1。介绍
肥胖的定义是身体质量指数(BMI)、计算(
重量
公斤
/
嗨!
t
2
米
,30或以上
1 ]。这个条件可以成熟脂肪细胞的增生和肥大的结果和他们的祖基质/干细胞脂肪组织内仓库(
1 ]。根据疾病控制中心的,过去的三十年见证了大量增加肥胖的发病率和频率在美国水平的> 35%存在在一些州(
http://www.cdc.gov/obesity/data )。而其他一些国家的方法这种程度的肥胖,许多经历惊人的增加是由于饮食上的变化,运动,和生活方式。因为肥胖伴有并发症包括心血管疾病、2型糖尿病、代谢综合征,和非酒精性脂肪肝疾病,国际科学界已经把他的注意力集中在机制促进肥胖的预防和治疗
1 ]。体外模型采用preadipocyte细胞系,如3 t3-l1,或主要脂肪基质干细胞(ASC)源自啮齿动物或人类脂肪组织(
2 - - - - - -
4 ]。在一到两周的时间内,这些文化经历强劲的脂肪生成反应归纳鸡尾酒含糖皮质激素和过氧物酶体proliferator-activated受体
γ (PPAR
γ )配体、磷酸二酯酶抑制剂提升环腺苷酸水平,和胰岛素。然而,最近的一次全面的学术评审已得出结论,迫切需要提高模型preadipocyte为了提高肥胖研究的发现与脂肪细胞生物学和功能障碍(
5 ]。
虽然大多数的
在体外 研究采用二维(2 d)格式,这种结构性方法不能模拟本地三维(3 d)微环境。成熟脂肪细胞体内四周被一个生物力学支持细胞外基质(ECM)和显示一个经典“图章戒指”形态,表现为一个单房的脂质空泡占据整个胞质空间与一个古怪的细胞核。相比之下,在2 d文化中脂肪细胞
在体外 显示多腔的脂质空泡周围分散在细胞质中集中位于细胞核。形态差异似乎与功能的差异。例如,当人类ASC维护3 d球状体
在体外 ,他们adipokine分泌一个数量级大于同等数量的ASC在2 d文化
6 ]。
增加关注“器官芯片”技术促进了先进的三维培养方法对脂肪组织和细胞(
7 - - - - - -
10 ]。这些方法结合小鼠细胞系(3 t3-l1)或与生物材料支架主要鼠科动物或人类ASC来自透明质酸或丝绸创建
在体外 或
在活的有机体内 microphysiological系统模拟白色或米色/褐色脂肪组织(
7 - - - - - -
10 ]。在最近的一份报告中,刘等人形容人类脂肪组织的方法来维护“瓦特”或“夹白色脂肪组织”文化
11 ]。完整的片段的脂肪组织维持8周
在体外 人工培养的ASC作为主要瀑样表之间的文化(
11 ]。这种方法有一个主要的病理生理和药理价值调查人类脂肪组织。然而,它需要直接与研究型塑料或一般的外科医生和一个合作机构审查委员会批准的协议。为实验室位于校园没有医学院或研究医院,这些限制可能使斯瓦特方法不切实际。因此,当前的研究是开展提供这部分的另一个3 d人体脂肪模型研究的社区。
这手稿描述了一个方法采用低温贮藏的主要人类间质血管分数(SVF)细胞和人类血液product-derived生物支架来创建一个xenoprotein-free 3 d脂肪仓库
在体外 适合调查人类脂肪生物学。建立了构造使用低温贮藏人类SVF细胞含有异构可行的细胞各亚群的代表个人捐赠人口。由此产生的脂肪结构自组装成球状体一周内文化不需要费力或昂贵的协议和已相对于2 d文化基于流式细胞术,共焦和低温电子显微镜/免疫荧光,体内的行为,和功能化验(adipokine分泌,葡萄糖吸收,和脂解作用)。
2。材料和方法
2.1。一般
除非另外注明,所有材料都是来自热费希尔科学及其附属公司或从LaCell LLC。人类lipoaspirate标本被健康个体捐赠择期抽脂以书面知情同意在协议审查和批准的西方机构审查委员会(WIRB Puyallup WA) (IRB跟踪# 20130449)。
2.2。间质血管分数(SVF)细胞隔离
人类SVF细胞lipoaspirate皮下脂肪组织标本中分离的酶消化使用1型胶原酶(卫氏生化,莱克伍德,新泽西)根据出版协议(
12 ,
13 ]。结果SVF细胞生存能力和量化测定使用生活/死解决方案分析(LaCell目录# LaLD-2)和荧光显微镜检查血细胞计数器。
