

 2.3。程序

动物有泻药和手术前禁食24 h。5厘米的剖腹手术切口在上腹部的地区是在全身麻醉下进行气管插管和肌肉放松。创建一个吻合,近端空肠退出了伤口。五个吻合了每个动物,和每个吻合大约是30厘米。建立了吻合使用LigaSure ForceTriad(美国马Covidien),在功能完成端到端格式。LigaSure工作模式设置为2条能量输出和单发射融合根据我们的初步研究结果。

吻合后成立以来,汽车解决方案有或没有msc注入( n = 10 沿着吻合术)等距环,在每侧有五台注射接种的吻合的连接使用胰岛素注射器(美国BD超细™)。每个注入的体积是150 μL,导致MSC-treated集团共有050万个msc。管理注射时,是注意不要穿透肠壁,和所有注射管理尽可能精确的浆膜下层。腹部切口使用连续缝合关闭。所有的动物都收到了镇痛剂来提高舒适的复苏。

 2.4。手术后护理

治疗后,动物们被安置在一个房间里在实验室对3 d观察他们的复苏。观察到的主要参数包括温度、体重变化、精神状态,食物摄入量和排便。静脉注射4毫克/公斤庆大霉素给出2 d参与。如果动物的温度并无迹象表明,减少手术后的第三天,额外的抗生素管理。水被允许从第一天,和半流体的饮食从第二天提供。在第四天观察期结束之前,动物被运送到了一个动物设施在大学校园内,他们消耗正常饮食。

在观察期间,如果动物保健工作人员报告说,动物表现出临床肠漏或腹腔内脓肿的迹象,动物牺牲了。尸检之后进行的调查是不正常的生理状态。

 2.5。样品收集

在观察期结束,动物体重和接受全身麻醉。使用无菌技术Relaparotomy执行。手术部位感染或脓肿,除了腹内的集合或粘连性肠梗阻,腹水,记录。

检查所有吻合。严重的脓肿或致密纤维粘连被认为是泄漏的迹象。每个完整吻合的站点被横切收获5厘米近端和远端吻合。在冰盐水样本孵化,爆破压力评估和记录设备和计算机软件的手持式仪表的数据记录器(版本2.0)。一旦压力数据和破裂位置记录,收集的样本切割microulcers沿着纵轴和检查,在粘膜表面微小脓肿或其他病变。组织样本获得完整吻合在免疫印迹分析液态氮冷冻保存,聚合酶链反应(PCR)数组和石蜡包埋在immune-histological染色使用缓冲福尔马林。样本收集后,所有的动物都被处以安乐死。

 2.6。苏木精和伊红染色和三色染色())

一个吻合的样品从每个动物是石蜡包埋和切割成4 μ每个小组(4米部分吻合的样品)。马森的三色染色协议使用梅尔的苏木精解(向量苏木精QS, h - 3404 - 100)根据常规免疫组织化学过程。主要抗体的浓度增殖细胞核抗原(PCNA) (sc-56、圣克鲁斯生物技术公司,美国)被稀释1:5000年,和CD31 (sc - 1506,圣克鲁斯生物技术,Inc .)、美国)被稀释1:50。PCNA-positive细胞的数量(深棕色)和新成立的船舶(布朗内皮细胞膜)数在200 x视野由两个博士生独立双盲的方式。附近的细胞数在三个不同的领域每个在每个吻合术吻合的结。PCNA,旁边两个上皮区熔合线和一个地区融合区域包括在内。所有三个CD31-counting字段都位于融合区域。

 2.7。Immunofluorescent染色

Immunofluorescent染色的MSC跟踪肠道壁依赖CM-Dil荧光染料,这反映出红色激光。MSC细胞的分化潜能研究使用anti-alpha平滑肌肌动蛋白(1:100;美国Abcam ab5694)和anti-pan细胞角蛋白(1:50;美国Abcam ab7753)。细胞核染色了4,6-diamidino-2-phenylindole(美国生命科技™)。捕捉到的图像的彩色幻灯片莱卡®DM40008LED DFC450C相机和徕卡LAS-AF Lite软件。图像分析ImageJ2x软件(美国国立卫生研究院的韦恩Rasband)。

