SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2020/4670948 4670948 研究文章 缺氧沃顿商学院的果冻干细胞在淋巴瘤细胞条件培养基诱导免疫原性细胞死亡 https://orcid.org/0000 - 0003 - 4039 - 1133 林 郝丹尼尔 https://orcid.org/0000 - 0003 - 1286 - 7501 方 Chui-Yee https://orcid.org/0000 - 0002 - 3311 - 2135 Biswas 业务 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5099 - 9006 Bongso 公司 这些后 Stefan 妇产科学系 勇厕所林医学院 国立大学健康系统 新加坡国立大学 新加坡 119228年 nus.edu.sg 2020年 20. 4 2020年 2020年 03 12 2019年 03 03 2020年 16 03 2020年 20. 4 2020年 2020年 版权©2020郝丹尼尔林等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

间充质干细胞从沃顿商学院的果冻人类脐带(hWJSCs)和条件培养液(hWJSC-CM)准备,被证明是杀肿瘤的许多癌症。然而,这些破坏瘤的效果观察hWJSCs生长在常氧条件下21%的氧气在实验室。自氧气浓度在干细胞利基或生理具备干细胞微环境缺氧和帮助保持特性,这项工作的目的是评估是否有差异的杀肿瘤的性质hWJSC-CM增长在21% O2O(常氧)或5%2(缺氧)环境。结果表明,hWJSCs生长在常氧或缺氧条件下没有表现出不同的文化形态差异和保持积极trilineage分化为脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞。缺氧hWJSCs CD105表达间充质干细胞表面标记,CD90、CD73, CD146,和常氧hWJSCs CD108相似,但负面的造血标记CD14、CD19、CD34、CD45、CD117和HLA-DR。缺氧hWJSC-CM产生了明显更大的细胞生存能力和减少细胞凋亡的增加,氧化应激和脂质过氧化作用在人类淋巴瘤细胞与常氧hWJSC-CM相比。缺氧hWJSC-CM也产生了大大增强免疫原性细胞死亡(ICD)的表达特征,如表面束缚calreticulin, HSP70,一半,高机动组绑定1蛋白质和显著减少国防分子CD47和PD-L1的表情。这项研究表明,缺氧hWJSC-CM的杀肿瘤的效果优于常氧hWJSC-CM的首选,应该准备ICD的感应hWJSC-CM淋巴瘤细胞。

 国立大学健康系统 r - 174 - 000 - 155 - 720 1。介绍

原始间充质干细胞的数量都是源自于凝胶状结缔组织基质(沃顿商学院的果冻)人类脐带(hWJSCs) [ 1, 2]。这些hWJSCs源自aorta-gonad-mesonephros最后通过运动来驻留在沃顿商学院的果冻在早期人类发展 3]。他们可以收获大量,可以迅速增殖,并被广泛应用于临床治疗各种各样的疾病,因为他们不会形成肿瘤,有很高的容忍度在移植设置( 4, 5]。

这些hWJSCs拥有杀肿瘤的性质。我们和其他人已经报道,hWJSCs hWJSC-CM减毒或废除各种乳房癌,骨,胆管和膀胱 6- - - - - - 15]。也报道,从老鼠脐带干细胞矩阵诱导废止的乳腺肿瘤的老鼠没有产生的转移瘤内注射( 8]。Unengineered hWJSCs居住的地方,减少肿瘤负荷在人类乳腺癌癌异种移植大鼠静脉注射时( 6]。hWJSCs也停止了乳腺癌细胞的增殖分泌dickkopf和抑制Wnt通路在异种移植小鼠 11]。一些研究小组表明,hWJSC-CM或微泡来自hWJSCs抑制磷酸肌醇3-kinase, Akt,和Wnt / B-catenin信号在胆管或尿路肿瘤细胞,分别停止他们的增长 15, 16]。

hWJSCs也释放许多分子如il - 6所示,引发,MCP-1 [ 17)参与生产抑制癌症细胞和调节免疫应答在异种移植动物模型的癌症 11]。hWJSC-CM已被证明在淋巴瘤细胞诱导免疫原性细胞死亡( 18]。淋巴瘤细胞接受hWJSC-CM进行免疫原性细胞死亡和展出“找到我/吃我”危险分子模式(潮湿)信号,如表面束缚calreticulin (ecto-CRT) ecto-Hsp70 ecto-Hsp90,腺苷酸硫代磷酸盐,HMGB1 PD-L1和CD47差别和对这些 18- - - - - - 20.]。

所有上述研究使用间充质基质或干细胞在常氧条件下生长。然而,它已经表明,氧张力的脐带hWJSCs驻留在1.8%和8%之间(很少超过5%) 21, 22]。氧含量在干细胞龛或脐带的生理微环境发挥了重要作用在维护他们具备干细胞特性。因此,在常氧条件下培养的msc不模仿生理微环境,促进重复的压力,遗传不稳定,衰老和细胞死亡。更关键的是,低氧预处理msc之前政府显示增加治疗潜在的治疗心肌缺血,严重的肢体缺血,创伤性脑损伤和肝再生( 23]。msc在缺氧条件下种植分泌更多的原肌球蛋白和其他蛋白质像endoplasmin前体,膜联蛋白A1, transgelin,核苷二磷酸激酶B促进心脏修复和预防心肌梗死后室性心律失常的感应在鼠模型( 24]。同样,脂肪干细胞(对asc)生长在缺氧条件下再生介质分泌更多的抗炎和il - 6、肿瘤坏死因子、肝细胞生长因子和血管内皮生长因子促进肝再生和功能与常氧对asc [ 25]。