2.3。细胞增殖实验
解冻后,新陈代谢活跃SVF细胞被量化使用溴化乙锭/吖啶orange-based生活/死解决方案(LaCell目录# LaLD-2)染色可行性协议。细胞被镀在一式三份的浓度64000细胞/ 96孔培养板中1毫升的培养基补充相应数量的ObaGel™(LaCell目录# LaObG-10)(0%丝绸文化和支架,凝胶为7.5%)。细胞培养为3、5、7天。文化后,细胞被孵化20
μ L细胞浓度测定蓝试剂添加到井的工作了四个小时。荧光是量化使用一个激发波长的发射波长560 nm和590 nm。控制支架和井进行了分析与调整的背景荧光。
2.4。纤维母细胞克隆形成单位(CFU-F)
解冻后,新陈代谢活跃细胞量化使用吖啶橙/溴化乙锭生活/死解决方案(LaCell目录# LaLD-2)染色可行性协议。细胞培养基被镀在100毫米50或100个细胞的浓度/板LaCell基质中(LaCell目录# lasm - 500)和美联储每3天。12 - 14天之后,文化是在福尔马林固定和染色用甲苯胺蓝染色溶液(LaCell目录# LaTB-50)协议。
2.5。脂肪形成的分化
对二维文化,立即解冻后,细胞被播种到24-well盘子的浓度
3
×
10
4
细胞/厘米2 24小时允许细胞附件。隔夜孵化后,介质被删除,取而代之的是新鲜AdipoQual™中(LaCell目录# laadm - 500)和美联储每3天中长达两周。
2.6。ObaGel三维静态脂肪形成的文化
使用ObaGel为三维文化,总结图来表示整个过程提供静态fat-on-a-chip文化(见ObaGel图发展
1 )。ObaGel thermoresponsive凝胶魔法变成复杂,自我组装的矩阵组织结构,是由细胞介导细胞外基质重塑。短暂,ObaGel解冻在冰(4°C)和稀释StromaQual (LaCell目录# lasm - 500)媒体所需的浓度(0%至25% (
v
/
v
))。SVF细胞从消化分离皮下脂肪组织根据出版协议和所述基质血管分数(SVF)细胞隔离。细胞与ObaGel /混合介质混合物所需的浓度和立即播种成24-well multidishes 1毫升卷,或表示为每一个研究。细胞悬液是用移液器吸取直接根据所需的体积每口井的井。矩阵聚合发生后立即转移到37°C细胞培养孵化器。细胞/ ObaGel混合物,称为ObaCell™,培养了两个星期,允许细胞矩阵重构,强劲的增长,启动脂肪组织功能。结构被诱导的脂肪形成的血统与接触AdipoQual (LaCell目录# laadm - 500)中补充了ObaGel同时表示浓度/研究(见
细胞增殖实验、功能分析化验(葡萄糖摄取、脂类分解和Adipokine分泌),和共焦和电子显微镜)。
图1
总结发展中静态图代表整个过程使用ObaGel fat-on-a-chip文化。
![]()
2.7。油红O染色
胞浆内脂质沉积是利用油红O染色评估解决方案(LaCell目录# LaORO-50)协议:细胞培养3天与PBS 24-well板第一次冲洗三次,然后用10%(固定15分钟
v
/
v
福尔马林溶液。单层膜与PBS被洗了三次,把福尔马林的解决方案。固定膜在室温下培养45分钟的奥罗染色方案。45分钟后,多余的染色的解决方案是吸气与PBS和单层膜清洗4次,删除任何剩余的染色方案。ORO-stained层可视化使用相差显微镜(Motic AE2000,里士满,不列颠哥伦比亚,加拿大)。
2.8。BODIPY染色
ObaCell文化,积累脂质也可视化使用BODIPY亲脂性的荧光染色。ObaCell文化中性缓冲福尔马林固定在10%隔夜在4°摄氏度和蒸馏水冲洗。BODIPY工作的解决方案是添加到文化和孵化为一个额外的24小时。与赫斯特文化与蒸馏水冲洗和复染色核染料根据制造商的协议。采用激光共聚焦显微镜图像。
2.9。功能分析化验(葡萄糖摄取、脂类分解和Adipokine分泌)
根据方法ObaCell文化建立了
细胞培养2 -和三维构型。 100年
μ L的条件培养基ObaCell文化收集在7天,14日,21日和28日(
N
=
