本研究按照CHA大学机构进行动物实验的动物保健和使用委员会(IACUC,没有批准。150066)。本研究遵循指南到动物研究的报告。动物被安置在标准实验室笼子里(12 h光/暗周期、温度 23 ± 1 ° C ),两个在每个笼子里,提供食物和水 随意。

人类iPSC线生成从人类PBMC (1231 a3)是“诱导多能性”细胞研究和应用中心提供的京都大学(CiRA)日本。1231 a3 iPSC线最初产生的电穿孔的EP OCT3/4组成的向量,KLF4, SOX2, L-Myc, Lin28, p53显性负突变(mp53DD)和巴尔核抗原1 (EBNA1)。详细描述了方法一代ep-iPSCs其他地方( 8, 23]。ep-iPSCs是维护feeder-free和xeno-free条件下使用StemFit™(味之素、东京、日本)介质和培养35毫米组织培养菜(BD,富兰克林湖,新泽西,美国;353002)涂上了0.5毫克/厘米²imatrix - 511 (Matrixome,大阪,日本)。多能性标记表达式的测试,核型稳定,three-germ层形成进行验证ep-iPSCs的特点。

当准备移植细胞,ep-iPSCs被诱导为神经前体细胞(npc)与小分子的使用,包括双SMAD抑制剂,如某人- 431542和ldn - 139189(见下文)。分化细胞,我们在初始ep-iPSCs分化培养基培养条件包含杜尔贝科的修改鹰中DMEM / F12淘汰赛5%血清替代(KOSR) 10 μM sb - 431542(试剂直接、恩、钙、美国;21-A94)和100 nM ldn - 139189(试剂直接;36-F52) 3天。我们改变了这个神经感应介质包括DMEM / F12 N2补充(Gibco沃尔瑟姆,妈,美国;17502 - 048),1毫米丙酮酸钠(Gibco;11360 - 070),3毫米葡萄糖(Gibco;G7021)、2毫米谷酰胺(Welgene、大邱、韩国;LS002-01), 0.2毫米抗坏血酸(MIσ,圣路易斯,美国;A4544),和3 μCHIR 99021 (Tocris、布里斯托尔、英国;4423)。媒介改变了每天2天。在那之后,当我们观察到rosette-like结构;细胞被仔细分离使用Accutase(干细胞技术,加拿大温哥华;在37°C, 07920) 5%的股份₂10分钟,转移到组织培养皿中涂有20 μg / mL poly-L-ornithine (PLO)和5 μg / mL层粘连蛋白(LN)。在这个阶段中,我们使用一个神经感应介质含N2 / B27 (Gibco;17504 - 044年)和碱性纤维母细胞生长因子(美国新泽西Peprotech,落基山;100 - 18 - b)。用于移植,ep-iPSC-NPCs仔细分离使用0.5 x TrypLE浓度选择(Gibco;12563 - 011年)在0.5毫米EDTA (Gibco;15575 - 020)。

中风模型引起的大脑中动脉阻塞(MCAo) 90分钟( 25]。成年男性Sprague-Dawley老鼠(朝向、首尔、韩国)重270 g - 300 g被用于这些实验。氯胺酮麻醉后1%(57.6毫克/公斤,腹腔内(i.p))和甲苯噻嗪(7.7毫克/公斤,i.p。),老鼠保持的体温 37 ± 1 ° C 躺在加热垫。颈动脉被曝光,blunt-ended硅涂层单丝(Ethicon、松木、英国;4 - 0)插入封闭大脑中动脉。MCAo后九十分钟,单丝小心地删除。MCAo后第二天手术,急性神经MCAo-induced老鼠进行了评估,确认神经赤字。移植前(MCAo后7天感应),有中度到重度的感觉运动的老鼠赤字(15分或以上修改神经严重程度量表(mns)得分)被选为实验。总共40老鼠,11动物没有起诉有几个原因,包括死亡移植前( n = 4 )和轻度神经赤字( n = 7 )。因此,总共29老鼠纳入本研究。