骨髓msc (BM-MSCs)扩大在低氧条件下调节趋化因子受体CXCR4和CX3CR1和能够提高迁移到肿瘤( 26]。同样的研究也表明,缺氧msc更优越的运营商,提供比常氧msc治疗肿瘤的抗癌药物。同样地,另一组也报道,成人脂肪msc(对asc)在缺氧条件下培养更大的能动性和更大的归巢能力件 在体外和 在活的有机体内相比normoxic-cultured hAd-MSCs [ 27]。这两篇论文表明,msc培养接近低氧生理氧张力水平有更高的生存,更好的肿瘤趋向性,当移植到更大的抗癌效果 在活的有机体内动物模型。在此背景下,我们试图比较评估hWJSC-CM的杀肿瘤的影响在人类淋巴瘤细胞的缺氧和常氧条件下生长。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养 2.1.1。人类沃顿的果冻干细胞

人类沃顿商学院的果冻干细胞(hWJSC)行获得人类脐带。书面通知病人同意由病人自己和新加坡卫生部批准机构领域特定审查委员会(DSRB)在这项研究中获得的。hWJSCs DMEM培养hWJSC介质组成的80%,20%胎牛血清(的边后卫)(美国通用电气医疗集团生命科学、犹他州),1%不重要的氨基酸,谷酰胺2毫米,0.1毫米 β巯基乙醇,1% insulin-transferrin-selenium,抗生素/抗真菌的混合物(热科学,罗彻斯特,纽约)和16 ng / ml碱性纤维母细胞生长因子(微孔生物科学,泰梅库拉,CA)。hWJSCs培养在5%的股份有限公司2在常氧(21%啊2)和低氧(10% O2或5%啊2级)使用低氧条件孵化器(Heracell 240 i,热科学)。

 2.1.2。人类淋巴瘤细胞

使用商业载人淋巴瘤细胞株(拉莫斯crl - 1596)(美国类型文化收藏,罗克维尔市,医学博士,美国)的研究是新加坡国立大学的机构审查委员会批准(NUS-IRB)。淋巴瘤细胞株培养在淋巴瘤介质组成的RPMI(热科学)补充10%热灭活的边后卫(HI-FBS)(通用电气医疗集团生命科学)和1%的抗生素/抗真菌的混合物(热科学)。

 2.1.3。人类皮肤成纤维细胞(CCD112sk)

使用商业人类皮肤成纤维细胞(CCD112sk crl - 2429)本研究(写明ATCC)是新加坡国立大学的机构审查委员会批准(NUS-IRB)。皮肤成纤维细胞培养在DMEM-high葡萄糖(热科学)补充10%的边后卫(通用电气医疗集团生命科学),2毫米谷酰胺(热科学),和1%的抗生素/抗真菌的混合物(热科学)。

 2.2。描述常氧和缺氧hWJSCs 2.2.1。塑料粘附的细胞

hWJSCs被种植在常氧(21%啊2)和两个低氧条件(10%或5%2)。这些细胞被监控和成像相衬显微镜(尼康仪器、东京、日本)。

 2.2.2。细胞表面标记

细胞生长在常氧(21%啊2O)和低氧(10%或5%2)条件首先收集使用胰蛋白酶(TrypLE™表达,热科学)为3 - 5分钟37°C公司5%2在空气中,在磷酸盐(PBS)洗,阻止了10%正常山羊血清(上天)(热科学)10分钟,以防止非特异性结合。细胞与小鼠单克隆抗体主要被孵化的一系列CD markers-CD14, CD19, CD24、CD29, CD34, CD40、CD44、CD45、CD49d, CD73, CD90、CD105, CD117, CD140b, CD146, CD271, HLA-DR, CD108-PE (1: 100) (BioLegend,圣地亚哥,CA)——30分钟。其次是孵化与Alexa萤石®488(1:500)山羊anti-mouse二级抗体(热科学)30分钟。细胞在PBS终于洗,resuspended 10%门店,过滤使用40 μ米尼龙过滤器(BD)来删除任何细胞团,和分析使用一个青色™ADP分析仪(贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。

 2.2.3。多功能分化常氧和缺氧hWJSCs

细胞被播种( 10 × 10 4 细胞/盘)成6-well组织培养板和37°C 5%孵化有限公司2大气对24小时允许细胞在常氧和缺氧条件下附件。脂肪形成的分化,中了脂肪形成的诱导培养基含有DMEM(热科学)补充10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,0.01毫克/毫升胰岛素(热科学),1 μM地塞米松(σ),0.5毫米3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)(σ)和0.2毫米indomethacine(σ)。21天的细胞培养,用新鲜媒介变化每周两次。这些细胞被10分钟然后用4%多聚甲醛固定,用PBS冲洗,后缀为60%异丙醇5分钟。这些细胞被沾油红O 5分钟,用蒸馏水冲洗,用苏木精复染色(σ)。

对于成骨分化,介质改为成骨诱导介质包含DMEM培养基(热科学)补充5%的边后卫,0.17毫米L-ascorbic-acid(σ,圣路易斯,密苏里州),100 nM地塞米松,青霉素和链霉素1%,10毫米 β甘油磷酸酯(σ)。21天的细胞培养用新鲜的变化中每周两次。成骨矿化被冯Kossa染色然后评估。简而言之,这些细胞被冲洗PBS和固定在4%多聚甲醛溶液(σ)在室温下10分钟。他们然后用蒸馏水洗净,在1%硝酸银溶液染色(σ)紫外线照射下60分钟。然后细胞复染色有1%核快红(σ)5分钟。

chondrogenic分化,介质改为chondrogenic感应介质包含DMEM培养基(热科学)补充1%青霉素和链霉素,1% insulin-transferrin-selenium(它),0.17毫米L-ascorbic-acid, 100 nM地塞米松,丙酮酸钠1毫米,0.35毫米脯氨酸,10 ng / ml转化生长因子β3 (TGF β3)(σ)。21天的细胞培养用新鲜的变化中每周两次。这些细胞被固定在4%多聚甲醛30分钟,然后沾0.5%阿尔新蓝(σ)30分钟在室温下,用自来水冲洗,然后用0.1%核快红复染色(σ)5分钟。染色细胞随后被可视化并使用亮视场光学成像(尼康仪器)。

