1。介绍
腰痛(LBP)是一种常见的疾病,发病率高(
1 ),将一个巨大的经济负担强加给社会和家庭(
2 ]。枸杞多糖的患病率增加是由于人口的老化
3 ),椎间盘变性(IDD)被认为是与枸杞多糖(
4 ]。不幸的是,没有一个共同的治疗可以有效地修复或再生的结构和功能退化性椎间盘(试管)
5 ,
6 ]。因此,有必要制定IDD的一种新方法。
试管是由三部分组成:中央凝胶状的NP外multilaminate纤维环(AF),和软骨终板(
7 ]。NP是试管的最关键的部分之一,它可以提供一个合适的细胞外环境(NP细胞的增长和分泌功能
8 ]。因此,相信恢复退化NP可能重视IDD的治疗。函数和内生试管细胞数量的减少在电话过程中,导致细胞内源性修复的失败(
9 ]。间充质干细胞(MSC)的基础治疗为治疗IDD广阔的应用前景。骨骨髓来源MSC (
10 ),脂肪MSC (
11 ),人类脐cord-derived MSC (
12 ),和其他类型的干细胞(
13 )已经被用来治疗IDD。不幸的是,当地的微环境退化的试管,特点是过度紧张,酸性pH值,有限的营养和氧气(
2 ,
14 ,
15 ),受损细胞生存能力,细胞增殖能力,和生物合成能力的ECM (
16 ,
17 ]。2007年,Risbud et al。
18 ]证实人类NP内生祖细胞的存在。其他的研究进一步证实,这些内生NP-derived MSC (NPMSC)表现出更强的耐恶劣的微环境与其他类型的MSC (
19 ,
20. ]。NPMSC已得到越来越多的关注,显示非凡的再生退行性试管的前景
21 ]。
移植MSC的生存是一个主要的障碍MSC移植治疗(
2 ]。MSC移植无法改善当地的不利的微环境(
15 ]。scaffold-loaded细胞移植不仅可以移植细胞到目标位置,也为更好的生存创造一个合适的微环境移植MSC (
22 ]。由于水凝胶的流变和机械性能类似于本机NP (
23 ,
24 ),可注射水凝胶已成为首选材料NP修复。在这项研究中,我们旨在调查可注射水凝胶的再生效果结合NPMSC IDD的大鼠模型。一个示意性的研究是描绘在图的轮廓
1 。
图1
本研究的基本过程的示意图。NPMSC从尾骨的孤立试管的SD大鼠,并放大了体外。IDD模型归纳后21 g针,注射hydrogel-loaded NPMSC被移植到退化NP微量调节注射器。
![]()
2。材料和方法
2.1。动物保健和使用
七十名健康Sprague-Dawley (SD)大鼠(体重180 - 220克;年龄,3 - 4个月)是由江苏大学实验动物中心提供(许可证号。SCXK(超自然)2018 - 0012)。动物保健和使用遵循的指导方针由美国国立卫生研究院发表的实验动物。所有的实验都是批准的扬州大学动物保健和使用委员会制度。动物被饲养在一个受控环境(鼠盒
26
±
3
°
C
12:12 h光明/黑暗),相对湿度70 - 85%。实验动物并不局限于水和标准饮食。
2.2。隔离和NPMSC文化
主要NPMSC从尾骨的孤立试管对20只SD大鼠组织。戊巴比妥的老鼠被过量,和尾巴。尾骨的试管无菌和光学显微镜条件下收获。凝胶状NP组织样本是洗了三次磷酸盐(PBS)含1% penicillin-streptomycin (Gibco,医学博士,美国)和消化0.2%胶原酶II型(Gibco,医学博士,美国)解决方案在37°C 2 h。在800 g离心5分钟后,细胞颗粒在MSC培养基培养(Cyagen生物科学、广州、中国)补充20%胎牛血清(美国UT HyClone)和1%青霉素和链霉素在37°C公司为5%<年代ub>2湿润的气氛。媒介与细胞被暂停后1天;然后,媒介是完全改变了每周两次。的细胞通道1:3比80 - 90%的融合。后三个段落,NPMSC。
2.3。Immunophenotypic表征