 2.8。免疫印迹

组织样本保存在液氮是经常处理溶菌产物制备、蛋白质加载,电泳,转移和染色。肌动蛋白作为加载控制。蛋白质的装载体积是30 μg在每个。主要的抗体浓度和接触时间的污点如下:血管内皮生长因子(VEGF;1:300年,3分钟;sc - 507,圣克鲁斯生物技术有限公司,美国),纤维母细胞生长factor-basic (FGF2;1:300年,3分钟;sc - 1360,圣克鲁斯生物技术有限公司,美国),集群分化31日(CD31;1:200年,30岁;sc - 1506,圣克鲁斯生物技术有限公司、美国)和肌动蛋白(1:5000年,2分钟;sc - 1615,圣克鲁斯生物技术有限公司,美国)。所有二级抗体浓度1:2000。 As the molecular weights of VEGF (42 kDa) and actin (43 kDa) were similar, Restore™ Western Blot Stripping Buffer (21059; Thermo Fisher Scientific, Inc., USA) was used for actin blotting, and the washing time in the stripping buffer was 15 min. The blots were scanned and analyzed using software (iBright CL1500 Imaging System; Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The ratio of the target protein to actin in each sample in each group was compared 7 d and 14 d postsurgery.

 2.9。PCR数组

7 d组、6吻合的样本收集从三个MSC-treated动物和三个控制动物。进行RNA提取使用RNeasy FFPE工具包(试剂盒、德国)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸的合成,0.5 μg从吻合的样本中提取RNA的基因组DNA消除混合使用。的混合是在42°C的环境中5分钟,然后在冰上冷却1分钟。逆转录混合然后添加在同等体积的基因组DNA消除混合和孵化15分钟的42°C。孵化的反应是立即停止在95°C 5分钟。

实时使用RT PCR进行2分析器和QuantStudio™12 k Flex系统(美国应用生物系统公司,生活技术)。RT2分析器PCR数组伤口愈合的动物进行了为每个样本一式三份。分析基因表达进行了使用试剂盒提供的在线软件( http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)。每个基因的表达是规范化的看家基因ACTB, B2M, GAPDH HPRT1, RPL13A。信使rna的褶皱变化吻合的组织MSC-treated组使用2(-计算 ΔΔCt)方法。变化的潜在肠道伤口healing-related基因的信号通路和交互分析使用试剂盒软件包( http://gncpro.sabiosciences.com/gncpro/gncpro.php)。

 2.10。统计分析

SPSS统计,版本19.0.0(美国、IBM、纽约Armonk),软件是用于数据分析。的Mann-Whitney U 测试是用来比较组间的差异。学生的 t 以及进行分析PCR结果数组。 P < 0.05的值被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。局部注射msc临床结果没有影响

所有的动物都牺牲在第二剖腹手术结束时观察期间,,只有一个除外。这种动物显示活动水平的降低和明显的消瘦d 9参与,和牺牲在d 10。

表 1显示了术后并发症的动物。高烧被定义为温度高于39°C的3 d参与。消瘦症定义为体重超过5公斤上午牺牲。没有显著区别MSC-treated组和对照组的高烧、消瘦,肠道扩张,肠梗阻,腹水,手术部位感染和便血。

术后并发症的动物。

并发症 7 ds-MSC 7 ds-control 14 ds-MSC 14 ds-control
高烧 3# 2^ / 1
消瘦症 / / 1 ∗ /
肠扩张 1# / / /
肠梗阻 / / 1 ∗ /
腹水 / 1 / /
手术部位感染 / 1^ / /
便血 / / / /
吻合漏 1 1 1 2

∗ 明显的减肥9 d参与,尽管有一些食物摄取和凳子的形成。尸检10 d显示时间均不完全肠梗阻周围粘连造成的第一个上游吻合。#一个动物高烧显示光回肠膨胀,与丰富的空气,以及腹泻。^一种动物发达局部脓肿腹部手术部位。