 2.3。准备沃顿的果冻干细胞条件培养液(hWJSC-CM)

hWJSC-CM准备根据我们先前描述报告( 9, 10]。短暂,hWJSCs早期段落在hWJSC培养基培养(4 p-6p)首次confluency在常氧和缺氧条件下的70%。无血清培养系统中被替换为基底RPMI介质(擤鼻涕)补充1%谷酰胺和antibiotic-antimycotic混合物(热科学)。48小时后,hWJSC-CM收集,离心,过滤使用0.22 μ过滤器(微孔)和存储在-80°C到进一步的使用。

 2.4。常氧和缺氧暴露hWJSC-CM淋巴瘤细胞

淋巴瘤和其他细胞系(纤维母细胞和hWJSC)最初使用培养条件推荐出版协议,以确保适当的细胞的增长。之后,实际的实验开始之前评估的影响hWJSC-CM或fibroblast-CM细胞株(淋巴瘤和纤维母细胞)都是生长在媒体补充heat-inactivated胎儿血清(HI-FBS)。因此,文化条件标准化。HI-FBS被用于实验的所有实验和控制所有后续化验的细胞系。

拉莫斯淋巴瘤细胞( 1 × 10 5 )暴露在常氧和缺氧hWJSC-CM补充10% HI-FBS(热科学)48小时37°C的5%的股份有限公司2。细胞接受了一系列的评价参数中描述我们的以前发表的文章( 18]。细胞将被检测细胞生存能力(MTT试验),膜联蛋白V / propidium碘(PI)分析、线粒体膜电位,线粒体超氧化物、脂质过氧化、细胞凋亡(还存在3、8和9),CD47, PD-L1表面标记表达式,潮湿和免疫原性细胞死亡(ecto-CRT, ecto-Hsp70 ecto-Hsp90, ATP, HMGB1分泌物)。

 2.5。MTS试验

细胞生存能力分析,MTS试验进行了使用Promega CellTiter 96水一个解细胞增殖试验设备(美国威斯康辛州Promega公司)根据制造商的指示。简单地说,50 μl (MTS试剂添加到各自的拉莫斯淋巴瘤细胞中(500 μ左)和孵化大约4小时37°C公司5%2在空气气氛。使用分光光度计吸光度读数为490 nm ELISA读者被(mQuant;美国BioTek Winooski, VT)。

 2.6。膜联蛋白V / Propidium碘测定

每个实验组样本收集,用PBS,离心机,然后resuspended在500年 μl 1 x膜联蛋白V绑定缓冲(热科学)。细胞被沾染了1 μl的膜联蛋白V-FITC(热科学)和0.5 μl (propidium碘(π,热科学)在室温下15分钟。样本然后用一个40过滤 μ米尼龙过滤器和分析使用一个青色™ADP分析仪(贝克曼库尔特)。

 2.7。半胱天冬酶功能3/7,半胱天冬酶和半胱天冬酶9活动分析

治疗和控制细胞被收集和分析半胱天冬酶3,8日和9日活动使用CellEvent™Caspase-3/7绿色检测试剂,Vybrant®FAM Caspase-8化验用品(热科学)和半胱天冬酶9(主动)FITC染色工具包(Abcam,剑桥,英国)。半胱天冬酶3简要,细胞与500年孵化 μ包含0.125 l的培养基 μl的2.0毫米CellEvent™Caspase-3/7绿色检测试剂37°C 30分钟。半胱天冬酶8,这些细胞被resuspended 300 μ包含10 l的培养基 μ在37°C l 30 x FLICA 60分钟。半胱天冬酶9,细胞与300年孵化 μ包含1 l的培养基 μ在37°C l 30 x FITC-LEHD-FMK 60分钟。染色细胞被洗,过滤40 μm过滤器,并分析使用一个青色™ADP分析仪(贝克曼库尔特)。

 2.8。线粒体膜电位检测(< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id =“M3”> < mml: mi >Δ< / mml: mi > < mml: mi >ψ< / mml: mi > < / mml:数学> < / inline-formula >)

线粒体膜电位( Δ ψ )的治疗和控制细胞收集和分析使用MitoTracker®红色CMXRos工具包(热科学)。简单地说,与500年这些细胞被孵化 μ包含1 l的培养基 μl(1毫米MitoTracker®红色CMXRos原液(热科学)在37°C 30分钟。这些细胞被过滤40 μm过滤器和分析使用一个青色™ADP分析仪(贝克曼库尔特)。

 2.9。线粒体超氧化物测定

治疗和控制细胞被收集和分析线粒体超氧化物使用MitoSOX™红色线粒体超氧化物指标工具包(表达载体)。简单地说,与100年这些细胞被孵化 μ包含0.1 l的培养基 μl(5毫米MitoSOX™解决方案在37°C工作了30分钟。细胞被洗,用40过滤 μm过滤器,并分析使用青色™ADP分析仪(贝克曼库尔特)。

 2.10。脂质过氧化作用分析

治疗和控制细胞被收集并使用图像彩色®脂质过氧化反应设备根据制造商的指示(表达载体)。简单地说,这些细胞被沾染了10毫米图像®脂质过氧化传感器(组件)30分钟37°C。细胞被洗,用40过滤 μm过滤器,并分析使用BD LSRFortessa™分析仪(BD生物科学、海德堡、德国)激发/发射过滤器的581/591和488/510 nm。

 2.11。危险分子模式(潮湿)分析 2.11.1。危险分子模式(抑制):CRT,一半,Hsp70

治疗和控制细胞被收集并阻止10%门店在冰上10分钟。细胞培养的主要反CRT,一半,Hsp70抗体(1:500)(Abcam) 30分钟在冰上其次是次要的山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L) Alexa萤石488抗体(1:500)(热科学)30分钟在黑暗中在冰上。PBS的细胞被洗,resuspended在寒冷的10%的门店,过滤40 μm过滤器,并分析使用一个青色™ADP分析仪(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。