按照评估标准国际社会提出的干细胞细胞治疗(ISCT) Tie2 NP-progenitor细胞表面标志和MSC表面标记CD73, CD90、CD105、CD34、CD45测量。同形像控件(美国新泽西州BD生物科学)被使用在每种情况下负控制。简而言之,
2
×
10
5
NPMSC与单克隆抗体主要孵化(CD105-phycoerythrin (PE), CD90-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) CD73-PE, CD45-FITC, CD34-PE,和Tie2-FITC(美国新泽西州BD生物科学))在黑暗中在室温下为30分钟。然后,细胞在500年与冷PBS和resuspended洗两次
μ L PBS产生单个细胞的解决方案,和比表面标记表达式使用流式细胞仪检测(FACSCalibur BD生物科学)。
2.4。多能干细胞分化
NPMSC multilineage分化潜力的成骨、脂肪形成的,chondrogenic分化。短暂,NPMSC resuspended密度
5
×
10
5
/
毫升
和播种6-well盘子。培养细胞达到80%融合时,细胞与成骨的培养,脂肪形成的,chondrogenic分化工具包(Cyagen生物科学、广州、中国)。根据制造商的指示,洗后用PBS和4%多聚甲醛固定20分钟,茜素红、油红O,阿尔新蓝时使用分化达到所需的天。荧光显微镜下观察染色区域(徕卡,位于德国)。
2.5。水凝胶的最佳浓度
VitroGel 3 d-rgd水凝胶是购自TheWell生物科学(美国新泽西州)。细胞计数Kit-8 (CCK-8、Dojindo、日本)和乳酸脱氢酶(LDH)测定工具包(Beyotime生物技术、海门、中国)是用于检测水凝胶的最佳浓度。直接与汉克的水凝胶的解决方案是混合(美国UT HyClone) 1: 0, 1: 1, 1: 2和1:3(水凝胶:汉克的,
v
/
v
在室温下)比率。NPMSC resuspended的密度
5
×
10
5
/
毫升
与不同浓度的水凝胶和混合的比例1:4。Hydrogel-loaded NPMSC培养了3、7和14天前的决心。在每个时间点,CCK-8溶液(10% CCK-8新鲜DMEM)添加和孵化37°C下5%的股份有限公司<年代ub>23 h。上层清液(100
μ L)收集和测量吸光度值在450海里。不同浓度的水凝胶的细胞毒性NPMSC使用LDH测定设备检测。上层清液收集在3、7和14天的吸光度值和测试由标450海里(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。
2.6。微观结构
如上面提到的结果,水凝胶与汉克的混合水凝胶的最佳浓度比;然后,液体介质是夹杂着稀释比例的水凝胶1:30分钟4在37°C。标本在真空冻干和切成小块的厚度1毫米。然后,分析的样本被涂上一层金和扫描电子显微镜(SEM)的加速电压5 kV (SUPPA 55、蔡司、德国)。
2.7。细胞增殖
细胞增殖,4
′
6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和5-ethynyl-2
′
脱氧尿苷(Edu) (Beyotime、海门、中国)染色用于体外三维培养(水凝胶组)或2 d板文化(对照组)。简单,细胞悬液和hydrogel-loaded NPMSC接种于96孔板(100
μ 信用证)。后1、4、8天文化后,细胞用4%多聚甲醛固定10分钟,水洗,然后,细胞与100年孵化
μ L DAPI在环境温度为5分钟。此外,在文化后8天,两组细胞与Edu孵化工作解决方案所描述的制造商的协议被消化后或释放。染色样品荧光显微镜下拍摄(奥林巴斯欧洲,德国汉堡)。ImageJ软件(美国国立卫生研究所的韦恩Rasband)是用于图像分析。三个随机选择的字段从三个样本用于计算。
2.8。免疫印迹
