1。介绍
肺有一个复杂的结构与主要上皮成分的差异。一些细胞类型,如基底细胞,细胞,俱乐部bronchioalveolar干细胞,肺泡上皮II型(ATII),和远端肺祖细胞,也被识别和特征为内源性干细胞和祖细胞的上皮细胞。这些细胞受损组织再生中发挥了关键作用[
1 - - - - - -
3 ]。最肺泡的远端地区包括我(ATI)和ATII肺泡上皮细胞类型。ATI占据了绝大多数的肺泡和气体交换是必不可少的。ATII分泌表面活性剂和肺泡的维护至关重要。ATII作为内源性干细胞和祖细胞在肺泡,导致肺泡修复ATII和随后的扩散分化到ATI后肺损伤(
1 ,
2 ]。
最近,再生医学生物学和肺肺疾病的继续进步。肺癌生物学术语“干细胞”指的是内源性祖细胞,多能干细胞,间充质基质细胞和内皮祖细胞细胞疗法制剂(
4 ]。努力专注于各种不同的应用程序等多能干细胞的胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(万能)。这些应用程序包括疾病建模、药物发现、组织再生和干细胞疗法(
5 ]。尽管干细胞疗法使用由万能干细胞分化细胞是具有挑战性的
6 ),这种疗法被认为是终极目标(
7 ]。
几组报道成功的方法诱导分化的人类和小鼠气道上皮细胞的细胞则包括近端和远端上皮细胞,使用各种协议(
8 - - - - - -
13 ]。ATII诱导分化,大部分的研究用胚状体的身体(EB)播种或逐步分化方法
14 - - - - - -
16 ),实现额外努力去提高分化效率。
在体外 多能干细胞分化方法包括单层文化定义矩阵(分离播种方法),coculture异形的细胞类型,和一个EB播种方法。海尔哥哥播种方法是高度可靠和常用的
17 ,
18 )首次报道以来,作为一种技术
在体外 细胞分化诱导小鼠胚胎性癌(ECCs) (
19 ]。诱导分化方法逐步分化为ATII利用EB的流程,明确内胚层(DE),前前肠内胚层(AFE)和ventralized AFE (VAFE)形成和分化到ATII [
14 ]。然而,分化成ATII的效率不同,可能的原因包括变量维护诱导后细胞的分化状态,剩余未分化细胞分化后的细胞则的存在。基因表达和蛋白质合成变化由于各种影响,如压扁的细胞在传统的二维文化(
20. ,
21 ]。近年来,三维细胞培养了(
22 和,可以更好地维持分化细胞的形态和功能(
22 ,
23 ]。人工基底膜,一个复杂的混合多种蛋白质的细胞外基质(ECM)和相关分子,广泛用于这个目的(
24 ]。另一方面,一定数量的未分化的细胞则留在iPSC-derived分化细胞数量。未分化的小鼠则让衍生品致瘤的分化,甚至少量的未分化的小鼠细胞可能导致畸胎瘤的形成
在活的有机体内 (
25 ]。(提出方法减少残余的未分化细胞
26 )和大致分为收集分化细胞表达分化标记,如sorting-based方法和方法去除未分化的细胞。
bromodomain (BRD)和extraterminal域(打赌)蛋白质已经针对控制癌细胞增长(
27 ]。BRD是一种蛋白质域识别乙酰化组蛋白赖氨酸残留物和功能集中调控蛋白和控制染色质结构和基因表达
28 ]。BRD2、BRD3 BRD4,和BRDT打赌家族蛋白质BRD重复序列和一个特定的终端序列(
29日 ]。这些蛋白质扮演了一个重要的角色在不同的细胞过程,如炎症相关的基因表达,细胞分裂,和病毒-宿主相互作用[
27 ]。BRD4 JQ1,选择性小分子抑制剂,是一种低分子量化合物渗透细胞膜和竞争性抑制的绑定BRD蛋白质(特别是BRD4)组蛋白的乙酰化赖氨酸残基
30. ]。JQ1抑制细胞增殖的肿瘤细胞来源细胞系体外和体内,主要由表达下调的表达
cMYC (
31日 ,
32 ]。在ESCs和间充质干细胞,多能许多基因的表达减少赌抑制使用JQ1 [
33 ,
34 ]。因此,JQ1预计将适用于消除残余的未分化的细胞则(
26 ]。
在本文中,我们提出一个新颖的方法来消除差异的小鼠则对高效分化成ATII打赌抑制。我们调查是否未分化的小鼠则被选择性地消除使用介质与JQ1 ATII分化后补充协议。
2。材料和方法
2.1。细胞系和文化的小鼠,小鼠肺上皮的细胞则II型细胞
鼠iPSC线,iPS-MEF-Ng-20D-17 (20 d-17) (
35 ),是由日本提供下边了BRC通过国家生物工程/艾湄湾,日本。小鼠被维护在一个未分化状态的细胞则0.1% gelatin-coated组织培养菜没有血清和馈线细胞使用ESGRO完整+克隆年级中等(微孔、Billerica MA)。细胞通过与Accutase(微孔)和山肩每3 - 4天。小鼠肺上皮II型细胞系,MLE12,从写明ATCC购买(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和培养在打击(氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌激素和硒)介质(RPMI 1640年,2%的边后卫,胰岛素(5