严重脓肿接近吻合被认为是泄漏的证据,而吻合不严重的粘连或明显脓肿周围吻合的网站被认为是完整的(安全吻合)。泄漏发生在一个吻合动物MSC-treated组和对照组的7 d的计算。在14 d的计算,有两个脓疡的病例对照组MSC-treated组(表和一箱吧 1)。因此,MSC-treated组的泄漏率为5%,对照组为7.5%。

 3.2。局部注射msc并不影响爆破压力

由于生理上的伤口愈合过程,吻合解剖和样本收集7 d组中更加困难,因为循环之间的广泛腹腔粘连的价格相比14 d组。出于同样的原因,分析爆破压力在7 d参与集团更加困难,只有11 19从MSC-treated获得完整吻合的样本组和9 19个样品从对照组的爆破压力评估(图 1(一))。在14 d的计算,15 19完整吻合的样本来自MSC-treated集团18和16个完整样本从对照组(图中获得 1 (b))。由于数据分布,我们用中位数和四分位范围(差)代表爆破压力在每组在不同时间点。7 d的计算,爆破压力是127.60毫米汞柱MSC-treated组(83.90 - -139.80)和134.34毫米汞柱在对照组(48.90 - -170.60)。在14 d的计算、爆破压力是124.60毫米汞柱MSC-treated组(78.00 - -134.80)和107.45毫米汞柱(90.15 - -115.70),对照组(图 1 (c))。的Mann-Whitney U 爆破压力测试显示没有明显的群体间的差异在两个时间点( P = 1.000 和 P = 0.441 分别)。

比较两组之间的破裂压力。(a)破裂压力的完整吻合7 d的计算MSC-treated组( n = 11 )和对照组( n = 9 )。(b)破裂压力的完整吻合14 d计算MSC-treated组( n = 15 )和对照组( n = 16 )。(c)比较两组之间的破裂压力。

 3.3。移植msc促进上皮和结缔组织细胞增殖

)染色和三色染色进行形态学检查吻合的网站的变化。如图所示的结果)染色(100 x),没有明显的形态学差异观察subserosa相邻的吻合的戒指MSC-treated组与对照组相比(图 S2A)。观察总reepithelialization MSC-treated组在对照组但不是7 d的计算。14 d的计算,reepithelialization的程度的吻合的连接在两组相似。在这两个时间点,新血管形成和炎症细胞浸润吻合MSC-treated组和对照组出现类似。

三色染色图像没有显示胶原纤维排列的结构差异,充满了之间的差距的两个横向四肢肌肉层,在两组之间。中结缔组织的纤维占据了主要部分,而持续的完整性吻合的戒指术后2周(数字 开通和 S2C)。

 3.4。移植msc增殖细胞核抗原和CD31表达推广

PCNA-positive细胞的数量和小血管,增殖细胞核抗原、CD31免疫组织化学染色的基础上,分别计算在一个完整的从每个动物(数据吻合的样本 2(一个)- - - - - - 2 (d))。PCNA-positive细胞的数量和小血管MSC-treated组比对照组在7 d和14 d时间点(表 2)。然而,在7 d的计算,只有PCNA-positive细胞的数量明显高于MSC-treated组与对照组( P = 0.021 )(数据 2 (e)和 2 (f))。

增殖细胞核抗原、CD31的群体间的比较。(一)包含IHC CD31的形象(ID PH34 MSC-treated组7 d, 200 x)。(b)包含IHC CD31的形象(ID PH36对照组7 d, 200 x)。(c)包含IHC PCNA的形象(ID PH37 MSC-treated组7 d, 200 x)。(d)包含IHC PCNA的形象(ID PH36对照组7 d, 200 x)。(e)群体间的比较CD31-stained小型船舶的数量( n = 4 )。(f)比较两组之间的PCNA-positive细胞的数量( n = 4 )。

包含IHC染色吻合连接( 的意思是 ± SD )。

7天 14天
控制 MSC 控制 MSC
新船(CD31) 51.85 ± 10.26 69.35 ± 11.62 58.83 ± 18.77 66.08 ± 13.01
PCNA+细胞 226.58 ± 80.55 396.58 ± 76.82 ∗ 129.33 ± 50.30 226.50 ± 68.20