MCAo后一周感应,老鼠分为三个治疗组:大鼠治疗ep-iPSC-NPC移植(ep-iPSC-NPC集团 n = 9 ),老鼠与人类成纤维细胞移植治疗(成纤维细胞组织, n = 10 ),在小白鼠身上,只有天真的培养基(DMEM)负控制(汽车集团 n = 10 )。ep-iPSC-NPC组,总共 2 × 10 5 ep-iPSC-NPC鼠脑内移植(补充图。 1)。这些细胞被注入在两个点( 1 × 10 5 细胞每一点),协调如下:(1)+ 1.6毫米前后的(美联社),-2.0毫米中侧的(毫升)和-3.0毫米背腹侧的(DV)和(2)+ 1.6美联社,毫升-2.0毫米和-6.0毫米的背腹侧的DV前囱使用立体定位仪器速度为0.5 μL / min(补充图。 1 b)。针是留给收缩前5分钟。纤维母细胞组人包皮成纤维细胞(美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国;crl - 2522),使用相同的数量对于ep-iPSC-NPCs,移植到同一坐标。环孢霉素(CsA)管理所有动物腹腔内(10毫克/公斤的前一天移植和5毫克/公斤每天长达12周)。

总共五个行为在所有测试组进行测试(ep-iPSC-NPC集团 n = 9 ;成纤维细胞组织, n = 10 ;和汽车集团 n = 10 )12周。rotarod测试( 11),每只动物被训练每天连续三天前MCAo归纳。rotarod速度逐渐从4个增加至40 r.p.m。为2分钟。每个老鼠都放在rotarod轮,和持久性的时候缸被记录。我们记录的时间为每个老鼠才掉下来的旋转轮和计算的平均时间从三个试验。测试1天前MCAo(前)和每周MCAo后12周感应。

老鼠mns测试,每个测试1天前MCAo感应和每周MCAo后12周感应。每个老鼠被评分,每个电动机和感官评分的总和。mns最高得分(28分)代表最严重motorsensory障碍而最低得分(0分)代表正常感觉运动功能。

为步进测试( 26),每个老鼠都位于垂直5 ~ 7厘米以上的跑步机。跑步机的速度保持在23 r.p.m。与一个向前和向后的方向。我们清点的数量的老鼠把自己的前爪放在传送带上。每个爪子和方向测量三个试验。所有的动物进行每周12周。

为楼梯测试( 27),老鼠被放置在节食期间的培训和训练使用楼梯笼MCAo手术前3天。在笼子里,老鼠训练从左边楼梯捡球。每个训练步骤在黑暗中进行,老鼠被选,吃糖超过15球。MCAo后手术,两周一次的执行测试,每个测试三次,12周。每个老鼠吃了塑料颗粒数。

apomorphine-induced旋转测试( 28),阿朴吗啡(σ,1.0毫克/公斤0.2%抗坏血酸盐)是每个大鼠腹腔内注入。每个老鼠放在一个丙烯酸框笼5分钟,和旋转的数量是1 h。旋转被定义为完成一圈360°向侧方的受伤。这个测试进行为期12周的每周两次的。本研究基于0-week数据表示为一个百分比。