6
每个样本条件)和复制转移到96 -化验的好菜。协议是由制造商指定的测量葡萄糖吸收,脂解作用,脂联素、瘦素分泌。
2.10。流式细胞仪:2 d SVF文化
单细胞悬浮体是根据标准协议准备2 d文化和ObaGel 3 d静态文化。对于2 d文化,106 镀SVF细胞在t - 75烧瓶和在控制或分化培养基培养。SVF被resuspended使用标准trypsin-EDTA协议,用prechilled磷酸盐(PBS)补充1%牛血清白蛋白(BSA),分成单独的埃普多夫管,以及孵化与抗体在黑暗中30分钟。潜伏期后,细胞用PBS和使用10%福尔马林固定的三倍。样品进行了分析使用FACSCalibur血细胞计数器(Immunocytometry正欲系统)。以下标记进行了分析:CD29 + / CD105 + / CD45 / CD34 + / CD73 + / CD90 +。
2.11。流式细胞仪:ObaGel文化
ObaGel文化建立在ObaGel三维静态描述使用方法上面脂肪形成的文化。细胞培养和收获时间点每个研究通过添加一个表示Obazyme消化剂(Obatala科学目录# ObaZYM-15)直接向井1:1比例与ObaCell静态文化卷15分钟为一天的文化和一个小时两周建立文化。由此产生的单细胞悬浮体收集,离心机在300 x g (1200 rpm) 5分钟,并在PBS resuspended补充BSA为1%。细胞被分成独立的埃普多夫管和孵化与上面相同的抗体和协议表示在流式细胞术:2 d SVF文化。
2.12。共焦和电子显微镜
共焦显微镜进行ObaGel silk-based
在体外 脂肪形成的差异化构造(见脂肪形成的差异化),六周后外植体
在活的有机体内 植入和链BODIPY染料染色。激光共焦进行了研究使用尼康A1 Ti-E显微镜系统。组织成像在Nunc 35毫米玻璃底菜,10和20 x无油目标,使用FITC和DAPI激光。Cryoscanning电子显微镜对ObaGel构造和丝绸支架2周后被播种的人类SVF细胞脂肪形成的分化。Cryo-SEM结构研究是2500年完成Gatan alto Cryo-system和日立s - 4800扫描电镜。组织被切断
7
×
5
×
5
(毫米),高约5毫米以上低温扫描电镜样品架表面,夹紧并粘到,然后在泥浆液氮冷冻大约在-210°C约30秒。冷冻组织转移在真空预燃室与SEM然后断裂和升华5分钟在-95°C。涂层后88秒在-130°C Pt / Pd,样品搬到扫描电镜,观察到3 kV -130°C。
2.13。细胞分析器图像分析
图像分析进行使用CellProfiler v2.2.0。原始图像的图像集都导入到CellProfiler然后分为离散DAPI FITC频道。每个通道的总图像强度测量使用MeasureImageIntensity模块。个人形象集然后运行通过一系列的模块来识别对象。
2 d和3 d的文化形象,通过IdentifyPrimaryObjects DAPI通道运行模块使用全局阈值策略和大津三级阈值方法和从中间像素强度分配给背景。强度阈值后用来区分单个对象。FITC通道从同一组贯穿IdentifyPrimaryObjects模块使用相同的设置,除了高斯拉普拉斯算子的方法被用来区分对象后阈值和由此产生的形状画分界线。
白色的三维文化形象,DAPI和FITC渠道减去互相使用ImageMath模块以提高对比度。DAPI - FITC和一成不变的DAPI渠道从这个集合然后运行通过IdentifyPrimaryObjects模块使用一种自适应阈值策略和大津三级阈值方法和从中间像素强度分配给背景。FITC - DAPI图像集和白色的一成不变的FITC渠道设置运行通过IdentifyPrimaryObjects模块使用全局阈值策略和大津三级阈值方法和从中间像素强度分配给背景。一成不变的DAPI和FITC渠道加以平均使用ImageMath模块。由此产生的图像通过IdentifyPrimaryObjects然后运行模块使用一种自适应阈值策略和大津三级阈值方法和从中间像素强度分配给前台。所有三组模块用于白色图像阈值后使用强度来区分个体对象集。