∗ P = 0.021 与对照组(7天)。

 3.5。验证MSC分化细胞迁移能力和潜在的融合吻合的组织

注入的细胞迁移msc被immunofluorescent染色检查。msc被发现在粘膜层,以及绒毛,reepithelialization发生吻合的结(数据相邻 3(一个)和 3 (b))。固有层似乎最遥远的MSC层细胞迁移,CM-Dil荧光dye-marked上皮细胞,应该从注入MSC分化也不见了。Anti-alpha平滑肌肌动蛋白染色透露了一些细胞(标有CM-Dil荧光染料)的薄层粘膜肌层。这些细胞也表现出平滑肌细胞(即的特征。,a positive reaction with antigens), indicating that these smooth muscle cells were differentiated from the injected MSCs (Figures 3 (c)和 3 (d))。

MSC跟踪和分化。(一)跟踪移植msc (50 x)在d 14日。(b)跟踪移植msc (400 x)在d 14日显示的放大视图(a)。(c)分化的平滑肌细胞移植msc (50 x)在d 14日。(d)分化的平滑肌细胞移植msc (400 x) d 14显示的放大视图(c),红色:CM-Dil荧光染料。格林:anti-alpha平滑肌肌动蛋白在潘(a, b)和细胞角蛋白(c, d)。蓝色:4,6-diamidino-2-phenylindole。

 3.6。msc没有影响CD31表达,VEGF和FGF2

三种蛋白质参与伤口愈合过程(即。,CD31,VEGF,和FGF2)were semiquantitatively analyzed using a Western blot. As shown in Table 3,没有显著差异在MSC这些蛋白的表达与对照组7 d和14 d时间点,由Mann-Whitney如图所示 U 测试。每个蛋白质表达变化的趋势吻合的组织图所示 4。

免疫印迹分析三种蛋白质参与伤口愈合的过程( 的意思是 ± SD )。

7天 14天
控制 MSC 控制 MSC ( n = 19 )
CD31 1.328 ± 0.228 1.266 ± 0.175 1.456 ± 0.548 1.610 ± 0.610
VEGF 0.391 ± 0.093 0.436 ± 0.115 0.591 ± 0.146 0.625 ± 0.237
FGF2 0.326 ± 0.154 0.309 ± 0.179 0.570 ± 0.229 0.445 ± 0.356

免疫印迹分析蛋白质参与伤口愈合的过程。(一)CD31表达的变化趋势吻合的组织( n = 4 )。(b) VEGF表达的变化趋势吻合的组织( n = 4 )。(c)的变化趋势吻合的组织(FGF2表达式 n = 4 )。免疫印迹(d)代表图像。

 3.7。msc降低许多伤口Healing-Related基因的表达在吻合的组织

mRNA的概要文件和水平吻合的组织从三个动物MSC-treated组和三个动物对照组测定PCR分析。八十四年关键基因的伤口愈合反应的关键是确定使用RT2分析器PCR数组(图 S3)。这些基因被分成几组,如下所示:(1)细胞外基质(ECM)的结构成分( COL14A1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A3, COL5A2, COL5A3, 宽带运, EDN1, VTN),(2)ECM重塑酶( CTSK, F13A1, FGA, CTSG, PLAUR, F3, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, 平台, PLAU, 身为, SERPINE1),(3)细胞粘附分子( 背景, ITGA2, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGAV, ITGB1, ITGB3, ITGB5, ITGB6, 过渡委员会),(4)细胞骨架监管机构( ACTA2, ACTC1, RAC1, TAGLN),(5)炎性细胞因子和趋化因子( CCL2, CD40LG, CXCL11, CXCL12, CXCL2, IFNG, IL1A, IL10, IL1B, IL2, IL4),(6)生长因子( ANGPT1, CCN2, CSF2, CSF3, 表皮生长因子, FGF2, FGF7, HBEGF, IGF1, LOC100525086, MIF, TGFA, TGFB1, 肿瘤坏死因子, VEGFATGF), (7) β/ BMP信号通路的分子( SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR3)、(8)WNT信号通路的分子( CTNNB1, LOC100627044, WNT5A)、(9)激酶( AKT1, EPHB2, 见过, MYLK, PTEN)、(10)细胞表面受体( 表皮生长因子受体, EPHB2, IL6ST, 见过, TGFBR3),和其他(11)信号转导基因( PTGS2, PTGS1, STAT3)。