NPMSC混合水凝胶的最佳浓度和接种(2.4毫升/)6-well板被认为是水凝胶组,和NPMSC悬浮6-well板被认为是一个对照组。两组在MSC分化培养工具包(Cyagen生物科学、广州、中国)2周。预定时间到达时,获得的细胞和总蛋白提取里帕缓冲区中含1% PMSF冰上30分钟。浮在表面的蛋白质是通过离心20分钟在4°C,和蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸蛋白质化验设备(Beyotime生物技术研究所、海门、中国)。在10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳后,分离蛋白被转移到聚偏二氟乙烯膜(EMD微孔、马、美国)。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下2小时,然后孵化主要抗体12 h在4°C。主要的抗体如下:胶原蛋白II型(1:5000;Abcam,剑桥,英国),aggrecan (1: 1000;Abcam),
β 肌动蛋白(1:10000;ABclonal,武汉,中国)。洗涤三次后渐变20 Tris-buffered盐水和0.1%,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)标记的第二抗体(三一重工,武汉,中国)在室温下瓶2 h。乐队是可视化使用增强化学发光体系。蛋白质的相对数量使用ImageJ软件进行了分析。
β 肌动蛋白作为加载控制。
2.9。IDD模型归纳和NPMSC植入
SD大鼠IDD模型建立了根据该方法在我们之前的研究报告(
25 ]。简单地说,老鼠麻醉使用腹腔内注射50 - 80毫克/公斤戊巴比妥。与聚维酮碘消毒后,尾骨的(公司)5 - 6,Co6-7, Co7-8, Co8-9经皮穿刺的21 g针5毫米的深度。两周后,这些不同程度被分为四组:水凝胶+细胞组(Co5-6, hydrogel-loaded NPMSC注射),水凝胶组(仅Co6-7,水凝胶注入),PBS组(仅Co7-8, PBS注入),和细胞组(仅Co8-9, NPMSC注入),而Co4-5水平被指定为对照组。
可视化的生存状况移植NPMSC,注入NPMSC表达mCherry生成。制造商的协议后,当达到50%的融合,细胞转染了GV326慢病毒vector-mCherry (GeneChem、上海、中国)感染复数(MOI) 10、20、50、100。荧光显微镜是用来检测72 h后mCherry荧光蛋白的表达。考虑到转染效率和细胞损伤,
莫伊
=
One hundred.
被选为成功感染。NPMSC被转移到一个完整的介质后18 h的转染。2 g / mL后嘌呤霉素(美国密苏里州Sigma-Aldrich)筛查,稳定转染NPMSC被用于移植。微量调节注射器的31 g针小心地插入中间的圆盘,注入每一段的体积是2
μ l .注射过程推迟了大约5分钟,以减少泄漏(
26 ]。
2.10。体内跟踪
在一天和注射后30天,老鼠麻醉方法如上所述。预冷后摄像头,麻醉老鼠按顺序放置在体内成像系统(新)室和尾巴是放置在面板的中心。的新腔III(美国CA创建Xenogen)是用于检测信号强度mCherry荧光蛋白的注射级别(激发波长:587海里;发射波长:610海里)。荧光信号覆盖在老鼠的灰度和量化的意思
辐射
效率
光子
/
年代
/
兆瓦
/
c
米
2
±
年代
。
e
。
米
。
感兴趣的区域(ROI)通过生活图像软件(PerkinElmer)。被保险人ROI标记在Co5-6和Co8-9 NPMSC移植。总的ROI内发光从覆盖采购发光图像在新目录中。
2.11。影像学分析
评估椎间盘高度、侧片的尾骨的光盘被试运转,注射前,和1,2,4,8周后注射麻醉如上所述。两个独立的成像技术被蒙蔽的研究设计评估椎间盘高度指数(济)。根据汉等的方法。
27 ),济%计算使用以下公式:
济
%
=
postpunctured
济
/
prepunctured
济
×
One hundred.