丝-与ObaGel-based脂肪形成图像集,DAPI通道运行通过IdentifyPrimaryObjects模块使用一个自适应鲁棒的背景阈值策略。对这组,强度是用来识别对象在阈值和它们的形状被用来画分界线。FITC通道从这组运行使用全局阈值策略和大津三级阈值方法和从中间像素强度分配给背景。对于这组,强度阈值后用来区分单个对象。
图像区域被识别对象在所有图像集测量使用MeasureImageAreaOccupied模块。对象接触的边界图像的图像被丢弃的,和其余的对象是量化和MeasureObjectIntensity MeasureObjectSizeShape模块。图片保存后把渠道和每个目标识别模块。结果所有模块都出口到Excel。
2.14。体内三维构造体
植入物进行使用ObaGel或hexafluorisopropanol (HFIP)丝支架(塔夫斯大学组织工程研究中心,梅德福,MA)播种有或没有SVF细胞6-8-week-old C57BL / 6雌性老鼠(查尔斯河实验室,威明顿,MA)按照杜兰大学机构的动物保健和使用委员会审查和批准协议(# 4302 r;2016年3月16日,)如前所述
14 ]。研究进行的杜兰大学植物园与兽医护理提供日常的比较医学。
2.15。统计分析
给出的值
的意思是
±
标准
偏差
(SD)除非另有注明。统计学意义是基于学生决定
t
以及和1路或双向方差分析与多个进行对比测试。为多个比较使用统计假设检验,Sidak发布测试用于multiplicity-adjusted
pgydF4y2Ba
值报告,
pgydF4y2Ba
值< 0.05。计算进行了使用棱镜GraphPad软件(美国加州拉霍亚)。
3所示。结果
3.1。人类SVF Immunophenotype细胞
新孤立和低温贮藏人类SVF细胞(
N
=
12
捐助者)的研究特点的基础上,脂肪形成的成骨分化,成纤维细胞的克隆形成单位(CFU-F)形成,扩散,immunophenotype通道0 (P0)文化(图
2 )。我们实验室已经广泛SVF细胞和发展标准操作程序描述在这个存在的亚种群异构分数(弗雷泽et al . 2018年)。捐赠者的平均年龄(±SD)
49.4
±
6.3
年平均身体质量指数(±SD)
27.5
±
2。9
公斤/米2 。捐赠者immunophenotypes由造血/基质(CD90:
75.6
%
±
3所示。0
%
)、信息和细胞表面粘附(CD29:
66.7
%
±
15.0
%
;CD44:
18.6
%
±
2。6
%),白细胞共同抗原(班;CD45:
3所示。0
%
±
2。8
%),干细胞/祖(CD34:
1。9
%
±
1。0
%;CD73:
75.5
%
±
3所示。6
%
和CD105:
78.2
%
±
2。1
%)postthaw立即标记。
图2
捐助者和SVF细胞利用的人口特征研究。人类SVF细胞特征的基础上(a)脂肪形成的成骨分化,(b)捐赠人口,(c)集落形成,(d)增殖和细胞immunophenotype (e)。捐赠者人口统计如下(在
的意思是
±
SD
):年龄(
49.4
±
6.3
),身体质量指数(BMI
27.5
±
2。9
)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.2。聚合的ObaGel Thermoresponsive凝胶是一个Cell-Driven过程
研究调查的相关性细胞播种密度和ObaGel浓度凝胶稳定性进行(图
3(一个) )。ObaGel文化被播种在浓度增加,从500年到20 k细胞/厘米2 的24-well多井。凝胶稳定性是衡量观测井的数量与凝胶保持一致的体积postseeding,除以总数量的播种井,报告为一个百分比(%)总胶凝。100%的凝胶形成ObaGel-supplemented介质(保持在7.5%
v
/
v
),没有任何额外补充生长因子(数字
3(一个) 和
3 (d) )。
图3