分析标记的表达无差别的人类ep-iPSCs ep-iPSC-NPCs, 12毫米²玻璃盖玻片涂层使用imatrix - 511未分化ep-iPSCs和巴解组织/ LN npc。细胞被播种在涂布12毫米²盖玻片和培养3到4天。细胞在盖玻片是洗了三次磷酸盐(PBS)含有钙和镁(PBS⁺)和固定在4%多聚甲醛在室温下15分钟。固定细胞和PBS洗了三次⁺和三次PBS Triton x - 100 0.1%。细胞表面标记的情况下,固定在PBS洗没有特里同x - 100。细胞培养在5%正常马血清(NHS) 30分钟。之后,样品被孵化主要抗体稀释在PBS一夜之间在4°C: anti-OCT4 (1: 500;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国;sc - 5279), anti-SOX2 (1: 100;美国微孔,伯灵顿,马;AB5603), anti-SSEA4 (1: 100;IA杂种细胞发育研究银行,爱荷华市,美国;mc - 813 - 70),反-运输- 1 - 81 (1):250; Chemicon International, Temecula, CA, USA; MAB4381), anti-TRA-1-60 (1 : 100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA; 560071), and anti-Nestin (1 : 200; R&D Systems, Minneapolis, MI, USA; AB1259).

第二天,细胞用PBS洗净,然后用二次抗体在黑暗中孵化在PBS稀释2 h如下:Alexa萤石555 goat-mouse免疫球蛋白g (1: 250;美国分子探针,尤金,或;A21427), Alexa萤石555山羊anti-mouse IgM (1: 250;分子探针;A21726), Alexa萤石488 goat-rabbit免疫球蛋白g (1: 250;表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国),Alexa面粉555驴抗体免疫球蛋白g (1: 250;美国生命技术、卡尔斯巴德CA;A21432)。2 h后,细胞被沾染了4 ′ ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;1:1000;罗氏诊断,德国曼海姆)。荧光图像捕获使用共焦激光扫描显微镜成像系统(LSM510;卡尔蔡司缩微成像公司,德国耶拿)和一个ApoTome显微镜(卡尔蔡司缩微成像,Inc .)。

逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)分析人类ep-iPSCs ep-iPSC-NPCs,从细胞总rna分离颗粒使用试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国;15596 - 026)。互补的dna(互补)然后从提取的总RNA合成使用互补脱氧核糖核酸合成装备(Cosmo通用,首尔,韩国;CMRTK002)。Pre-PCR是由42°C 1 h和10分钟的70°C。rt - pcr进行使用i-Taq DNA聚合酶(内含生物技术,凭借,韩国;25022)在最后一卷20 μ包含100 ng / L μL cDNA为每个样本。使用以下引物:GAPDH(底漆:TGA CCA CAG太极拳ATG CCA柠檬酸CTG C;反向引物:GTC ATA CCA GGA AAT GAG CTT GAC);Oct3/4(正向引物:CTG亚美大陆煤层气有限公司CAG亚美大陆煤层气有限公司gg ATC交流;反向引物:广汽CAC ATC CTT CTC GAG CC);NANOG(正向引物:TTC TTG GGG ACC TTG TC行动;反向引物:GCT TGC GCT TTG亚美大陆煤层气有限公司总部CA);SOX2(正向引物:GCT GCA AAA GAG AAC ACC AA;反向引物:有条件现金援助GCA亚美大陆煤层气有限公司总部CTC CTA CC);Lin28(正向引物:CAC猫GGG CTC CGT GTC CAA CCA GCA G; reverse primer: TCA ATT CTG TGC CTC CGG GAG CAG GGT AGG); Nestin (forward primer: TCC AGA AAC TCA AGC ACC A; reverse primer: AAA TTC TCC AGG TTC CAT GC); and Musashi (forward primer: ACA GCC CAA GAT GGT GAC TC; reverse primer: CCA CGA TGT CCT CAC TCT CA). First, denaturation was performed at 94°C for 5 min. Then, the annealing step was adjusted according to each marker, and the final extension step was performed at 72°C for 7 min. PCR cycling was carried out for 30 cycles. PCR products were detected using a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide and visualized with a Gel Doc EZ system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