%
。济的变化表示为济% (
接受
济
/
注射前
济
)是用于描述椎间盘高度变化。
核磁共振(3.0 t,通用电气、CT和美国)试运行,注射前,和1,2,4,8周后注射用于评估信号和结构变化。不久,老鼠麻醉50 - 80毫克/公斤腹腔注射戊巴比妥麻醉异氟烷吸入和维护的2%。t2加权像矢状得到以下设置:(a)快速自旋回波序列的时间重复(TR) 3000 ms和回波时间(TE) 45女士,(b) 9励磁和5厘米的视野,和(c)段厚度0.5毫米的0毫米差距。MRI图像是由两位放射科医生评估对使用核磁共振的研究设计也不清楚指数评估NP的补液组织(
28 ]。
2.12。组织学分析
核磁共振检查后,老鼠被一个超剂量腹腔注射戊巴比妥和尾巴收获4周和8周后注射。用甲醛固定标本,与10%乙二胺四乙酸溶液脱钙,嵌在石蜡中。部分是沾染了他,番红精O(所以)和甲苯胺蓝染色,然后在显微镜下拍摄。变性分数被两个独立观察员评估之前报道(
11 ,
28 ]。
2.13。肉眼观察的试管
在注射后8周,老鼠被杀如上所述和尾巴。与PBS洗后,手术刀片用于分隔相邻椎骨沿着中间的圆盘在荧光镜的指导。NP组织被拍到,分析了截面的面积ImageJ软件,这大致代表了NP的修复和再生。
2.14。终端原位dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定
试管部分被通过上述方法在3天后手术和注射后4周和8周;apoptosis-related DNA损伤被TUNEL染色评估。简而言之,在4%多聚甲醛溶液固定后的30分钟37°C, permeabilized在溶液中含有0.5% Triton x - 100为5分钟,并与PBS洗两次,部分与刚做好的TUNEL染色工作液在室温下(Beyotime、海门、中国)1 h在黑暗中。之后,部分被洗,沾着荧光染料DAPI (Beyotime、海门、中国)10分钟。结果被ImageJ荧光显微镜拍摄的照片和分析软件。
2.15。Immunofluorescent染色
老鼠被杀死如上所述,尾巴了。整体的标本试管与相邻椎体被收获,切成5
μ m与冷冻切片机(徕卡,位于德国)8周后注射。在4%多聚甲醛固定后30分钟,洗两次与PBS和屏蔽5%牛血清白蛋白1 h,组织部分被孵化,分别在一夜之间主要的抗体在4°C:兔多克隆anti-collagen II型和anti-aggrecan (Abcam 1: 100年,剑桥,英国)。与PBS洗涤后,幻灯片是孵化,分别与FITC-conjugated Cy3-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(ABclonal 1: 10000年,武汉,中国)二级抗体在黑暗中在室温下2小时。免疫染色结果,荧光显微镜拍下分析了Image-Pro + 6.0软件。
2.16。实时聚合酶链反应(rt - pcr)
量化的胶原蛋白II型和aggrecan mRNA水平使用rt - pcr进行8周后注射。总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。根据指示,PrimeScript RT试剂盒和SYBR预混料Taq交货(Vazyme生物科技、南京、中国)被用来抄写相对地RNA的互补和放大的互补。胶原蛋白II型的信使rna表达水平和aggrecan比较Ct计算的方法。引物序列表中列出
1 。
表1
引物用于逆转录定量聚合酶链反应。
基因
底漆/探针序列
胶原蛋白II型
5
′
-CATCCCACCCTCTCACAGTT-3
′
5
′
-ACCAGTTAGTTTCCTGCCTCTG-3
′
Aggrecan
5
′
-TCCACAAGGGAGAGAGGGTA-3
′
5
′
-GTAGGTGGTGGCTAGGACGA-3
′
β 肌动蛋白
5
′
-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3
′
5
′
-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3
′
2.17。统计分析
定量的数据被表示为
的意思是
±
标准
偏差
(SD)。SPSS软件(版本19.0对于Windows, SPSS,美国)被用来进行统计分析。多个独立团体的数据分析了单向方差分析。迷幻药的
t
以及用于分析两组的数据参数。当
p
值小于0.05,差异被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。评价孤立的细胞