μ 转铁蛋白(10 g / mL)
μ g / mL),亚硒酸钠(30 nM),氢化可的松(10海里),
β 雌二醇(10 nM),玫瑰(10海里))。细胞通过与Accutase(微孔)和山肩每3 - 4天。
2.2。小鼠iPSC体外分化成ATII <斜体> < /斜体>
小鼠细胞则被诱导分化成ATII如前所述[
14 - - - - - -
16 ),与修改。100年一千万能resuspended
μ L整除的分化培养基(DM) (D-MEM(高葡萄糖);Wako,大阪,日本)补充100更易与L不必要的氨基酸(Gibco,宏伟的岛,纽约),2更易/ L
l 谷氨酰胺(Gibco), 0.1更易与L 2-mercaptoethanol (Gibco), 50 U /毫升青霉素,50
μ 和光)g / mL链霉素(kouichi含15%胎牛血清(的边后卫;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和培养在96 -康宁合演超低附件多井板块(Sigma-Aldrich) 2天。接下来,个人拟胚体(EBs)镀0.1% gelatin-coated组织文化在DM菜含有15%的边后卫1天。分化成明确的内胚层(DE),包含0.2%的媒介改变了DM的边后卫补充20 ng / mL苯丙酸诺龙(研发系统、明尼阿波利斯、MN)和10 ng / mL Wnt3a(研发系统)和培养4天每天介质的变化。前前肠内胚层(AFE),介质改变DM含有0.2%的边后卫,100 ng / mL的大脑(研发系统),和5
μ M SB431542 (Tocris生物科学,英国布里斯托尔)和培养2天日常媒介的变化。ventralized AFE (VAFE),介质改变DM含有0.2%的边后卫,20 ng / mL Wnt3a, 5 ng / mL纤维母细胞生长因子(FGF) 10(研发系统),5 ng / mL角质细胞生长因子(KGF)(研发系统),和5 ng / mL表皮生长因子(EGF)(研发系统)和培养7天每天介质的变化。ATII,介质改变DM含有0.2%的边后卫,20 ng / mL Wnt3a, 5 ng / mL FGF-10 5 ng / mL KGF然后孵化与日常媒介变化(图10天
1(一) )。
图1
(a)差异化协议ATII使用派生的胚状体身体播种方法和逐步分化方法。(b)定量聚合酶链反应分析(第七天)(
n
=
5
)。的表达
趋化因子受体Cxcr4 ,
Foxa2 ,
Sox17 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。表达水平与未分化的细胞则比较(天0)。
∗
P
<
0.05
。(c)相衬显微镜的图像和免疫荧光图像FOXA2的德(第七天)。酒吧规模:100
μ m。(d)定量聚合酶链反应分析AFE(9天)(
n
=
4
)。的表达
Pax9 ,
Tbx1 ,
Sox2 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。表达水平与未分化的细胞则比较(天0)。
∗
P
<
0.05
。(e)相差的形象和免疫荧光图像PAX9 SOX2在AFE(9天)。酒吧规模:100
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
2.3。RNA提取和实时逆转录聚合酶链反应
收获细胞RNA提取的时间和特定的标记在每一个分化阶段补充图所示
1 。总RNA分离使用RNeasy工具包(试剂盒、希尔登,德国)和合成第一链cDNA从500 - 1000 ng总RNA使用PrimeScript RT大师混合(豆类、志贺、日本)根据制造商的手册。定量实时聚合酶链反应(qPCR)中执行每个样本重复使用雷鸟探针qPCR混合(Toyobo、东京、日本)和TaqMan基因表达分析(应用生物系统公司,培育城市,CA)与CFX96实时系统(Bio-Rad大力神,CA)。所有反应都始于95°C的周期1分钟,其次是40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。检测到基因的TaqMan基因表达分析标识符Mm01996749_s1 (
趋化因子受体Cxcr4 ),Mm01976556_s1 (
Foxa2 ),Mm00488363_m1 (
Sox17 ),Mm03053810_s1 (
Sox2 ),Mm00440629_m1 (
Pax9 ),Mm00448949_m1 (
Tbx1 ),Mm00447558_m1 (
Nkx2-1 ),Mm00485928_m1 (