颞immunophenotype和胶凝行为人为ObaGel SVF细胞在三维培养的。研究调查相关的细胞播种密度和ObaGel浓度凝胶稳定性进行(a),和全板图片(b)。凝胶稳定性测量和报告为一个百分比(%)总胶凝。调查影响SVF immunophenotype从新鲜孤立SVF细胞相比ObaGel文化1和7 (c)在天。100%凝胶形成保持7.5% ObaGel-supplemented介质(
v
/
v
),没有任何额外补充生长因子(d)。报告为值
的意思是
±
SD
。
∗
pgydF4y2Ba
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.3。Immunophenotype ObaGel-Cultured人类SVF细胞
流转immunophenotyping SVF细胞培养在7.5% ObaGel确定细胞仍然可行,继续显示异质性(图
3 (c) )。刚解冻的immunophenotype细胞相比,与骨髓(CD19)相关抗原的表达,干细胞/祖(CD34) preadipocyte (CD36)造血(CLA);CD45)、pericytic (CD146)和淋巴(CD3)身份没有显著不同的低温贮藏后,解冻,培养一周postseeding ObaGel。相比之下,SVF细胞显著调节CD31的表达,内皮祖细胞的标记(新鲜解冻SVF:
23.5
%
±
3所示。4
%与第七天ObaGel文化:
87.0
%
±
7.9
%),明显下调CD73的表达,淋巴细胞分化的标志(新鲜解冻SVF:
54.5
%
±
12.2
%与第七天ObaGel文化:
25.78
%
±
9.2
%
)。
3.4。3 d文化ObaGel刺激强健人类SVF细胞增殖和自组装成球状体
细胞增殖是ObaGel更高比传统2 d文化与胎牛血清(图中补充
4(一) )。进一步调查ObaGel SVF细胞行为的影响,揭示了在球状体暴露在低浓度的浓度发展ObaGel,早在5到7天的文化(图
4 (c) )。球体大小和体积增加的函数ObaGel浓度百分比的0.25%和0.75%之间。粘附细胞的数量随ObaGel浓度增加而降低,反映细胞附着和ObaGel浓度之间存在一种间接关系(数据没有显示)。脂肪形成的差异化的ObaGel文化显示诱导一个健壮的胞浆内脂质积累的能力内的脂肪基质/干细胞种群在文化(图在低浓度ObaGel球状体
4 (d) )。
图4
比较SVF增殖,球体体积和形成,并在2 d文化和ObaGel脂肪形成的功能。(一)亮视场和共焦显微镜图像的2 d文化和ObaGel SVF细胞增殖。细胞被播种在传统2 d媒体或ObaGel,培养5天,与赫斯特染料染色。强大的细胞增殖发生在ObaGel 2 d文化相比,赫斯特所指出的积极性。显微照片(b, c)报告和相应的量化反映ObaGel浓度之间的正相关和SVF球体大小、密度和体积的5 - 7天内文化。(d)表明,脂肪形成发生在球状体的分化早在第三天。值报告为
的意思是
±
SD
。
∗
pgydF4y2Ba
<
0.05
相比刚解冻的细胞或丝结构。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.5。2 d文化和丝绸支架相比,ObaGel支持健壮的脂质积累,更复杂的网络形成和维护一个细胞表面抗原剖面类似于新孤立SVF细胞
之前的3 d脂肪我们实验室所做的研究和我们的合作者hexafluoro-isopropyl——(HFIP)治疗丝绸多孔支架支持SVF细胞的生长和分化脂肪形成的一个
在体外 脂肪组织模式
14 - - - - - -
16 ]。本研究扩展这些观察通过比较人类SVF细胞的行为在二维培养条件和在三维播种在ObaGel丝支架或培养2周。SVF细胞immunophenotype脂肪形成的能力,和adipokine功能进行调查(图
5 )。在两周postseeding,未分化细胞SVF展示了强大的增殖的差异,类似于观测图
3 。细胞矩阵重构支持ObaGel文化中,复杂网络最早形成(图8 - 10天
5(一个) ObaGel共焦图像)。形成网络的规模和复杂性增加了文化(图14天