细胞分离鼠尾试管组织了形状和长轴显示殖民地增长,表明坚持塑料(图的能力
2(一个) )。如图
2 (b) CD105,流式细胞仪鉴定细胞高表达(98.22%),CD90(97.54%),和CD73(97.55%)通常是积极的MSC和下级表达CD34(1.42%)和CD45(0.95%)在MSC是负面的,而细胞高表达Tie2 NP-progenitor细胞(81.76%),这是积极的。multilineage分化被感应到成骨的认证,chondrogenic,体外脂肪形成的血统(图
2 (c) )。所有结果表明,细胞与MSC ISCT所描述的的评估标准。
图2
核pulposus-derived鉴定间充质干细胞(NPMSC)。(a)孤立主要细胞提供形状和长轴显示殖民地增长;通过细胞纺锤状。(b) NPMSC表达式较高(> 98%)的MSC表面标记CD73, CD90、CD105和较低的表达式(< 2%)的造血干细胞表面标记CD34、CD45和更高的Tie2表达式(> 80%)。(c) NPMSC呈阳性茜素红、油红O、阿尔新蓝染色后诱导分化。白色的规模
酒吧
=
50
μ
米
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.2。适当的水凝胶浓度和水凝胶的微观结构
如图
3(一个) ,所有其他组没有明显的细胞生存能力不同于对照组除1:0
v
/
v
集团在第三天。尽管如此,细胞的生存能力1:2
v
/
v
组显著高于其他组在天7和14。此外,LDH释放反映了水凝胶的细胞毒性。1:LDH的0
v
/
v
组高于其他组,和数据具有统计上的显著差异。的LDH 1: 1
v
/
v
组和1:3
v
/
v
组高于对照组14天。但是没有显著区别1:2
v
/
v
组和对照组在每个时间点的LDH(图
3 (b) )。如数据所示
3 (c) 和
3 (d) ,水凝胶的浓度1:2
v
/
v
显示一个不规则的多孔结构和气孔连接这将促进细胞迁移。因此,水凝胶的最佳浓度NPMSC被确认为1:2
v
/
v
。
图3
适当的水凝胶的浓度和水凝胶的微观结构。(a)的增殖NPMSC培养在不同浓度的水凝胶。(b)不同浓度的细胞毒性为NPMSC水凝胶。(c)的扫描电镜图像1:2
v
/
v
水凝胶表面。(d)的横截面1:2
v
/
v
水凝胶。数据代表
的意思是
±
SD
;误差线代表测量6独立样本的标准偏差(
n
=
6
);
∗
p
<
0.05
与对照组相比,
#
p
<
0.05
相比之下,1:2
v
/
v
组。白色的规模
酒吧
=
One hundred.
μ
米
,蓝色的规模
酒吧
=
50
μ
米
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.3。细胞增殖和分化
NPMSC的增殖培养板和水凝胶是由细胞计数数量和Edu方法。两组的细胞数量逐渐增加在每一个时间点(图
4(一) )。两组之间没有显著差异在第四天的细胞增殖率;然而,水凝胶的细胞生长速率组显著高于对照组,第八天(图
4 (c) )。在8天后文化,Edu-positive细胞水凝胶组明显高于对照组(数字
4 (b) 和
4 (c) )。胶原蛋白II型和aggrecan特定细胞外基质(ECM)的NP细胞。胶原蛋白II型的相对蛋白质表达和aggrecan水凝胶组明显高于对照组(图
4 (d) )。
图4
细胞增殖和分化。(一)代表DAPI染色的2 d图像(对照组)和3 d(水凝胶组)培养NPMSC 1, 4,种植后8天。(b)代表图像的Edu染色2 d(对照组)和3 d(水凝胶组)培养NPMSC在种植后8天。(c)的增长率和Edu-positive率调查NPMSC文化在对照组和水凝胶组8天。(d)相对蛋白质含量的胶原蛋白II型和aggrecan对照组和水凝胶组。数据代表
的意思是
±
SD
;误差线代表测量的标准差3单独的样品(
n
=
3
);
∗
p
<
0.05
相比之下,水凝胶组。白色的规模
酒吧
=
50
μ
米
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.4。移植细胞存活,试管
可视化NPMSC体内移植的存活情况,新系统是用来检测后ROI的发光1天,注射后30天。如数据所示
5(一个) 和
5 (b) 发光,没有显著差异的定义ROI之间的水凝胶+细胞组和细胞组在注射后1天。光子的两组显著降低随着时间的推移,在水凝胶和ROI的发光+细胞的细胞组显著高于组在注射后30天。因此,它是表明水凝胶可以作为载体来支持NPMSC体内的长期生存。