Atxn1 ),Mm00488144_m1 (
Sftpc ),Mm00455678_m1 (
Sftpb ),Mm03053917_m1 (
Klf4 ),Mm00487804_m1 (
Myc ),Mm03053917_g1 (
Pou5f1 )和Mm99999915_g1 (
Gapdh )。每个基因的表达水平是规范化的
Gapdh 。
2.4。免疫荧光分析
这些细胞被固定在3.7%福尔马林/磷酸盐(PBS) 15分钟,permeabilized 15分钟0.2% Triton x - 100 / PBS。接下来,细胞被封锁10%正常山羊血清屏蔽解决方案(向量实验室,伯林盖姆,CA;s - 1000) / PBS 15分钟,然后沾主要抗体室温60分钟。接下来,这些细胞被沾染了二次抗体室温为60分钟,然后安装VECTASHIELD Hardset不变色安装介质与DAPI(向量实验室,h - 1500)。这些细胞被沾染了以下主要抗体:兔子anti-forkhead盒蛋白A2 (FOXA2)抗体(1:300;Abcam,剑桥,英国;ab108422),兔子anti-SRY-box 2 (SOX2)抗体(1:100;Abcam;ab97959),鼠anti-paired盒9 (PAX9)抗体(1:100;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA; sc-56823), rabbit anti-transcription termination factor 1 (TTF1) antibody (1 : 200; Abcam; ab76013), rabbit anti-prosurfactant protein C (pro-SPC) antibody (1 : 100; Abcam; ab170699), and rabbit anti-pro/mature surfactant protein B (pro-SPB/SPB) antibody (1 : 100; Abcam; ab40876). Stained cells were visualized with the following secondary antibodies: Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG (1 : 300; Invitrogen, Carlsbad, CA; A11036) and Alexa Fluor 568 goat anti-rat IgG (1 : 300; Life Technologies, Carlsbad, CA; A11077). Fluorescent photographs were acquired using the confocal laser scanning microscope FSX100 (Olympus, Tokyo, Japan).
2.5。流式细胞术分析分化VAFE ATII
这些细胞被分离与Accutase 15分钟。分离细胞被稀释1%牛血清白蛋白/ PBS和离心机在900转4分钟。细胞颗粒在PBS和阻塞resuspended纯化鼠anti-mouse CD16 / CD32(鼠标BD Fc块)(1:50;加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,;5543142)10分钟在冰上。细胞与Cytofix permeabilized和固定/ Cytoperm固定和透化作用的解决方案(BD生物科学;51 - 2090 kz) 20分钟,30分钟主要抗体孵育,而且,如果有必要,二级抗体孵育30分钟在冰上。分析了这些细胞在FACSAria二流式细胞分析仪(BD生物科学)。量化TTF1-positive细胞,这些细胞被染色用鼠标anti-TTF1抗体结合APC (1: 50;Abcore,雷蒙娜,CA; AC12-0362-03). An anti-mouse IgG1 isotype control antibody (APC) (1 : 50; Abcore; 1A-632) was used as an isotype control. For pro-SPC, the cells were stained with a rabbit anti-pro-SPC antibody (2 : 50; Abcam; ab170699), goat anti-rabbit IgG (APC) (1 : 50; Abcam; ab130805), and an anti-rabbit IgG isotype control antibody (APC) (1 : 50, Abcam; ab130805).