5(一个) )。还指出这种现象是依赖ObaGel浓度,最初出现在浓度低至1.5% (
v
/
v
;数据未显示)。同样,胞浆内脂质积累明显高于ObaGel文化相比,二维文化(图
5(一个) )。脂滴的顶部附近观察ObaGel文化和继续积累数量,从第五天开始。
图5
的比较
在体外 行为的人类SVF细胞在二维培养条件和在三维播种在ObaGel丝支架或培养2周。(一)共焦和cryoscanning电子显微镜(cryo-SEM)的图像SVF细胞播种,增殖,与脂肪形成的差异化行为在传统2 d文化,丝绸支架,ObaGel。文化(b) SVF immunophenotype 1周后显示,ObaGel优越在维护一个异种的immunophenotype类似新鲜分离细胞和支持的扩张cd44阳性的亚种群(b),和adipokine功能(c)报告的瘦素分泌脂肪形成的分化细胞播种与ObaGel丝绸或早期(3天)和后期(28天)时间点的区别。Immunophenotype值报告为
的意思是
μ
±
标准
偏差
(SD)。
∗
pgydF4y2Ba
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
类似于以前的特性研究(图
3 ),ObaGel SVF异构性没有显著影响。刚解冻的immunophenotype细胞相比,与所有的血统相关抗原的表达免疫测定明显减少丝绸文化(图2周后
5 (b) )。相比之下,ObaGel SVF异质性程度高,显著增加基质标记的表达CD44的表达,减少pericytic (CD146),淋巴(CD3)和淋巴细胞分化(CD73标记(图)
5 (b) )。类似于先前的报道,adipokine分泌支持在早期脂肪形成。然而,ObaGel文化分泌的瘦素水平高于丝3 d文化在早期(3天:丝绸、
923.4
pg
/
毫升
±
29.0
pg / mL;ObaGel,
997.5
pg
/
毫升
±
21.6
pg / mL)和后期(28天:丝绸、
118.8
pg
/
毫升
±
17.2
pg / mL;ObaGel,
981.8
pg
/
毫升
±
25.2
pg / mL)时间点。
3.6。ObaGel文化展览脂肪相对于生理功能相关的脂肪移植组织和体内血清水平
脂联素瘦素(与)和(地蜡)分泌物从2 d细胞培养相比,ObaGel文化经过21天的文化。ObaGel文化持续分泌adipokine水平较高与2 d文化相比,在与(2 d:
420.3
pg
/
毫升
±
199年
pg
/
毫升
;ObaGel:
5630年
pg
/
毫升
±
504.9
pg
/
毫升
;图
6(一) )和地蜡(2 d:
84.1
pg
/
毫升
±
39.8
pg
/
毫升
;ObaGel:
1126年
pg
/
毫升
±
101.1
pg
/
毫升
;图
6(一) )。在人类与血清浓度在文献中报道的中位数41.47 ng / mL (41470 pg / mL),范围为6.01 ng / mL - 145.40 ng / mL (6010 pg / mL - 145400 pg / mL) (
17 ]。地蜡血清浓度在人类是在文献中报道的中位数221.85 pg / mL,范围为45.68 pg / mL - 894.5 pg / mL (
17 ]。ObaGel文化功能进一步调查与测量甘油分泌的条件培养基后14天的文化。自由甘油含量更高ObaGel文化相比,2 d文化(2 d:
96.7
μ
米
±
10.0
μ
米
;ObaGel:
298.5
μ
米
±
54.8
μ
米
;图
5 (b) )。相比之下,发现甘油从切除小鼠脂肪水平平均为276
μ M。
图6
ObaGel文化展览相关的生理功能。脂联素瘦素(与)和(地蜡)分泌物测量与传统的细胞培养(2 d)相比,三维脂肪文化(ObaCell)经过21天的文化。值报告在pg / mL条件培养基和报告
的意思是
μ
±
标准
偏差
(SD)。
∗
pgydF4y2Ba
<
0.05