图5
细胞保留在试管中。(一)代表图像的新第一天,注射后30天。(b)水凝胶的发光的柱状图+细胞组和细胞组在覆盖的ROI图像。ROI代表是一个蓝色的圆。H-gel +细胞组是水凝胶+细胞组。数据代表
的意思是
±
SD
;误差线代表测量的标准差3单独的样品(
n
=
3
);
∗
p
<
0.05
相比之下,水凝胶+细胞组。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.5。射线照相和MRI评价
注射后探索IDD的程度,济%计算。如数据所示
6(一) 和
6 (b) 济%保持稳定,对照组在每个时间点。济%在所有其他组明显低于对照组后注入。不同组之间没有显著差异在注射后1周和2周。水凝胶的济% +细胞和细胞组显著高于PBS组和水凝胶组在注射后4周和8周。此外,没有显著区别水凝胶+细胞组和细胞组在注射后2周和4周,但在8周的显著差异。
图6
不同群体的典型片和济%试运行,注射前,和1,2,4,8周后注射。(一)不同群体的射线照片。(b)济%用于定量评估椎间盘高度的变化。H-gel +细胞组是水凝胶+细胞组。所有数据都表示为
的意思是
±
SD
;误差线代表测量6独立样本的标准偏差(
n
=
6
);
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
与对照组相比,
#
p
<
0.05
,
#
#
p
<
0.01
相比之下,水凝胶+细胞组;
&
p
<
0.05
,
&
&
p
<
0.01
而细胞群。
(一)
![]()
(b)
![]()
MRI是用来评估NP的信号和结构性变化组织(数字
7(一) 和
7 (b) )。PBS组和水凝胶的MRI索引组低于水凝胶+细胞组和细胞组的2,4,8周后注射。此外,没有显著区别水凝胶+细胞组和细胞组1和2周后注入,但显著差异在4和8周后注射。
图7
不同组织的MRI图像和MRI指数。(一)典型的t2加权MRI图像不同的组织试运行,注射前,和1,2,4,8周后注射。(b) MRI指数应用于定量评估退行性椎间盘的补液和再生。H-gel +细胞组是水凝胶+细胞组。所有数据都表示为
的意思是
±
SD
;误差线代表测量6独立样本的标准偏差(
n
=
6
);
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
与对照组相比,
#
p
<
0.05
,
#
#
p
<
0.01
相比之下,水凝胶+细胞组;
&
p
<
0.05
,
&
&
p
<
0.01
而细胞群。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.6。组织学分析和宏观观察试管
他染色(图
8(一个) )表明,NP组织组织得非常好,在对照组每一点均匀注入。相反,NP组织被破坏甚至消失,房颤组织混乱,失去了PBS组同心层状结构和水凝胶组。NP组织几乎消失了,充满了纤维结缔组织在PBS组和水凝胶组8周后注射。NP和ECM分布的结构清晰可见的水凝胶+细胞组和细胞组,但ECM的数量和结构的水凝胶+细胞组比那些细胞的组。所以染色(图
8 (b) )表明,蛋白多糖含量在PBS组和水凝胶组显著降低,但水凝胶+细胞组和细胞组表现出更强的比PBS组和水凝胶组染色。此外,水凝胶染色+细胞组表现出强于细胞组。甲苯胺蓝染色显示,水凝胶+细胞组和细胞组表现出更多的NP软骨细胞和积极的蛋白多糖比PBS组和水凝胶染色组(图
8 (c) )。此外,水凝胶的染色强度+细胞组优于细胞组。所有其他组的组织学评分明显高于对照组在注射后8周,但水凝胶+细胞组的组织学得分低于细胞组(图
9 (c))。除了水凝胶+细胞组和对照组,细胞的组织学得分组优于其他组。
图8
他,所以,甲苯胺蓝染色不同的组。(一)代表他在4和8周后注射染色。(b)代表年代染色在4和8周后注射。(c)代表甲苯胺蓝染色在4和8周后注射。H-gel +细胞组是水凝胶+细胞组。白色的规模
酒吧
=
1
毫米
,黑色的规模
酒吧
=
50
μ
米
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
图9
不同组织的宏观观察和组织学得分。(一)宏观图像不同的组8周后注射。(b)髓核的相对面积8周后注射。(c)组织学得分8周后注射。H-gel +细胞组是水凝胶+细胞组。数据代表
的意思是
±
SD
;误差线代表测量6独立样本的标准偏差(
n
=
6
);
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