2.6。酶联免疫吸附测定细胞培养上清液的程控
收集细胞培养上清液;这时,一个夹心酶联免疫吸附试验(Cloud-Clone Corp .,凯蒂,TX)是用于程控测量,根据制造商的协议。样品和标准化验在重复使用CFX96实时系统(Bio-Rad)。
2.7。JQ1在未分化的细胞则和MLE12抑制细胞生长的影响
细胞生存能力评估与预混料WST-1细胞增殖试验系统(豆类、东京、日本)。20 d-17未分化的细胞被播种密度
2。0
×
10
3
在96孔板细胞/好。媒介改变了每2天,JQ1 (Sigma-Aldrich)添加在第二和第四天播种后的浓度0,0.05,0.1,0.2,0.5,1和2
μ m .测量进行的第六天,活细胞定量评估。预混料添加WST-1试剂和细胞孵育1小时。吸光度的决定是基于甲瓒产品光学密度与参考吸光度在650海里(450海里)使用一个微型板块读者(iMARK Bio-Rad)。WST分析也用于MLE12细胞而不是分化细胞的最小抑制浓度与未分化的细胞则JQ1。MLE12细胞被播种密度
2。0
×
10
3
在96孔板细胞/好。
2.8。抑制未分化的多能性细胞则通过JQ1
20 d-17未分化的细胞被播种密度
5.0
×
10
3
细胞/在12-well盘子。播种两天后,0.2
μ M JQ1补充道。总RNA是孤立的第二天,第二天,和变化
Klf4 ,
Pou5f1 ,
Sox2 ,
cMyc 被qPCR测量。
2.9。sds - page及免疫印迹分析
20 d-17未分化的细胞被播种密度
1。0
×
10
5
细胞在10厘米。播种两天后,0.2
μ M JQ1添加24小时。根据上述条件培养细胞治疗;然后,蛋白质提取使用radioimmunoprecipitation分析缓冲区(# 9806,细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,MA)。总蛋白分离,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),其次是免疫印迹。西方墨点法进行与ChemiDoc™成像系统(Bio-Rad实验室,Inc .)。蛋白信号的量化进行了实验室使用图像软件,根据制造商的协议(Bio-Rad实验室,Inc .)。主要抗体是anti-Brd4(稀释1:2000)(Abcam ab128874)。二次抗体是anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶(合)共轭(1:2000年,细胞信号技术,Inc ., 7074)。蛋白质是可视化使用增强西方闪电®Plus-ECL(珀金埃尔默公司,沃尔瑟姆,妈,NEL104001EA),根据制造商的建议。
2.10。三维文化分化ATII人工基底膜和JQ1
26天,与Accutase分化细胞分离,分离单个细胞收集,并在三维细胞培养基底膜基质(康宁,康宁,纽约),所述[
36 ),与修改。总之,基底膜基质,享年80岁
μ L /厘米2 是传播和孵化37°C 30分钟。SAGM分离细胞培养基(Lonza, Verviers,比利时)含2%人工基底膜(卷/卷)被播种在固化凝胶。Y27632 Rho-associated蛋白激酶的抑制剂,SB431542添加额外的因素(
11 ,
37 ,
38 ]。细胞被播种密度
2。0
×
10
5
细胞/在6-well盘子或
1。5
×
10
6
细胞在10厘米菜/菜。SAGM培养基是改变每2天。JQ1浓度为0.2
μ 米也在天28日和30去除残留的未分化的细胞则。培养细胞收获40天。信使rna表达水平测定在26 - 40天。
2.11。透射电子显微镜法
分化细胞被固定为2.5%戊二醛在pH值为7.0 0.1磷酸盐缓冲剂1小时在室温下,紧随其后的是postfixation 1%四氧化锇在0.1磷酸盐缓冲剂1小时在室温下。洗后用0.15磷酸盐缓冲剂,标本在乙醇脱水系列从25到100%和嵌入Quetol 812(安全卫生EM、东京、日本)。样本用玻璃刀切割的超微切片机和poststained醋酸双氧铀及柠檬酸铅。透射电子显微镜分析了日立h - 7000(日立高新技术公司,东京,日本)。