当ep-iPSCs confluency达到大约80%,我们进行了流式细胞术。文化被分离成单细胞悬液使用0.5 x TrypLE TrypLE选择酶组成的解决方案(热费希尔科学)和0.5毫米超纯EDTA(热费希尔科学)。细胞仍然是不固定的,沾phycoerythrin-conjugated抗原抗体相应的使用制造商推荐的浓度同形像。我们使用anti-SSEA4(1: 200)和anti-IgM同形像(1:200)和anti-TRA-1-60(1: 200)和anti-IgG3同形像(1:200;所有从BD生物科学)。染色后,需要大量的样本处理通过BD流式细胞仪石中剑™流式细胞分析仪(BD生物科学)。数据获取和分析利用BD fluorescence-activated细胞分选仪(流式细胞仪)天后软件。

(即MCAo 13周后手术。,12weeks after transplantation), rats were sacrificed and transcardially perfused with heparinized saline (0.9% NaCl), followed by 4% paraformaldehyde. After brains were extracted, the samples were fixed by 4% paraformaldehyde overnight at 4°C. The next day, the specimens were dipped into a 30% sucrose solution on a shaking device for 1 to 3 days at 4°C. The specimens were frozen in optimal cutting temperature compound (Leica Biosystems, Nussloch, Germany; 3801480). Double-label immunofluorescence staining was performed on free-floating 40  μ米的部分。染色后,部分被洗了三次PBS为5分钟。然后,部分被孵化三次PBS中含0.3% Triton x - 100(σ)10分钟。5%的部分被孵化NHS(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) PBS中含0.3% Triton x - 100 1 h在室温下。以下主要抗体孵化在PBS NHS 2%含有0.3% Triton x - 100(σ)一夜之间在4°C:反人类特定的原子核(1)、反人类线粒体(hMito MTC02),反人类特定的巢蛋白(hNestin) anti-microtubule-associated protein-2 (MAP2) anti-glutamate脱羧酶65 &67 (GAD65/67) anti-medium-sized-spiny神经元标记(Darpp32) anti-gamma氨基丁酸(GABA) anti-synaptophysin——(高级)38岁anti-O4, anti-glial原纤维酸性蛋白(GFAP)、anti-brain-derived神经营养因子(BDNF), anti-doublecortin(克莱斯勒)anti-proliferating核抗原(PCNA)、anti-polysialic acid-neural细胞粘附分子(PSA-NCAM) anti-ED1, anti-Iba-1, anti-inducible一氧化氮合酶(间接宾语),anti-CD206, anti-caspase 3。详细的个人信息主要抗体免疫组织化学中使用描述(补充表 1)。第二天,部分是用PBS和孵化荧光dye-conjugated二级抗体相关的物种在室温下2小时。后来,部分与DAPI复染色。共焦激光扫描显微镜下使标本可视化(LSM510;卡尔蔡司缩微成像Inc .,慕尼黑,德国)。

5 ′ -bromo-2 ′ 脱氧尿苷(BrdU)染色,BrdU(50毫克/公斤,Sigma-Aldrich)腹腔注射安乐死之前1周。BrdU-positive通过免疫组织化学方法观察细胞对BrdU使用抗体后变性的DNA治疗1 M盐酸为30分钟37°C。终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)化验进行使用 原位细胞死亡检测设备(美国罗氏,印第安纳波利斯)根据制造商的指示。

安乐死的前一个月,1 μL fluorogold (FG, 4%在无菌生理盐水溶液;分子探针)注入苍白球(ML, -1.3毫米,-3.4毫米和-6.5毫米前囱DV)侧细胞移植。立体定位注射使用26个G汉密尔顿注射器注射剂泵为5分钟。一周后,FG-injected动物牺牲和大脑组织中提取。

我们评估BDNF的表达ep-iPSC-NPC相比,在常氧或缺氧条件下人类成纤维细胞。在缺氧实验中,我们感应轻度缺氧(3%啊₂)细胞ep-iPSC-NPC移植的时间在这项研究中对应于一个轻微的缺氧缺血再灌注后(7天)。的 1 × 10 5 ep-iPSC-NPCs和人类成纤维细胞是在常氧条件下孵化湿润空气95% / 5%股份有限公司组成₂24 h。之后,细胞暴露于3%₂在低氧室24小时(星系48 r有限公司₂孵化器,埃普多夫,德国汉堡)。缺氧后,细胞24小时回到常氧条件。常氧条件下的控制不断保持完整的持续时间。