在这些感兴趣的84个基因中,只有10基因调节MSC-grafted样本: CD40LG, COL4A3, CXCL11, FGA, IFNG, IL4, CTSG, 身为, ALPL, PTEN。然而,没有统计上显著的群体间的差异在这些基因的表达。相比之下,其他75个基因的表达减少MSC-grafted样品的价格相比控制样本。五个差别的,对这些基因的基因显示统计学意义(图 5)。潜在的信号通路如图 S4。

五感兴趣的基因显示吻合的组织的差别明显对这些MSC-treated集团( n = 3 )的价格相比对照组( n = 3 )。 ∗ P < 0.05 与对照组。

 4所示。讨论

在这项研究中,局部注射同种异体msc的网站tissue-fused吻合不影响临床结果,包括泄漏率和破裂压力。移植msc显著促进上皮和结缔组织细胞增殖。MSC分化细胞迁移能力和潜力融合吻合的组织验证。局部注射外源的msc的差别可能导致对这些无数伤口healing-related基因的表达在吻合口组织7 d后移植。

这是第一个研究调查的愈合能力msc治疗小肠吻合使用电子组织的融合技术 在活的有机体内动物模型。根据我们的初步实验,我们将更好的临床或实验室结果本研究而获得使用简单的组织融合技术( 31日, 32]。鉴于组织愈合过程的性质和研究文献中移植干细胞生存,我们选择7和14 d时间点参与。7 d后,局部注射干细胞的影响,尤其是对破裂压力的吻合,预计将更明显比14 d后粘连。然而,在参与早期(即。,7 d), it may be more difficult to detect stem cell differentiation in the anastomotic site. Clinically, anastomosis leakage occurs most frequently 2 wk postsurgery. Therefore, we observed cell differentiation of grafted stem cells at the end of 14 d.

在先前的研究,采用大鼠模型,移植干细胞的数量在胃切口或结肠吻合范围从1到 10 × 10 6 细胞(0.5)( 33- - - - - - 36]。在一些临床试验,进行干细胞的浓度大约是 1 × 10 7 / 毫升 治疗肠道瘘管与自体msc ( 37- - - - - - 40]。在我们的研究中,050万msc被注入,导致一个可接受的泄漏率在每个动物,其中有5个吻合。考虑到不能验证吻合渗漏在临床情况下,组织融合技术,结合干细胞,提供另一种治疗方法,可以确保吻合安全。

牺牲动物的解剖中吻合,我们无法收集所有吻合样本由于腹腔粘连。完整吻合的爆破压力评估显示两组之间没有显著差异。先前的研究,用猪模型报道破裂压力从10到70毫米汞柱 12- - - - - - 14]。与这些压力相比,这些在我们的研究发现高得多,尤其是在14 d的计算。不和的结果可能是由于普遍的存在粘连在循环中增加抗拉强度。在某些情况下,不仅吻合环的状况,而且周围的粘连吻合影响泄漏的风险。我们推测,猪,当地注入干细胞几乎没有可观测对破裂压力的影响,相对于其他系统性因素,如健康和营养状况。

我们也没有发现明显的差异的体系结构吻合的网站在两组。之间的距离的两个四肢肌肉层和上皮覆盖的过程依赖于接触表面的类别而不是MSC注入。然而,在愈合过程的早期(即。,7 d postsurgery), we detected a significantly higher number of proliferating cells in the MSC-treated group as compared with that in the control group. These actively proliferating cells included epithelial cells and cells of connective tissues, which could be fibroblasts, smooth muscle cells, or endothelial cells of new capillaries. In addition, at both timepoints, higher numbers of PCNA-positive cells and small vessels were observed in the MSC-treated group as compared with those in the control group at both timepoints, although the findings were not statistically significant. From 7 to 14 d, the number of vessels decreased in the MSC-treated group but increased in the control group. In addition, there were larger diameter vessels in the MSC-treated group. Larger vessels are more advantageous for oxygen and nutrition transportation, which is beneficial in the early period of anastomosis healing. These results were verified by the Western blot analysis of CD31, which showed increased CD31 staining in the MSC-treated group as compared with that in the control group. In addition, VEGF expression in anastomotic tissue in the MSC-treated group was higher than that in the control group at both timepoints, although the difference was not statistically significant. This finding was contrary to our hypothesis about the tissue levels of FGF2. This result is difficult to interpret in the absence of information on the role of cytokines in the healing process.