2.12。统计分析
所有数据都来自至少三个独立的实验。所有的值表示为
的意思是
±
标准
偏差
。所有使用SAS9.4进行了统计分析,显著性水平为5%(双尾)。重复测量数据被用于这项研究。然而,由于细胞保存状态和通道数量可能影响研究结果,我们使用了一个线性混合模型。限制使用最大似然估计。个人识别和时间包含在随机效应模型,和时间是包含在模型作为一个固定的效果。协方差结构假设自回归的关联。测量的点之间的比较,我们使用Dunnett-Hsu多路复用的方法调整。在同一点进行比较,我们使用了Tukey-Kramer调整多路复用的方法。
3所示。结果
3.1。分化的小鼠则ATII
基于先前的报道(
14 - - - - - -
16 ),分化的小鼠则与逐步ATII在体外诱导分化方法生成DE, AFE VAFE,随后ATII(图
1(一) )。EB形成后,德接触引起的细胞激活素A和Wnt3a 4天。信使rna表达水平的标志
趋化因子受体Cxcr4 ,
Foxa2 ,
Sox17 增加与未分化的细胞则在7天。的激活素A和Wnt3a DM含有0.2%的边后卫(媒介)诱发更强的分化成(图
1 (b) )。显微镜下,分化细胞扩散到EB, FOXA2积极细胞染色(图
1 (c) )。AFE的分化细胞DE细胞接触引起的‘诺金’和SB431542 2天。AFE的信使rna表达水平标记
PAX9 和
Tbx1 增加,
Sox2 显示另一个增加9天(图
1 (d) )。天7和9之间的比较
PAX9 继续增加,
Tbx1 认为是一个特殊的标记甲状腺中而不是肺AFE标记(
39 ),几乎保持不变。细胞分化成AFE显示阳性染色PAX9和SOX2(图
1 (e) )。
从AFE VAFE细胞的分化细胞被Wnt3a诱导,FGF-10 KGF、EGF 7天。的信使rna表达水平
Nkx2-1 和
Atxn1 最具代表性的标记表明VAFE,增加16天(图
2(一个) )。特别是,
Nkx2-1 并不表示处于未分化状态0天,而其表达观察7天,随着时间的增加。细胞分化成VAFE TTF-1彩色正面(图
2 (b) )。此外,流式细胞仪分析显示
36.2
±
5.9
%
总细胞的人口呈阳性TTF-1(图
2 (c) )。从VAFE细胞诱导分化ATII Wnt3a, FGF-10, KGF 10天。
图2
(一)定量聚合酶链反应分析VAFE(16天)(
n
=
4
)。的表情
Nkx2-1 和
Atxn1 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。表达水平的
Nkx2-1 和
Atxn1 比较与VAFE(16天)。
∗
P
<
0.05
。ND:没有检测到。(b)相衬显微镜的图像和免疫荧光图像的TTF1 VAFE(16天)。酒吧规模:100
μ m。(c)流式细胞术分析TTF1表达VAFE(16天)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
表面活性剂的信使rna表达水平蛋白C (
Sftpc) 和表面活性剂蛋白B (
Sftpb) 基因增加了26天(图
3(一个) )。既不
Sftpc 也不
Sftpb 表示直到9天,之后呢
Sftpc 表达式是通常会随着时间的推移而增加。23天,
Sftpb 表达式被暂时下降然后显示出强劲增长26天。细胞分化成ATII彩色积极pro-SPC和pro /成熟SPB(图
3 (b) )。此外,SPC的浓度在细胞上清液(图增加
3 (c) )。VAFE Nkx2-1表达,一个特殊的标记,是减少了,但保持在26天(图
3 (d) )。在这一点上,各种细胞组混合在盘子里。流式细胞仪分析显示
17.1
±
1。5
%
收集细胞的人口呈阳性pro-SPC(图