细胞细胞溶解使用PRO-PREP™(内含生物技术,凭借,韩国)20分钟在冰上。蛋白质浓度被证实使用皮尔斯™BCA蛋白质分析工具包(美国马热科学、沃尔瑟姆),然后煮5分钟在95°C。蛋白质分离使用12% ( w / v )钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳凝胶和转移到Immobilon-P聚偏二氟乙烯膜(微孔、Carrigtwohill科克,爱尔兰)。细胞膜是孵化主要抗体BDNF (Abcam 1: 1000年,剑桥,妈,美国) β肌动蛋白(1:1000年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)在2%的脱脂牛奶TBST一夜之间在4°C。所有乐队都是使用化学发光试剂开发(清晰™ECL衬底,Bio-Rad,赫拉克勒斯,加利福尼亚州)和在G:发现了盒子化学XX6凝胶医生系统(美国弗雷德里克Syngene)。分析使用ImageJ软件(ImageJ;美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

12日甲苯基紫染色 μm日冕部分进行测量最后梗塞大小。共有八个串行部分分析了在每一个动物。我们估计梗死大小的比例不变侧半球通过使用以下方程: 估计 梗塞 大小 % = 1 - - - - - - 区域 的 剩下的 身体的同侧的 半球 / 区域 的 完整的 对侧的 半球 × One hundred. 。感兴趣的领域是衡量使用ImageJ软件,和价值观总结每六连环日冕部分大脑。

运动诱发电位(MEP)分析细胞移植后12周。所有的动物进行麻醉和固定在一个立体定位器。颅骨切开术形状的广场(基于5毫米,前囱尾5毫米)是使用一个钻,电极是通过广场frontoparietal放置在正确的位置。诱导议员,动物被0.2毫秒脉冲持续时间和刺激震惊马6的电流强度的刺激隔离器(A365;世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)和脉冲发生器(A365,世界精密仪器)。记录电极针放置在前肢和后肢肌肉。每组的振幅被SonuView计划相比。

道细胞测量通过计算1月应用使用3,3 ′ -diaminobenzidine (DAB)染色(sk - 4100;美国向量实验室,伯林盖姆,CA)每一个40五冠的大脑部分 μ米厚度。使用ImageJ细胞数量由半自动的粒子分析软件(NIH)的调查人员盲目的行为结果。由于高可变性在动物移植率和分化细胞的细胞计数困难在整个大脑的部分中,分化细胞的平均比例无法评估。相反,我们叙述地分析每个分化细胞的最大比例。

进行了统计分析使用统计分析系统程序(Enterprise 4.1;韩国首尔的SAS)。所有的值作为一个 的意思是 ± 标准 错误 的 的 的意思是 (SEM)。组织分析的测量进行了分析使用一个单向方差分析(方差分析),双向方差分析测试和行为表现进行了分析。被认为是在统计意义 p < 0.05 。

首先,我们通过免疫细胞化学特点ep-iPSCs, PCR,流式细胞仪分析。在采用免疫分析中,ep-iPSCs显示强阳性染色为多能性标记,如OCT4、SOX2, NANOG(图 1(一))。SSEA4还显示强阳性细胞染色,TRA-1-60,交易- 1 - 81。流式细胞仪分析显示,近90%的细胞显示阳性染色SSEA4和TRA-1-60(图 1 (b))。PCR分析显示强烈的基因表达 OCT4, NANOG, SOX2, LIN28(图 1 (c))。核型分析,ep-iPSCs没有显示任何染色体异常(数据没有显示)。