 2.11.2。细胞外ATP浓度

治疗和控制细胞的培养基收集和储存在-80°C。细胞外ATP浓度决定使用一个ATP测定工具包(Abcam)根据制造商的指示。简单地说,50 μl上层清液的治疗和控制武器和50 μ包含45.8 l ATP反应的混合 μl ATP测定缓冲区,0.2 μl ATP探针,2 μl ATP转换器,和2 μl开发人员组合。混合物在室温下孵化了30分钟在黑暗中。在570海里使用分光光度计测量吸光度标(mQuant;美国BioTek Winooski, VT)。

 14。细胞外HMGB1浓度

文化媒体的处理和控制细胞生长被收集并存储在-80°C。细胞外HMGB1的浓度决定使用ELISA测定工具包(Uscn生命科学公司,武汉,中国)根据制造商的指示。简单地说,100年 μl上层清液的治疗和控制武器,加入一定量稀释标准和空白预镀96孔带板为2小时37°C。在100年的液体 μl(检测试剂添加到每个井和孵化为1小时37°C。然后洗井和350 μl 1 x的清洗解决方案3倍和涂抹干燥在吸水纸上。100年 μl检测试剂B被添加和孵化为30分钟37°C。然后洗井和350 μl 1 x 5次洗涤液和涂抹干燥在吸水纸上。90年 μl的衬底的解决方案是添加和孵化为20分钟37°C在黑暗中。最后,50 μl停止解决方案添加到每个好,和HMBG1水平在450海里使用分光光度计测量标(mQuant;美国BioTek Winooski, VT)。

 2.11.4。CD标记分析

治疗和控制细胞收集,与PBS洗一次,离心机,然后用10%的门店冰阻塞10分钟。细胞培养的主要反CD47抗体(1:500)(BioLegend,圣地亚哥,CA)和PD-L1 (CD274)冰(1:500)(BioLegend) 30分钟紧随其后的是二级山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L) Alexa萤石488抗体(1:500)(表达载体)30分钟在黑暗中在冰上。PBS的细胞被洗,resuspended在寒冷的10%的门店,过滤40 μm过滤器,分析与BD LSRFortessa™分析仪(BD生物科学、海德堡、德国)。

 2.12。统计分析

实验的表面标记常氧和缺氧hWJSCs,这样的结果 的意思是 ± 扫描电镜 (%)和单向方差分析与Bonferroni的事后多重比较分析(17.0 v SPSS统计软件包)(SPSS Inc ., IL) 3组之间用于计算任何有统计学意义的差异常氧和缺氧hWJSCs之间的表面标记。其他的实验,结果被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 收集和统计意义之间的控制和hWJSC-CM淋巴瘤细胞缺氧和常氧组是用单向方差分析计算Bonferroni的事后多重比较分析(SPSS统计)4组之间。的 p < 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

 3所示。结果 3.1。hWJSC表面标记分析

MSC CD细胞表面标记分析标记使用流式细胞仪显示缺氧和常氧hWJSCs CD105是积极的,CD90、CD73, CD146, CD108和不表达CD34、CD45、CD14、CD19, CD117和HLA-DR标记(表 1)。光盘表面标记的比例常氧和缺氧hWJSCs之间没有明显不同。

流仪分析hWJSC培养细胞表面标记在21%的氧气,氧气10%,5%的氧气。

表面标记 21%的氧气 10%的氧气 5%的氧气 p 值(单向方差分析)
MSC标记(百分比(%))
CD73 98.66 ± 0.08 98.75 ± 0.10 96.34 ± 0.29 n。
CD90 98.59 ± 0.04 98.44 ± 0.12 94.83 ± 0.14 n。
CD105 95.76 ± 0.06 97.93 ± 0.06 95.43 ± 0.15 n。
CD108 96.46 ± 0.02 96.90 ± 0.01 93.20 ± 0.01 n。
CD146 94.86 ± 0.07 96.42 ± 0.15 95.57 ± 0.10 n。
HSC标记(百分比(%))
CD14 3.02 ± 0.05 2.33 ± 0.09 4.26 ± 0.01 n。
CD19 2.01 ± 0.02 2.15 ± 0.10 3.55 ± 0.12 n。
CD34 1.91 ± 0.01 1.92 ± 0.06 4.39 ± 0.04 n。
CD45 2.35 ± 0.14 2.32 ± 0.15 3.34 ± 0.06 n。
CD117 1.81 ± 0.07 2.39 ± 0.08 2.74 ± 0.06 n。

给出的结果 的意思是 ± 扫描电镜 (%)。n。:不重要。

细胞表面标记物的表达(平均荧光指数)值显示有显著更高的CD105的表达,CD90 CD73, CD146, CD108标记在缺氧hWJSCs(10%啊2和5%啊2)与常氧hWJSCs相比。缺氧hWJSCs(5%啊2)显示CD105的表达水平最高,CD90、CD73, CD146, CD108标记与常氧hWJSCs(21%啊2)和缺氧hWJSCs (10% O2)(表 2)。有一个更高的表达CD34标记在缺氧hWJSCs(5%啊2)与常氧hWJSCs相比(21% O2)和缺氧hWJSCs (10% O2)。有一个更高的表达CD117在缺氧hWJSCs(10%啊2)与常氧hWJSCs相比(21% O2)和缺氧hWJSCs (5% O2)(表 2)。