3 (e) )。这些数据表明,未分化的小鼠则部分分化成ATII逐步分化方法报道之前(
14 - - - - - -
16 ]。
图3
(一)定量聚合酶链反应分析ATII(26天)(
n
=
5
)。的表情
Sftpc 和
Sftpb 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。表达水平相比ATII(26天)。
∗
P
<
0.05
。(b)相差的形象和免疫荧光图像pro-SPC赞成/成熟SPB ATII(26天)。酒吧规模:100
μ m。(c)程控文化上层清液的酶联免疫吸附试验(
n
=
3
)。
∗
P
<
0.05
。ND:没有检测到。(d)定量聚合酶链反应分析ATII(26天)(
n
=
3
)。的表情
Nkx2-1 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。表达水平相比VAFE(16天)。ND:没有检测到。(e)流式细胞术分析pro-SPC ATII(26天)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.2。抑制增殖和未分化的细胞则通过JQ1的多能性
我们还研究了是否未分化的小鼠则被选择性地消除使用介质补充后与JQ1 ATII差异化协议的实现。首先,确认JQ1未分化的细胞则和MLE12的抑制细胞生长的影响,一个WST试验。细胞死亡的细胞则是诱导JQ1浓度为0.2
μ 米或更多(图
4(一) )。0.2管理
μ M JQ1没有细胞毒性对MLE12(图
4 (b) )。接下来,探讨抑制未分化的多能性细胞则通过JQ1,变化
Klf4 ,
Pou5f1 ,
Sox2 ,
cMyc 被证实。每个人的表达下降0.2添加后的第一天
μ M JQ1然后进一步减少第二天(图
4 (c) )。此外,确认变化BRD4, JQ1管理未分化的细胞则,导致蛋白表达降低BRD4,通过免疫印迹分析(图所示
4 (e) )。
图4
(a)的影响在WST-1 JQ1在未分化的细胞则还原电位(
n
=
3
)。未分化的细胞则是处理0,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0
μ M JQ1。
∗
P
<
0.05
。(b)在MLE12 JQ1对WST-1还原电位的影响(
n
=
3
)。未分化的细胞则是对待JQ1 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0
μ m . (c)在未分化的细胞则定量聚合酶链反应分析(
n = 4)。的表情
Klf4 ,
cMyc ,
Pou5f1 ,
Sox2 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。未分化细胞的表达水平与(0)。
∗
P
<
0.05
。(d)定量聚合酶链反应分析(
n
=
3
)。的表情
Pou5f1 和
Sox2 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。
Pou5f1 和
Sox2 信使rna表达水平降低。(e)免疫印迹分析,未分化的细胞则,与BRD4蛋白的表达。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.3。维护ATII和删除剩余未分化的细胞则
26天(图
1(一) ),分化的细胞恢复酶治疗Accutase与基底膜基质细胞分离解决方案和三维培养开始。JQ1也添加到去除残留的未分化的细胞则(图
5(一个) )。三组细胞,获得26天,以及每天40 / JQ1(-)和40 / JQ1(+)细胞,比较和研究。40天,mRNA的表达水平
Sftpc 和
Sftpb 在三维显示维护文化(40天/ JQ1(-))在同一水平26天,与表达式进一步增加了添加JQ1(40天/ JQ1(+))(图
5 (b) )。多能性的信使rna表达水平标记
Klf4 ,