我们下一个执行神经诱导生成ep-iPSC-NPCs通过使用双重SMAD feeder-free xeno-free条件下抑制。完成后全国人大ep-iPSCs感应,免疫组织化学和PCR ep-iPSC-NPCs特征进行了分析。细胞表现出强烈的表达巢蛋白和SOX2在免疫组织化学(图 1 (d))和PCR(图 1 (e)),这表明从ep-iPSCs npc被成功分化。

评估是否ep-iPSC-NPCs的移植可能导致中风、功能影响大鼠的行为ep-iPSC-NPC组相比在成纤维细胞和工具组。在rotarod测试中,老鼠ep-iPSC-NPC组经历了较长时期的rotarod缸比大鼠成纤维细胞和车辆组ep-iPSC-NPC移植(图3 - 11周后 2(一个))。老鼠ep-iPSC-NPC组,成纤维细胞和车辆组相比,表现出显著改善步进试验和mns分数从2周ep-iPSC-NPC移植(图11周后 2(一个))。楼梯进行了测试和apomorphine-induced旋转测试每两周。ep-iPSC-NPC集团然而,楼梯上测试显示出了极大的提高只有3、7和9周后移植相比其他组(图 2(一个))。apomorphine-induced旋转试验,大鼠ep-iPSC-NPC组有较低的旋转数比例从3 - 11周后移植相比其他组(图 2(一个))。除了功能恢复,最后梗塞大小11周移植后明显减少ep-iPSC-NPC组的大鼠成纤维细胞相比,汽车集团(图 2 (b))。这些发现表明,ep-iPSC-NPC移植诱导老鼠大脑右半球的逐步改善神经赤字。

识别的ep-iPSCs-NPCs移植大脑,我们对1进行了免疫组织化学。移植后12周,大多数移植细胞注入地区发现了一小部分的移植细胞稀疏时出现在peri-infarct区(补充图。 2)。嫁接是高度可变的速度测试的动物。hNu-positive细胞的平均数量 4565年 ± 4969年 ,也就是说,大约2.3%的初始移植细胞的数量。最大移植率为7.5%(约15000 hNu-positive细胞)。移植细胞没有形成肿瘤样结构在注射部位或在peri-infarct病变检查所有动物移植后12周。

确定是否接枝ep-iPSC-NPCs成为分化成神经元或神经胶质血统,我们执行双重免疫组织化学染色神经元和神经胶质的标记。人类特有的标记(1、hMito和MTC02)和神经元或神经胶质标记costained检查是否人类起源的细胞。大多数的移植细胞强烈表达巢蛋白注射部位移植后12周(补充图。 2 b)。不到10%的hNu-positive细胞显示与抗体染色成熟神经元标记(MAP2和NeuN)移植部位或毗邻梗死边界区(图 3(一个))。移植细胞的一小部分(少于3%的hNu-positive细胞)显示与Darpp32抗体染色,GABA, GAD65/67(图 3(一个))。移植细胞也沾染了星形胶质细胞抗体(GFAP)和少突细胞(O4)标记,尽管染色细胞的数量极低(图 3 (b))。

此外,移植细胞强烈表达BDNF,诱发神经元分化的神经营养因子,在peri-infarct边界区(补充图。 3)。ep-iPSC-NPCs显示更高的BDNF蛋白表达在常氧和轻度缺氧条件下相比,成纤维细胞(补充图。 3 b)。之间没有差异BDNF表达ep-iPSC-NPCs常氧条件下和在缺氧条件下。

检查功能连通性的嫁接ep-iPSC-NPCs与宿主的大脑,我们首先进行了使用FG逆行神经示踪分析(图 4(一))。行为测试12周后,三个动物ep-iPSC-NPC组注射FG在苍白球。FG, hNu-double阳性染色细胞中观察到peri-infarct边界区。这表明嫁接ep-iPSC-NPCs与宿主组织和可能导致宿主神经网络的形成。此外,移植细胞的比例显示copositive SVP-38染色,突触前囊泡标记(图 4 (b)),这表明移植细胞参与突触传递。