流仪分析hWJSC细胞表面标记物表达水平(MFI)培养在21%的氧气,氧气10%,5%的氧气。

表面标记 21%的氧气 10%的氧气 5%的氧气 p 值(单向方差分析)
MSC标记表达式(MFI)
CD73 90.33 ± 0.16 105.46 ± 1.22 162.36 ± 0.49 p < 0.05 (21%比10%比5%)
CD90 103.23 ± 1.32 186.90 ± 1.16 313.82 ± 1.57 p < 0.05 (21%比10%比5%)
CD105 17.32 ± 0.46 35.35 ± 0.05 58.59 ± 0.48 p < 0.05 (21%比10%比5%)
CD108 81.29 ± 0.24 74.35 ± 0.57 188.28 ± 1.18 p < 0.05 (21%比10%比5%)
CD146 44.86 ± 5.02 E − 15 63.09 ± 0.11 130.16 ± 0.19 p < 0.05 (21%比10%比5%)
HSC标记表达式(MFI)
CD14 4.26 ± 1.014 4.66 ± 0.25 4.64 ± 0.12 n。
CD19 3.14 ± 0.27 3.46 ± 0.01 4.29 ± 0.17 n。
CD34 3.91 ± 0.46 3.46 ± 0.01 8.42 ± 0.27 p < 0.05 (21%比5%)
CD45 2.72 ± 0.26 4.49 ± 0.57 3.57 ± 0.21 n。
CD117 3.21 ± 0.02 4.32 ± 0.13 3.84 ± 0.06 p < 0.05 (21%比10%)

结果被表示为 的意思是 ± 扫描电镜 (%)。n。:不重要。

 3.2。淋巴瘤细胞的异常,与常氧或缺氧hWJSC-CM治疗

淋巴瘤细胞暴露于低氧和常氧hWJSC-CM 48小时显示显著减少细胞的异常而控制。缺氧hWJSC-CM(5%啊2)诱导细胞生存能力,最大的减少和细胞的可行性缺氧hWJSC-CM(5%啊2)明显低于常氧hWJSC-CM(21%啊2)和缺氧hWJSC-CM (10% O2)(图 1(一))。褶皱的变化在细胞的异常控制hWJSC-CM(21%相比O2): 0.88 ± 0.02 ,hWJSC-CM (10% O2): 0.84 ± 0.05 ,hWJSC-CM (5% O2): 0.71 ± 0.03 。没有明显差异在细胞的异常正常皮肤成纤维细胞暴露在常氧或缺氧hWJSC-CM 48 h(图 1 (b))。褶皱的变化在细胞的异常控制hWJSC-CM(21%相比O2): 1.00 ± 0.02 ,hWJSC-CM (10% O2): 1.00 ± 0.03 ,hWJSC-CM (5% O2): 1.00 ± 0.03 (图 1 (b))。淋巴瘤细胞暴露于低氧和常氧fibroblast-CM 48 h增加细胞的异常与控制。褶皱的变化在细胞的异常控制fibroblast-CM(21%相比O2): 1.22 ± 0.007 和fibroblast-CM (5% O2): 1.24 ± 0.001 (图 1 (c))。

人类淋巴瘤细胞生存能力(MTS试验)和控制CCD112sk细胞暴露在常氧和缺氧hWJSC-CM 48 h。(一)注意在治疗后显著降低细胞淋巴瘤细胞的可行性与常氧或缺氧hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示的最大减少淋巴瘤细胞的可行性。(b)注意无显著变化的细胞生存能力控制细胞(皮肤成纤维细胞,CCD112sk)与hWJSC-CM治疗后。(c)注意在治疗后显著增加细胞淋巴瘤细胞的可行性与常氧或缺氧fibroblast-CM比控制。所有的值表示为 的意思是 ± 扫描电镜 3生物样品每个样品3复制。 ∗ p < 0.05 。

 3.3。细胞凋亡与常氧或缺氧hWJSC-CM增加

淋巴瘤细胞的膜联蛋白V /π试验治疗与常氧和缺氧hWJSC-CM增加的百分比(AV +π-)和后期(AV) +π+细胞凋亡细胞在控制。缺氧hWJSC-CM (5% O2)生产的百分比明显高于早期和晚期凋亡细胞与常氧hWJSC-CM(21%啊2)和hWJSC-CM (10% O2)。价值观hWJSC-CM (21% O2): 13.0 ± 0.02 % ,hWJSC-CM (10% O2): 16.6 ± 0.87 % ,hWJSC-CM (5% O2): 18.9 ± 0.54 % 和控制: 8.60 ± 0.09 % 。晚期凋亡细胞的百分比hWJSC-CM (21% O2): 19.9 ± 0.31 % ,hWJSC-CM (10% O2): 17.6 ± 0.80 % ,hWJSC-CM (5% O2): 24.8 ± 0.22 % 和控制: 11.7 ± 0.47 % (图 2(一个))。

(一)凋亡测定(点图)淋巴瘤细胞治疗后常氧和缺氧hWJSC-CM。注意显著增加的百分比AV +π-和AV +π+淋巴瘤细胞治疗后与hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示比例最高的AV +π-和AV +π+细胞。(b, c)流式细胞术点阴谋和半胱天冬酶活性百分比增加半胱天冬酶3,和半胱天冬酶9半胱天冬酶8日活动在淋巴瘤细胞治疗hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示所有半胱天冬酶活动的最高增加淋巴瘤细胞。所有的值表示为 的意思是 ± 扫描电镜 3生物样品每个样品3复制。 ∗ p < 0.05 。

激活半胱天冬酶3、半胱天冬酶8和9半胱天冬酶的活动进行评估使用流式细胞仪(图 2 (b))。显著的激活半胱天冬酶3,半胱天冬酶8,半胱天冬酶9活动观察淋巴瘤细胞相比控制治疗48 h后缺氧和常氧hWJSC-CM。缺氧hWJSC-CM (5% O2)明显地诱导半胱天冬酶活动的大大提高与常氧hWJSC-CM(21%啊2)和hWJSC-CM (10% O2)(图 2 (c))。淋巴瘤细胞的百分比)阳性激活半胱天冬酶3 hWJSC-CM (21% O2): 41.7 ± 1.00 % ,hWJSC-CM (10% O2): 41.17 ± 0.68 ,hWJSC-CM (5% O2): 57.5 ± 0.26 % 和控制: 15.6 ± 0.40 % 。淋巴瘤细胞的百分比,激活半胱天冬酶阳性8活动是hWJSC-CM(21%啊2): 32.9 ± 1.15 % ,hWJSC-CM (10% O2): 31.8 ± 0.64 % ,hWJSC-CM (5% O2): 46.2 ± 1.19 % 和控制: 14.8 ± 0.56 % 。淋巴瘤细胞的百分比)阳性激活半胱天冬酶9活动是hWJSC-CM(21%啊2): 27.8 ± 1.37 % ,hWJSC-CM (10% O2): 26.0 ± 1.08 % ,hWJSC-CM (5% O2): 36.3 ± 0.9 % 和控制: 13.8 ± 0.50 % 。