Pou5f1 ,
Sox2 ,
cMyc 还测量了,
Pou5f1 和
Sox2 被发现是减少JQ1(图
4 (d) )。显微镜检查时,基底膜基质细胞生长在三维文化显示一组细胞形成的球状体,并表示pro-SPC和pro - /成熟SPB(图
5 (c) ),以及Nanog-GFP-positive细胞,从而表明剩余未分化的细胞则被JQ1(图镇压
5 (d) )。电子显微镜分析显示细胞质中的结构类似于lamellar-like机构,专门针对ATII(图
5 (e) )。此外,流式细胞仪分析显示
39.4
±
16.8
%
总细胞的人口呈阳性pro-SPC(图
5 (f) )。这些数据表明,三维文化与JQ1有效去除残留的未分化的细胞则启用。
图5
(a)差异化协议维护ATII JQ1和删除剩余未分化的细胞则。(b)定量聚合酶链反应分析(
n
=
4
)。的表情
Sftpc 和
Sftpb 信使rna。表达率归一化的水平
Gapdh 表达式。表达水平与26天。
∗
P
<
0.05
。三个单元组,26天,天40 / JQ1(-),和天40 / JQ1(+),进行了比较。(c)相差的形象和免疫荧光图像pro-SPC和pro - /成熟SPB 40天。酒吧规模:70
μ m。(d)相差和荧光图像的Nanog-GFP 40天。Nanog-GFP-positive细胞减少JQ1-administered组(40天/ JQ1 (+))。酒吧规模:100
μ m。(e)透射电子显微镜的分化ATII 40天。层状的身体,就像结构观察(箭头)。比例尺:2
μ m。(f)流式细胞术分析pro-SPC 40天。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
4所示。讨论
4.1。分化的小鼠则ATII
所示的小鼠iPSC第20行d-17分化成ATII 26天的时间(天0-26)EB播种和逐步分化方法的使用。ATII的存在主要是证明了mRNA的表达
Sftpc 和pro-SPC蛋白表达。此外,mRNA的表达
Sftpc 和
Sftpb 也证实,17%的细胞阳性pro-SPC 26天。一些报告表明,人类和小鼠细胞则可以被诱导分化成气道上皮细胞,包括近端和远端上皮细胞(
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13 ]。大多数报告被诱导分化成ATII,和基础的分化培养基添加剂营养因素进行了调查。特别添加的营养因素,激活素A和Wnt3a,被用于诱导分化成DE。节点和规范Wnt信号通路来指定内胚层层(协同工作
40 ]。诱导分化成AFE,‘诺金’和SB431542。绿色等的报告
14 和Longmire et al。
39 ]表明,分化成AFE的双重抑制诱导骨形态形成蛋白和转化生长因子-
β 信号。AFE进入肺部祖细胞的分化,一些分子和信号通路,如节点、转化生长因子-
β 视黄酸,骨形态蛋白,FGF,缺口,需要和Wnt,更好地理解(
40 ]。因此,各种感应方法AFE后使用。可能需要检查每个细胞株。参照之前的报告(
14 - - - - - -
16 ),四个营养因素,Wnt3a FGF-10, KGF, EGF,被用来诱导分化AFE VAFE,和三个营养因素,Wnt3a, FGF-10, KGF,被用来诱导ATII VAFE在这个研究。虽然不同的细节,比如每一个添加的因素和浓度之间的潜伏期存在我们的研究和先前的研究,小鼠iPSC行(20 d-17)可能会分化成ATII 26天。然而,进一步改进提高分化效率ATII是必需的。
4.2。保持分化ATII状态和删除剩余未分化的细胞则
细胞分化成ATII 26天的时间是在三维培养的文化基底膜基质14天(天26-40),添加了JQ1 4天(天28-32),利用以前报道的方法。因此,信使rna表达水平
Sftpc 和
Sftpb 在三维文化保持在同一水平上看到26天,进一步增加了添加JQ1与表达式。此外,39%的细胞表达pro-SPC。