评估神经功能ep-iPSC-NPC移植,议员研究在所有组( n = 3 每组)(图 4 (c))。汽车集团,议员振幅几乎没有发现老鼠的局部麻痹的四肢。议员振幅差异车辆和纤维母细胞组织的动物也不见了。相比之下,欧洲议会议员振幅大鼠前肢的ep-iPSC-NPC组高于汽车组的老鼠。议员振幅的大鼠后肢ep-iPSC-NPC组高于老鼠车辆和纤维母细胞组。增强的议员ep-iPSC-NPC组表明改善ep-iPSC-NPC移植后神经网络在大脑受损的老鼠。

我们接下来研究的内生影响嫁接ep-iPSC-NPCs MCAo大鼠。首先,我们调查了subventricular区的神经发生的变化(SVZ) ep-iPSC-NPC移植后在大脑受损。评估SVZ神经发生,双重免疫荧光染色法标记的增殖和迁移的神经前体细胞增殖细胞核抗原/ PSA-NCAM和BrdU /(克莱斯勒)进行大鼠SVZ的三个测试组( n = 5 每组)。增殖细胞核抗原/ PSA-NCAM双重免疫荧光染色法,在增殖细胞核抗原/的数字PSA-NCAM copositive细胞明显高于在组织的老鼠ep-iPSC-NPC比从其他组(图组 5(一个))。的数量BrdU /克莱斯勒copositive细胞ep-iPSC-NPC组显著高于其他组(图 5 (b))。这些发现表明,ep-iPSC-NPCs促进SVZ神经发生在大脑受损的中风后通过旁分泌机制。

调查的变化ep-iPSC-NPC移植术后炎症反应在大脑受损,免疫荧光染色法对小胶质标记(ED1和Iba-1)执行的三个测试组( n = 5 每组)。汽车组,众多ED1——Iba-1-positive细胞peri-infarct地区被发现。ED1——和Iba-1-positive细胞的数量没有不同的纤维母细胞组相比,车辆组。相比之下,ED1——的数量和Iba-1-positive细胞ep-iPSC-NSC组显著低于其他组(补充图。 4)。我们下一个调查的比例不同的小胶质表型M1-like使用双重免疫荧光染色法(间接宾语/ ED1)和M2-like (CD206 / ED1)小胶质细胞。的比例CD206 / ED1 copositive细胞被发现(图更高 6(一))而伊诺的比例/ ED1 copositive细胞低ep-iPSC-NPC组相比,纤维母细胞和车辆(图组 6 (b))。这些发现表明,ep-iPSC-NPCs不仅降低卒中后炎症,也促进了治疗过程在大脑受损。

调查astroglial疤痕形成的变化,神经元再生后中风的危险因素之一,在大脑受损后ep-iPSC-NPC移植,免疫荧光染色astrogliosis标记(GFAP)执行的三个测试组( n = 5 每组)(图 7(一))。汽车集团,大面积的GFAP-positive胶质疤痕在梗塞的面积被发现。GFAP-positive区域的平均面积和厚度没有车辆和纤维母细胞组之间差异。有趣的是,这两个的意思是GFAP-positive区域的面积和厚度显著降低ep-iPSC-NPC组相比其他组。这一发现表明,ep-iPSC-NPC预防中风后astroglial疤痕形成。

调查改变神经细胞死亡在ep-iPSC-NPSC移植,免疫荧光染色TUNEL和caspase-3 peri-infarct区域在每个MCAo大鼠进行的三个测试组( n = 5 每组)(图 7 (b))。TUNEL和caspase-3-positive细胞的数量没有不同的纤维母细胞组相比,车辆组。相比之下,TUNEL和caspase-3-positive细胞的数量显著降低ep-iPSC-NSC组相比其他组。这些发现表明ep-iPSC-NPC移植阻止正在进行程序性细胞死亡在大脑受损后中风。