 3.4。线粒体超氧化物、线粒体膜电位和淋巴瘤细胞的脂质过氧化作用在常氧或缺氧hWJSC-CM对待

淋巴瘤细胞暴露在常氧和缺氧hWJSC-CM显示,阳性细胞数量显著增加线粒体超氧化物(MitoSOX)比控制。缺氧hWJSC-CM (5% O2)诱导显著更大数量的增加细胞阳性MitoSOX相比常氧hWJSC-CM(21%啊2)和缺氧hWJSC-CM (10% O2)。细胞的百分比阳性MitoSOX hWJSC-CM (21% O2): 18.3 ± 0.09 % ,hWJSC-CM (10% O2): 19.6 ± 0.05 % ,hWJSC-CM (5% O2): 22.9 ± 0.06 % 和控制: 14.4 ± 0.26 % 。的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的MitoSOX hWJSC-CM(21%啊2): 56.1 ± 1.41 ,hWJSC-CM (10% O2): 59.1 ± 1.00 ,hWJSC-CM (5% O2): 78.94 ± 0.95 和控制: 42.5 ± 0.5 (图 3(一个))。

淋巴瘤细胞的线粒体应激试验治疗后常氧和缺氧hWJSC-CM。(一)注意显著增加线粒体超氧化物的淋巴瘤细胞水平治疗后与hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示最高的淋巴瘤线粒体超氧化物浓度的增加。(b)注意显著降低线粒体膜电位的淋巴瘤细胞治疗后与hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示最高的线粒体膜电位下降。(c)注意显著增加在淋巴瘤细胞的脂质过氧化水平治疗后与hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示最高的脂质过氧化反应的增加。所有的值表示为 的意思是 ± 扫描电镜 3生物样品每个样品3复制。 ∗ p < 0.05 。

无论淋巴瘤细胞暴露于含氧量正常或低氧hWJSC-CM显示显著降低线粒体膜电位(CMXRos)比控制。缺氧hWJSC-CM (5% O2)诱导显著更大的降低线粒体膜电位与常氧hWJSC-CM(21%啊2)和缺氧hWJSC-CM (10% O2)。细胞的百分比阳性CMXRos hWJSC-CM (21% O2): 78.3 ± 0.40 % ,hWJSC-CM (10% O2): 79.3 ± 0.19 % ,hWJSC-CM (5% O2): 68.2 ± 0.05 % 和控制: 80.6 ± 0.02 % 。的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的CMXRos hWJSC-CM(21%啊2): 2050.8 ± 42.2 ,hWJSC-CM (10% O2): 2290.0 ± 44.6 ,hWJSC-CM (5% O2): 2225.5 ± 27.6 和控制: 2355.3 ± 22.1 (图 3 (b))。

淋巴瘤细胞治疗与常氧或缺氧hWJSC-CM褶皱变化显示明显的增加脂质过氧化与控制。缺氧hWJSC-CM (5% O2诱导更高的褶皱增加脂质过氧化与常氧hWJSC-CM(21%相比O2)和缺氧hWJSC-CM (10% O2)。脂质过氧化的褶皱变化而控制hWJSC-CM(21%啊2): 1。2 ± 0.03 ,hWJSC-CM (10% O2): 1.47 ± 0.02 ,hWJSC-CM (5% O2): 1.89 ± 0.03 (图 3 (c))。

 3.5。CRT, Hsp70,一半,CD47, PD-L1表达式与常氧或缺氧hWJSC-CM淋巴瘤细胞治疗

的表达有显著增加表面绑定ecto-CRT ecto-Hsp70, ecto-Hsp90淋巴瘤细胞治疗与常氧或缺氧hWJSC-CM比控制。缺氧hWJSC-CM (5% O2)诱导表达的增加将大大增强表面CRT, Hsp70,一半与常氧hWJSC-CM(21%啊2)和缺氧hWJSC-CM (10% O2)。的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的ecto-CRT hWJSC-CM(21%啊2): 31.0 ± 0.3 ,hWJSC-CM (10% O2): 33.8 ± 1.34 ,hWJSC-CM (5% O2): 54.8 ± 1.71 和控制: 20.2 ± 0.78 (图 4(一))。

淋巴瘤细胞的免疫原性细胞死亡分析治疗后常氧和缺氧hWJSC-CM。(a - c)注意ecto-CRT显著升高,ecto-Hsp70, ecto-Hsp90表达与缺氧治疗后5%的氧气hWJSC-CM比控制。(d, e)注意显著降低CD47和PD-L1表情在淋巴瘤细胞治疗后与hWJSC-CM比控制。治疗hWJSC-CM收集5%的氧气条件下显示,最高及最低的“找到我/吃我”和“不要吃我”的信号在淋巴瘤细胞,分别。所有的值表示为 的意思是 ± 扫描电镜 3生物样品每个样品3复制。 ∗ p < 0.05 。

的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的ecto-Hsp70 hWJSC-CM(21%啊2): 9.01 ± 0.21 ,hWJSC-CM (10% O2): 8.8 ± 0.70 ,hWJSC-CM (5% O2): 9.6 ± 0.21 和控制: 10.5 ± 0.30 (图 4 (b))。的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的ecto-Hsp90 hWJSC-CM(21%啊2): 14.2 ± 0.21 ,hWJSC-CM (10% O2): 16.4 ± 0.46 ,hWJSC-CM (5% O2): 20.7 ± 0.3 和控制: 13.2 ± 0.16 (图 4 (c))。