三维文化通常可以分为scaffold-free scaffold-based文化系统(
22 ,
23 ]。scaffold-free文化文化是一个聚合的同义词,在干细胞生物学,总专门表示为EB。EB播种方法、分化诱导方法,直到天26在目前的研究中,使用了一个scaffold-free文化开始。另一方面,水凝胶技术是代表scaffold-based文化系统和基于ECM的各种组件
22 ,
23 ]。一些最近的研究,诱导分化的细胞则到肺上皮细胞三维文化使用人工基底膜[未遂
8 - - - - - -
11 ]。在目前的研究中,细胞分化成ATII白天26,然后进一步与基底膜基质培养的三维的一个额外的14天,维持他们的分化状态。
最近的一些报告显示效率高分化到气道上皮sorting-based方法的使用。山本等人表明羧肽酶M (CPM),一个表面的标志
Nkx2-1 艾滋病VAFE细胞,高分化潜力ATII和纯化
Nkx2-1 纯度的浓缩铀VAFE细胞通过使用CPM排序和报道51% SFTPC-GFP-positive细胞的诱导效率(
11 ]。霍金斯等人报道CD47作为积极的表面标记和CD26 -表面的标志
Nkx2-1 阳性的原始肺部祖细胞并纯化
Nkx2-1 艾滋病患者原始排序基于CD47肺部祖细胞高 CD26低 门(
41 ]。Sorting-based方法的一个重要特性去除绝大多数的未分化的细胞分类区分文化的衍生品。减少残余的未分化细胞,则有以下几种技术,包括细胞分类,如上所述,和基因操作,如引入自杀基因和肿瘤进展基因或肿瘤抑制干扰。另一方面,细胞移植通常需要大量的分化细胞,以及广泛的细胞纯化方法对实验室和临床应用。因此,这些方法不考虑最优去除未分化细胞混合细胞培养,并尝试了确定小分子化合物选择性地抑制多能干细胞(
42 ,
43 ]。在目前的研究中,我们试图删除与JQ1未分化的细胞。的转录因子
cMYC 扮演着重要的角色在细胞增殖、凋亡和分化(
44 ),是在各种类型的恶性肿瘤
45 ,
46 ]。JQ1变弱
cMYC 表达和抑制细胞增殖,因此JQ1默克尔细胞癌治疗的效果(
47 ,
48 ),膀胱癌(
49 )、口腔鳞状细胞癌(
50 ),和血液恶性肿瘤
44 ,
51 )中,
cMYC 中已经被报道。关于ESCs和间充质干细胞,多能许多基因的表达,如
cMyc ,
Klf4 ,
Pou5f1 ,
Sox2 ,
Nanog ,
左撇子 ,
财政部 ,被发现与JQ1打赌抑制后下降,尽管JQ1多样的关键目标在先前的报道
33 ,
34 ,
52 ]。至于鼠ESCs,霍恩等人报道,JQ1显著降低的表达
Nanog 但不是
cMyc ,JQ1被发现的主要目标
Nanog (
52 ]。此外,吴等人报道,BRD4相互作用
Pou5f1 (
33 ]。小鼠细胞则在我们的研究中,JQ1减少的表达
Pou5f1 和
Sox2 。打赌抑制减少许多多能性基因的表达,但目标可能不同,这取决于细胞类型。此外,霍恩等人报道,形态分化的小鼠ESC发生后只有6小时内JQ1管理,虽然这种变化不能证实了与当前的发现,可能是因为JQ1加入细胞受到ATII逐步分化方法。这些结果表明,响应JQ1可能不同,这取决于细胞类型。万能干细胞诱导分化过程中,消除残留的未分化的细胞则没有伤害分化细胞是必需的。金等人报道,打赌蛋白可能参与细胞周期调控不同的细胞类型,他们的抑制有选择性地诱导细胞死亡的干细胞,而不是其他类型的体细胞(
53 ]。同样,在我们的研究中,JQ1诱导细胞死亡与对小鼠肺上皮II型相对较低的影响。在一起,这些发现表明,ATII的分化状态是由压制JQ1剩余未分化细胞的增殖。
小鼠细胞则预计将用于呼吸道疾病的动物实验模型建模和再生医学;因此,代小鼠iPSC-differentiated细胞的纯文化的重要性。更强大的方法来消除差异的小鼠万能文化是必需的。虽然有小分子的识别,扰乱至关重要的细胞更多的选择性和高效,JQ1可能是一个有趣的候选人有效的未分化的小鼠则和健壮的消除。