只有少数研究使用 在活的有机体内动物模型提供了证据移植干细胞分化能力。我们的研究证明了短途迁移能力的同种异体msc浆膜下一层黏膜下层。这些细胞无法穿透的小肠平滑肌层墙,唯一可能的路线,他们迁移到黏膜下层的差距两个四肢肌肉层。基于我们的immunofluorescent结果,我们推测,移植的干细胞分化成平滑肌细胞迁移过程。低氧微环境和变性蛋白组件可能有利于干细胞生存和干细胞分化( 41, 42]。在目前的研究中,迁移距离而言,最遥远的干细胞位于轴的绒毛毗邻每个吻合的站点。然而,这些干细胞分化为上皮细胞。应该提到迪勒能从死细胞(泄漏 43];因此,我们需要排除的可能性CM-Dil-marked细胞坏死细胞来源于我们的未来的工作。

作为蛋白表达的基因变化提前发生,获得的样本在两组中的7 d的计算数组用于PCR分析。结果表明,感兴趣的大多数基因的表达减少MSC-treated组的吻合的组织。wound-related基因的表达谱的减少可能是由于增加的部分注入msc或减少内在猪细胞。五个基因,包括 VEGF,表现出明显的褶皱变化,这些基因被认为是功能基因编码的蛋白质参与上皮细胞或血管内皮细胞增殖。大多数纤维母细胞生长factor-encoding基因的表达,如 FGF2是减少了。免疫印迹结果表明蛋白质FGF2与mRNA水平是相一致的,而相反的是VEGF。我们怀疑消极反馈机制在基因转录的过程中可能会抑制mRNA水平响应丰富蛋白质(例如,VEGF)合成。例如,当潜在的信号通路网络如图所示 S4, STAT3和 VEGFA不仅coexpressed还受到反馈抑制白细胞介素6通过信号通路。然而, VEGF似乎也被另外两个强烈的调节基因, SMAD3和 背景。这些发现表明,VEGFA对内皮细胞分化至关重要,与表皮生长通过合作通过TGF STAT3和干细胞分化 β/ SMAD信号通路。

 5。结论

局部注射外源的msc在小肠吻合的网站不影响临床结果,包括吻合渗漏率和爆破压力。移植msc显著促进上皮和结缔组织细胞增殖通过旁分泌的影响吻合的组织,这是使用高频组织融合技术融合。细胞迁移能力和分化潜能的msc融合吻合的组织验证。局部注射外源的msc可能导致许多伤口healing-related基因表达降低吻合口组织7 d后移植,建议需要进一步的调查在术后早期阶段的基因表达。

 数据可用性

在研究过程中生成的数据集分析可从相应的作者合理的请求。

 信息披露

这项研究已经发表在SSAT抽象。

 的利益冲突

没有潜在的冲突与任何个人或组织这方面的研究。

 确认

这项研究是由一个部门研究基金由香港中文大学。

 补充材料

图S1:间充质干细胞的制备。答:附着ADMSCs的形态。b .分化脂肪细胞沾油红o . c .差异化软骨细胞与阿尔新蓝染色。d .分化骨细胞染色茜素红s .情况。细胞标记和流式细胞术ADMSCs的识别。图S2:形态的吻合的网站。a .)染色的形象吻合的网站(对照组,50 x)。B, c的三色染色图像吻合的网站(对照组,分别50 x 400 x)。图S3:大小相关的84个基因肠道MSC和控制组伤口愈合。图S4:潜在的信号通路网络形成的5显著下调基因在这个研究。

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