结果表明,有显著减少CD47表达淋巴瘤细胞暴露在常氧或缺氧hWJSC-CM相比控制。缺氧hWJSC-CM收集在10%或5%的氧气水平诱导显著更大增加CD47表达式与常氧hWJSC-CM(21%啊2)。没有明显差异在CD47表达式之间的10%和5%低氧hWJSC-CM-treated淋巴瘤细胞。的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的CD47 hWJSC-CM(21%啊2): 98.4 ± 1.07 ,hWJSC-CM (10% O2): 89.0 ± 0.38 ,hWJSC-CM (5% O2): 90.3 ± 0.92 和控制: 117.4 ± 0.11 (图 4 (d))。

结果表明,有显著减少PD-L1表达淋巴瘤细胞暴露在常氧或缺氧hWJSC-CM相比控制。缺氧hWJSC-CM (5% O2)诱导显著更大的减少PD-L1表达式与常氧hWJSC-CM(21%啊2)和缺氧hWJSC-CM (10% O2)。的 的意思是 ± 扫描电镜 荧光强度的PD-L1 hWJSC-CM(21%啊2): 33.2 ± 0.48 ,hWJSC-CM (10% O2): 32.8 ± 1.10 ,hWJSC-CM (5% O2): 27.4 ± 0.61 和控制: 37.5 ± 1.31 (图 4 (e))。

 3.6。淋巴瘤细胞ATP和HMGB1含量与常氧或缺氧hWJSC-CM治疗

结果表明,细胞外ATP水平没有明显差异与常氧hWJSC-CM淋巴瘤细胞治疗后(21%啊2)或缺氧hWJSC-CM(10%啊2和5%啊2)控制。平均光密度读数测量在570 nm ATP水平hWJSC-CM(21%啊2): 0.08 ± 0.001 ,hWJSC-CM (10% O2): 0.07 ± 0.004 ,hWJSC-CM (5% O2): 0.08 ± 0.001 和控制: 0.07 ± 0.004 (图 5(一个))。

分泌治疗后ATP和HMGB1的淋巴瘤细胞水平与常氧和缺氧hWJSC-CM。(a)注意细胞外ATP水平无显著差异在淋巴瘤细胞治疗后与常氧和缺氧hWJSC-CM比控制。(b)注意水平明显高于细胞外HMGB1在淋巴瘤细胞治疗后与常氧和缺氧5%的氧气hWJSC-CM比控制。所有的值表示为 的意思是 ± 扫描电镜 3生物样品每个样品3复制。 ∗ p < 0.05 。

结果表明,在细胞外HMGB1含量有显著增加淋巴瘤细胞接触后常氧hWJSC-CM(21%啊2)或缺氧hWJSC-CM(5%啊2)控制。然而,没有明显的观察到细胞外HMGB1水平差异常氧hWJSC-CM(21%啊2)和缺氧hWJSC-CM (5% o2)。平均光密度读数测量在450 nm HMGB1含量hWJSC-CM(21%啊2): 0.28 ± 0.002 ,hWJSC-CM (10% O2): 0.24 ± 0.02 ,hWJSC-CM (5% O2): 0.27 ± 0.005 和控制: 0.22 ± 0.003 (图 5 (b))。

 4所示。讨论

人类脐带提供胎儿营养母婴的传播。intervascular沃顿的果冻的凝胶状的性质有助于防止窒息的脐带血管切断胎儿的营养供应。此外,独特的杀肿瘤的干细胞躺在沃顿商学院的果冻的属性(hWJSCs)帮助吞噬和销毁任何癌症细胞,胎儿从母亲迁移到这样解释了为什么癌症的胎儿在母亲怀孕和极低的疾病与各种癌( 28- - - - - - 33]。

hWJSCs拥有所有善意的msc的特点( 34),但与骨髓msc、他们不形成癌症相关成纤维细胞在肿瘤环境 35- - - - - - 37]。hWJSCs也不诱导肿瘤发生和毒性的实验动物模型,猕猴猴,在临床试验中,这表明他们在临床使用时安全性设置 5, 38]。几乎所有这些临床前和临床试验中研究迄今为止,hWJSCs保持在常氧条件下培养而不是他们的生理氧张力的5%及以下水平。因此重要的是要评估是否积极破坏瘤的结果到目前为止与hWJSCs生长在常氧条件下能保持或上级时生理缺氧条件下发展和应用。

msc一般包括hWJSCs通过氧条件从他们的两个不同阶段 在活的有机体内收集,推导 在体外和回 在活的有机体内移植。文化传统,在大多数情况下,干细胞通常暴露于高氧浓度在他们 在体外操纵相比时浓度要低得多 在活的有机体内。氧气具备干细胞是至关重要的维持、扩大增长和分化的干细胞通过调节低氧诱导因子- 1 - (HIF1-a)相关的基因表达。干细胞在更高的文化比低浓度氧浓度在自然环境导致环境压力,早期细胞老化,经济增长放缓,染色质损害导致可怜的移植和临床效果不佳 39]。

培养hWJSCs高氧浓度也可能有类似的不利影响。我们观察到在当下研究hWJSCs培养在缺氧条件下显示出类似的细胞形态和可以接受trilineage分化为脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞像常氧hWJSC-CM(补充图 1)。同时,hWJSCs生长在缺氧条件下(10%或5%)仍阳性MSC CD105标记,CD90、CD73, CD146, CD108,这些标记的表达水平明显高于常氧hWJSCs。我们的研究结果支持其他组没有变化的表型标记在缺氧或常氧条件下培养 40, 41]。