。脂肪组织功能演示与甘油测量分泌细胞分化的条件培养基相比,二维(2 d) ObaGel后14天的文化。ObaGel文化展示了高灵敏度AMPK-targeting化合物异丙肾上腺素,二甲双胍,复合C, IBMX。值报告在pg / mL条件培养基和报告
的意思是
μ
±
标准
偏差
(SD)。
∗
pgydF4y2Ba
<
0.05
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.7。ObaGel文化展览增加灵敏度AMPK-Targeting化合物调节胰岛素敏感性
在缺乏任何化合物,ObaGel 3 d文化展示更高的功能以2-deoxy-D-glucose吸收活动(2 d:
22.1
点
/
μ
l
±
3所示。1
点
/
μ
l
;ObaGel:
53.7
点
/
μ
l
±
2。8
点
/
μ
l
;图
6 (c) )。进一步的研究评估ObaGel文化AMPK-activating化合物异丙肾上腺素和二甲双胍治疗,和一个AMPK抑制剂、复合C (Dorsomorphin)。接触的化合物显示敏感性增加ObaGel文化相比,2 d(图
6 (c) ),据报道,在剂量水平与药物相关的文献中找到。复合C显著减毒与基线相比2-DG6P检测9%和36%相比,metformin-mediated葡萄糖吸收(图
6 (c) )。同样,ObaGel文化表现出明显高于甘油分泌在基线水平(2 d:
3所示。4
μ
米
±
0.8
μ
米
与ObaGel:
24
μ
米
±
0.7
μ
米
;图
6 (d) ),当由异丙肾上腺素刺激(2 d:
4
μ
米
±
1。6
μ
米
与ObaGel,
35.2
μ
米
±
0.8
μ
米
;图
6 (d) )。
3.8。ObaGel展示了强劲的潜在体内血管
我们调查的能力,人类SVF细胞形成功能性脂肪裸体小鼠在播种ObaGel相比丝绸海绵支架(图
7 )。消极的控制包括注射ObaGel单独或空丝支架。支架在老鼠身上停留了6周,类似于先前发表的丝绸脂肪构造研究(
14 ]。苏木精和伊红染色显示密度限制丝支架内的增殖细胞。相比之下,ObaGel植入包含更大的结构,显然是在更大的综合功能,更成熟的脂肪细胞(图
7 )。
图7
植入的ObaGel人源化小鼠的脂肪垫的开发。支架在老鼠身上停留了6周。苏木精和伊红染色显示密度限制丝支架内的增殖细胞。相比之下,ObaGel植入包含大血管,显然是在更大的综合功能,更成熟的脂肪细胞。
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3.9。体内植入物分析人类SVF细胞在免疫缺陷小鼠ObaGel构造
BODIPY亲脂性的染色进行外植体远离裸体小鼠后六周植入。图像是由激光共焦显微镜和量化使用CellProfiler v2.2.0软件。控制植入ObaGel植入物注入在缺乏细胞。量化结果表明存在显著更大的脂肪细胞中含有较大的核领域内ObaGel / SVF外植体相比ObaGel控制外植体(图
8 )。
图8
体内植入物分析人类SVF细胞在免疫缺陷小鼠ObaGel构造。BODIPY亲脂性的染色进行外植体远离裸体小鼠后六周植入。图像是由激光共焦显微镜和量化使用CellProfiler v2.2.0软件。值报告在pg / mL条件培养基和报告
的意思是
μ
±
标准
偏差
(SD)。
∗
pgydF4y2Ba
<
0.05
。
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4所示。讨论
国际监管机构已经开始提倡人类细胞增加的3 d模型作为一个中央制药药物发现过程中筛选试验(
18 ]。预计这些3 d模型将减少依赖
在活的有机体内 动物模型的效率,同时增加识别有效的治疗目标化合物(
19 ]。因此,调查人员已经开始把天然或合成支架与主要人类tissue-derived细胞创建新的3 d瀑样。目前的手稿演示了一个3 d的效用和功能结构包含两个主要人类脂肪细胞和天然支架作为
在体外 脂肪组织仓库(图模型