与对照组相比,
#
p
<
0.05
,
#
#
p
<
0.01
相比之下,水凝胶+细胞组;
&
p
<
0.05
,
&
&
p
<
0.01
而细胞群。规模
酒吧
=
1
毫米
。
(一)
![]()
(b)
![]()
如图
9(一个) 房颤形状规则和NP组织丰富,富含水对照组8周后注射。在PBS组和水凝胶组,房颤的结构无序,NP的面积明显减少,被纤维组织取代。虽然房颤组织明显厚和NP的面积明显减少,房颤和NP之间的边界清晰的水凝胶+细胞组和细胞组比PBS组和水凝胶组。如图
9 (b) ,相对区域的水凝胶+ NP组织细胞组和细胞组明显高于PBS组和水凝胶组。此外,水凝胶中的NP组织的相对面积+细胞组更大的比其他组对照组除外。
3.7。细胞凋亡分析
阐明针穿刺成型的影响,水凝胶在鼠尾盘,我们为NP细胞和NPMSC执行TUNEL染色。在手术后三天,TUNEL-positive其他组织细胞率明显高于对照组(图
10 () )。在注射后4周,TUNEL-positive细胞显著下降的速度在水凝胶和TUNEL-positive细胞率+细胞组和细胞组低于水凝胶组和PBS组(图
10 (b) )。NP组织的再生和疤痕组织的形成,TUNEL-positive所有组细胞率明显低于之前和各组之间没有明显差别(图8周后干预
10 (c) )。
图10
TUNEL染色不同的组。(一)代表图像和TUNEL-positive NP细胞组织的比例在3天之后的操作。(b)代表图像和TUNEL-positive NP细胞组织的比例在注射后4周。(c)代表图像和TUNEL-positive NP细胞组织的比例在8周后注射。H-gel +细胞组是水凝胶+细胞组。数据代表
的意思是
±
SD
;误差线代表测量6独立样本的标准偏差(
n
=
6
);
∗
p
<
0.05
与对照组相比,
&
p
<
0.05
相比之下,水凝胶+细胞组。规模
酒吧
=
200年
μ
米
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.8。免疫荧光和rt - pcr分析
胶原蛋白的蛋白质和mRNA表达II型和aggrecan发现8周后注射。有表情的胶原蛋白II型和aggrecan在对照组,水凝胶+细胞群,和细胞组(图
(11日) )。因为NP的正常结构消失在PBS组和水凝胶组,只有最小的区域的NP组织被发现阳性胶原蛋白II型和aggrecan(图
(11日) )。如数据所示
11 (b) 和
11 (c) ,定量分析是明显高于胶原蛋白II型和aggrecan水凝胶+细胞组和细胞组比PBS组和水凝胶组,但明显低于对照组。定量分析是高胶原蛋白II型和水凝胶aggrecan +细胞组比其他组对照组除外。
图11
免疫荧光和rt - pcr不同的团体。(一)免疫荧光检测胶原蛋白II型和不同群体的aggrecan 8周后注射。(b)免疫荧光染色法的定量分析。(c)基因表达的不同组织的胶原蛋白II型和aggrecan 8周后注射。数据代表
的意思是
±
SD
;误差线代表测量的标准差3单独的样品(
n
=
3
);
∗
p
<
0.05
,
∗
∗
p
<
0.01
与对照组相比,
#
p
<
0.05
,
#
#
p
<
0.01
相比之下,水凝胶+细胞组;
&
p
<
0.05
,
&
&
p
<
0.01
而细胞群。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
4所示。讨论
目前,保护和手术治疗常用于治疗IDD,但是这些方法只能缓解症状,甚至可能加剧相邻IDD的可能性(
6 ,
29日 ,
30. ]。细胞transplantation-based生物治疗可能更有利于修复和恢复试管的生物力学功能。虽然移植,自体NP细胞仍然可行,生产ECM,保留盘高度退化的人类在体外试管研究[
31日 ]。然而,几项研究表明,NP细胞失去了能够区分和合成ECM (
32 ),从而限制了应用程序。
MSC具有自我更新能力和multilineage分化;某些类型的MSC可以分化成nucleopulpocytes (NPCytes)和生产ECM的退化试管(
10 - - - - - -
13 ]。到目前为止,各种各样的MSC(已使用
10 - - - - - -
13 ,
33 ,
34 ),但严酷的微环境的退化性试管(
35 - - - - - -
37 )导致细胞生存能力和ECM的合成减少移植MSC (
38 ]。最近,NPMSC孤立从正常和退化NP组织并显示更好的扩散和更好的适应严酷的试管微环境的能力(