虽然我们的研究结果表明,常氧和缺氧hWJSC-CM诱导显著减少淋巴瘤细胞生存能力和显示凋亡细胞的数量增加,暴露于低氧hWJSC-CM (5% O2)最大的细胞生存和凋亡细胞数量减少。这些杀肿瘤的效应是一致的与先前发表研究缺氧WJSC-CM表现出更强的衰减宫颈细胞生长、肝癌、前列腺癌、卵巢癌与常氧WJSC-CM [ 40, 41]。我们还观察到治疗淋巴瘤细胞缺氧hWJSC-CM最高的氧化应激诱导线粒体和脂质过氧化的最高水平与常氧hWJSC-CM相比。“找到我的演讲/吃我”危险分子模式(潮湿)分子和减少表达式“别吃我”的信号(PD-L1和CD47)在癌细胞引发宿主细胞免疫反应,达到完全缓解( 19, 20.]。有越来越多的证据表明,抗癌药物,通过免疫原性细胞死亡可能会刺激肿瘤特异性反应提高了疗效和长期治疗成功( 42]。同样,策略阻止CD47和PD-L1表情对癌症细胞的巨大的兴趣可增强抗肿瘤应答( 19, 43]。我们的研究表明,治疗缺氧hWJSC-CM在5%的氧气紧张局势的最大upregulation抑制如ecto-CRT ecto-Hsp70, hsp - 90, HMGB1的差别,对这些CD47, PD-L1。我们假设培养hWJSCs hWJSC-CM集合在常氧和10%低氧条件下不会产生各种类型的差异因素hWJSC-CM检查参与组成分泌腺()。因此,我们没有看到显著差异之间的抗癌效果常氧hWJSC-CM hWJSC-CM和10%氧气。抗癌效果的差异观察当我们培养hWJSCs收集hWJSC-CM 5%低氧条件。这符合文献表明生理脐带中氧含量约为5%(2%至8%)。

结果表明,使用5%低氧hWJSC-CM将引起更大的抗肿瘤免疫反应相比hWJSC-CM典型的文化常氧条件下做好准备。

hWJSC-CM准备杀肿瘤的效应的增加可能是由于缺氧条件下的表达和分泌增加抗癌分子或微泡/液比hWJSC-CM常氧条件下准备。表达HIF1-a之前也证明是调节在缺氧条件下,反过来调节许多下游工序具备干细胞和分化的干细胞( 39]。我们以前报道,hWJSC-CM包含的水平明显高于白细胞介素和粘附分子像IL-1a, il - 6,引发,HGF,自洽场,MCP-1调节癌症细胞死亡和调节免疫系统 17]。我们还报道,hWJSCs高度microrna的表达- 146 a和microrna - 126这一目标先天和适应性免疫系统 44]。microrna的表达- 146 a和microrna - 126据报道激活T细胞免疫或预防各种癌症细胞的生长 45- - - - - - 53]。进一步的研究旨在比较评估缺氧和常氧检查参与组成分泌腺hWJSC-CM HIF1-a通路将提供进一步的见解不同分子参与了杀肿瘤的增加和免疫原性细胞死亡特征观察与缺氧hWJSC-CM最终可以和测试的单一或混合破坏瘤的效果。

尽管本研究评估hWJSCs的破坏瘤的差异影响不同氧气浓度下培养,缺乏信息暴露hWJSCs大气氧气浓度在隔离或推导过程。已经证明短暂暴露于环境氧浓度在收集和隔离迅速和不可逆转的改变新陈代谢脐带血造血干细胞或祖细胞(HSC / HPC) ( 54]。细胞接受额外的生理氧气冲击/压力(EPHOSS)生产环境air-induced线粒体ROS,发起的线粒体通透性转换孔( 55]。收集、处理和培养HSC /手持电脑在缺氧条件下提高了收集和长期重新繁衍肝星状细胞的增殖。然而,收集和处理低氧紧张是一个巨大的后勤问题,既笨重又昂贵。增加环孢菌素A, fda批准的药物,在脐带血的采集和处理可以减轻EPHOSS的影响通过模拟低氧浓度的影响( 54]。EPHOSS效应的大多数研究都是在肝星状细胞/手持电脑 54),有信息在EPHOSS msc和hWJSCs有限。需要更多的研究来评估hWJSCs的新陈代谢受到EPHOSS和环孢菌素的添加到流程能否产生hWJSCs较高的治疗潜力。

 5。结论

我们的研究结果表明,缺氧hWJSC-CM诱发更大的杀肿瘤的反应通过抑制启动抗肿瘤免疫的表示。缺氧hWJSC-CM也可以抑制防御分子表达淋巴瘤细胞,它可以使淋巴瘤细胞更倾向于宿主的免疫反应以达到完全缓解。虽然常氧和缺氧hWJSC-CM前景巨大的恶性肿瘤,缺氧hWJSC-CM应该是代理的选择,因为它更大的破坏瘤的效果。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

所有作者宣称他们没有利益冲突。

 确认

作者感谢茉莉女士通用电气对她的帮助。这项研究支持的新加坡国立大学卫生系统(nuh)愿望基金(新概念)授予(r - 174 - 000 - 155 - 720)和妇产科音高nuh部门基金(PFFR)轮(2015)。

 补充材料

形态和trilineage分化hWJSCs培养在常氧(21%啊2)和低氧(10%或5%)条件。(一)hWJSCs塑料附着细菌培养在常氧和缺氧条件下并没有显示出明显的形态学差异。(B)常氧和缺氧hWJSCs分化成脂肪细胞脂肪形成分化培养基后21天。常氧和缺氧hWJSCs展出脂滴油红O染色。(C)常氧和缺氧hWJSCs分化为骨细胞成骨分化培养基后21天。常氧和缺氧hWJSCs展出钙沉积与冯Kossa染色。(D)常氧和缺氧hWJSCs分化成软骨细胞在chondrogenic分化培养基后21天。常氧和缺氧hWJSCs展出与阿尔新蓝染色粘多糖。

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