2 )。基于形态学标准,ObaGel支架优于丝支架支持人类SVF细胞的脂肪形成的分化。存在的ObaGel SVF细胞促进vascular-like结构在三维结构的形成和稠化时间和浓度的方式。在一周期间,脂肪SVF细胞内ObaGel结构继续表达与干细胞相关的表面抗原(CD34),内皮细胞(CD31), ASC (CD73)表型。相对于二维文化,3 d ObaGel SVF细胞结构显示增加脂肪生成基于数量和脂质液泡大小一致的分化成熟的脂肪细胞“图章戒指”。同样,3 d ObaGel结构都优于2 d文化对葡萄糖吸收和adipokine(瘦素)分泌以及分解脂肪的反应代理如异丙肾上腺素、二甲双胍、和复合c的选择性感应鸡尾酒,生物标志物表达的3 d ObaGel SVF细胞结构一致的白色脂肪组织(窟)仓库。在一起,这个数据文件的有效性和效用的试剂和方法的可再生的建筑三维支架显示人类脂肪仓库的特点适用于制药和代谢
在体外 研究。
之前的研究报道协议文化3 d人体脂肪仓库
在体外 。最完善的模型的维护完整的脂肪组织碎片由多种文化方法被炸,刘,宫崎骏等
11 ,
20. - - - - - -
22 ]。在这些方法中,脂肪组织是碎成多维数据集1 - 2毫米的任何维度和孵化如下悬浮液迫使培养基的表面由一个屏幕,在烧瓶作为外植体“天花板文化”完全充满介质,在连续的风潮,ASC或层间夹上文化扩展。这些模型依赖于调查员准备好了进入新孤立的脂肪组织标本捐助者适当的人口特征(体重指数、年龄、性别,种族,和疾病状态)。虽然许多研究已经证明的可行性同行完整的脂肪组织长时间碎片,只有~ 50%的SVF这些组织仍然可行的内细胞群(
23 ]。这与低温贮藏的孤立SVF细胞和ASC保留postthaw生存能力水平的80%或更好,这取决于隔离过程和冷冻保存剂(
23 - - - - - -
27 ]。值得注意的是在目前的研究中,细胞SVF immunophenotype刚做好的和低温贮藏/解冻细胞之间的不同。虽然有明显的效用的低温贮藏SVF细胞和组织,每个可能面临一些限制。
同样,多个独立调查人员使用作为一个球状体
在体外 3 d文化模式
6 ,
28 - - - - - -
31日 ]。虽然可以使用悬滴准备方法和球状体低粘附组织培养表面,他们也可以获得使用聚合物微粒子(
6 ,
28 ,
30. ,
31日 ]。这些研究进一步证明,3 d发病明显分泌大量的球状体(
28 )和伤口healing-associated蛋白(
6 ]相对于2 d文化包含类似的细胞总数。此外,脂肪细胞3 d显示优越的棕色脂肪形成球状体相对于2 d文化模型(
28 ]。选择3 d文化方法,包括生物打印,同样显示优越的棕色脂肪形成相对于2 d系统
在体外(
32
- - - - - -
34
] 。这里使用了天然和合成生物材料来支持3 d脂肪形成的构造
在体外 。越来越多的文献评价脱细胞脂肪组织细胞外基质作为生物材料支架推动3 d模型为褐色和白色脂肪生成(
35 - - - - - -
43 ]。同样,3 d丝支架结合脂肪细胞被证明支持脂肪形成
7 ,
14 - - - - - -
16 ,
44 - - - - - -
47 ]。
尽管目前的研究验证ObaGel和SVF细胞作为的效用
在体外 人类脂肪仓库模型,还需要进一步的研究。除了当前的考试工作的3 d模型对二甲双胍和异丙肾上腺素的反应,系统需要更彻底地测试与更广泛的面板的药物药代动力学和药效学资料在脂肪组织中。而系统建立了坚定地使用SVF细胞分离皮下脂肪仓库,应当执行类似的分析利用SVF细胞隔绝在内脏脂肪仓库,网膜,周围重要器官。同样,研究需要执行评估人类SVF细胞的分化在ObaGel米色/棕色脂肪细胞谱系通路。此外,由于人类ASC和沿着chondrogenic SVF细胞可以分化,内皮细胞,成骨的血统,这也有待确定如果ObaGel / SVF细胞支架可用于模型骨,软骨,和/或血管网络或仓库
在体外 。最后,虽然当前模型依赖于一个静态的文化系统,其性能在灌注生物反应器是可行的,需要评估。这些问题对未来的设计提供了一个潜在的框架实验采用人类SVF细胞和ObaGel结构作为一个“现成的”系统,延长保质期,优于更辛苦更昂贵的方法,严重依赖于重叠细胞动力学和plasticware专门的表面涂层。