39 ,
40 ]。因此,再生IDD NPMSC可能有相当大的潜力。在目前的研究中,细胞与NP有以下特点:(1)出现纺锤状附着生长和生长在殖民地的形成,(2)更高的CD73表达式,CD90、CD105(> 95%)和低表达CD34、CD45(< 5%),(3)高(> 80%)的表达式NP-progenitor Tie2细胞表面标志,和(4)multilineage分化潜能。这些特点符合规定的标准由ISCT MSC。结合分离方法(
41 ,
42 ],immunophenotypic表征[
9 ),和细胞形态(
43 ,孤立的细胞被NPMSC确实。
体外和体内动物实验已经证明,MSC在以下方面发挥其再生效果:(1)微分NPCytes,(2)激活内源性细胞,(3)产生抗炎效应(
44 - - - - - -
46 ]。在目前的研究中,x射线、MRI和肉眼观察结果证明了再生移植NPMSC的有效性。组织学染色结果还证实,试管与移植更多的常规试管结构和ECM NPMSC礼物。免疫荧光和rt - pcr的结果进一步证实胶原蛋白II型的表达式和aggrecan NPMSC-transplanted组(水凝胶+细胞组和细胞组)显著高于组没有NPMSC (PBS组和水凝胶组)。此外,移植的移植NPMSC幸存试管至少30天可视化的新系统。这些结果表明,NPMSC可以生存和生产在移植的退行性试管再生效果。
NPMSC有可能分化成NPCytes [
34 ),但严酷的微环境退化的试管构成了重大挑战,确保植入细胞的生存和功能。一些研究甚至表明,MSC注射没有支架没有再生效应(
47 ]。注入NPMSC试管组织展示了其再生能力退化的试管在某种程度上以前的和现在的研究(
34 ]。然而,成功的细胞疗法显著障碍依然存在,如泄漏MSC试管环境,骨赘形成,没有提高试管高度(
48 ]。因此,首选项可以封装MSC为载体来保护细胞泄漏和提供一个合适的环境来支持MSC扩张和分化
49 ]。出于这个原因,水凝胶被认为是理想的和受欢迎的选择负载细胞。
尽管一些研究集中在研究试管细胞和MSC移植治疗IDD [
10 ,
13 ,
34 ),本研究是第一个将同种异体NPMSC和可注射水凝胶治疗IDD。多项研究表明,支架刚度更有利于NP-like分化较低(
50 ]。在这项研究中,与3 d RGD肽多糖水凝胶改性,可模仿的天然ECM NP的条件,为细胞提供结合位点。RGD肽创建cell-adhesive水凝胶的结构,极大地提高了长期细胞生存能力在3 d的文化
51 ]。体外研究的结果表明,水凝胶浓度1:2
v
/
v
是最适合细胞增殖。这可能归因于这样一个事实:高交联水凝胶可以阻碍营养物质运输,但是低交联水凝胶相对刚性为细胞提供一个好的脚手架。一些研究发现,3 d文化和球形细胞形态学可以促进加载的可行性和分化细胞(
52 ,
53 ]。目前的研究也证明了水凝胶能促进NPMSC体外增殖和诱导分化细胞计数和量化分析的结果证实了胶原蛋白II型和aggrecan。细胞跟踪的结果进一步表明,发光的ROI水凝胶+细胞组显著高于细胞组,水凝胶,TUNEL-positive细胞+细胞组低于细胞组。这些结果表明,水凝胶作为载体在目前的研究可以支持NPMSC体内的长期生存和诱导NPMSC分化成NP细胞。
ECM的数量和水合状态的NP的重视的功能正常的试管。有增加胶原蛋白II型的表达式和aggrecan水凝胶+细胞组与细胞组。MRI指数可以被认为是一种间接指标来反映NP的水化状态组织。还有一个MRI指数明显高于水凝胶+细胞组与细胞组。然而,水凝胶本身没有再生NP组织见水凝胶组。这些结果表明水凝胶能促进移植的再生效果NPMSC加强ECM合成,和本研究中使用的水凝胶可增加移植的效果NPMSC退行性试管的水合作用。此外,本研究是初步的,仍有一些局限性。首先,使用IDD的老鼠模型不能完全反映人类IDD的自然;它可能是使用大型动物模型更具有代表性。第二,没有相关研究水凝胶的力学性能,这是试管的分散压力的关键。 Third, short experimental duration of this study is insufficient to reflect the complete effect of the hydrogel-loaded NPMSC transplantation on the repair of degenerative IVD; future studies should extend the experiment duration to a longer time.