SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2018/7162084 7162084 研究文章 Leukocyte-Containing的微分效应和纯富含血小板血浆核Pulposus-Derived间充质干细胞:影响椎间盘变性的临床治疗 贾 小君 1 王 摘要 2 3 马 梁羽生武侠 1 余 Jia-bin 1 郭 Yu-dong 2 http://orcid.org/0000 - 0001 - 5468 - 4610 王 陈 1 Cantore 普 1 医学院的 东南大学 87年丁贾乔路 南京 江苏210009年 中国 seu.edu.cn 2 整形外科学系 中大医院 医学院的 东南大学 87年丁贾乔路 南京 江苏210009年 中国 seu.edu.cn 3 第一临床医学院 南京医科大学 广州路300号 南京 江苏210029年 中国 njmu.edu.cn 2018年 23 10 2018年 2018年 04 06 2018年 30. 07年 2018年 09年 08年 2018年 23 10 2018年 2018年 版权©2018年6月贾庆林等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。富含血小板血浆(PRP)是一种很有前途的战略椎间盘变性。然而,在PRP的潜在有害影响白细胞核pulposus-derived间充质干细胞(NPMSCs)很少被研究。本研究旨在比较评估的影响纯粹富含血小板血浆(P-PRP)和leukocyte-containing富含血小板血浆(L-PRP)兔子NPMSCs体外。 方法。NPMSCs隔绝兔子NP组织接受L-PRP或P-PRP体外,然后细胞增殖干细胞标记物的表达,促炎细胞因子(TNF - α,il - 1 β),生产ECM(细胞外蛋白质相关矩阵),和NF - κB p65蛋白被CCK-8试验验证,实时聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验、免疫荧光、免疫印迹。 结果。NPMSCs分化成核pulposus-like细胞治疗后的PRP (P-PRP和L-PRP),和NPMSCs表现出最大扩散10% PRP剂量。L-PRP显著地更高浓度的白细胞,TNF - α,il - 1 βP-PRP。此外,P-PRP相比,L-PRP诱导分化NPMSCs上调TNF的表达 α和il - 1 β,增强了NF -激活 κB途径,增加金属蛋白酶- 1的表达和MMP-13, ECM在分化NPMSCs较少。 结论。P-PRP和L-PRP都可以诱发的扩散和NP-differentiation NPMSCs。L-PRP相比,P-PRP可以避免NF -的激活 κB通路,从而减少炎症和分解反应。

 中国国家自然科学基金 81572188 1。介绍

下腰痛的主要原因,椎间盘变性(IDD)吸引了越来越多的关注实质性的全球金融和医疗保健负担( 1]。虽然目前IDD的病因是未知的,越来越多的证据表明,圆盘的机械和生物降解被认为是IDD(常见的主要原因之一 2]。椎间盘包括三个不同的结构组成,外环纤维化,内心的NP(髓核),上、下侧层( 3]。作为核心部分的椎间盘,NP在传输负载起着至关重要的作用 4]。荷载传递的失败通常被认为是椎间盘变性的起始 2]。因此,保护和再生的NP往往治疗策略的问题[ 5]。目前,保守治疗,包括口服镇痛药和非甾体类抗炎药,临床应用于缓解症状( 6]。脊柱手术,尤其是那些与微创技术,可以有效地减轻神经受压的症状。然而,干预的退化或邻光盘可能经历越来越退化过程( 7]。

目前,干细胞移植治疗正在成为一个有前途的战略当移植到退化光盘( 8]。令人信服的结果也说明了在许多临床和基础研究( 9- - - - - - 11]。试管的微环境低营养的特点,酸度,过度紧张,缺氧和高机械负荷 12]。这不仅微环境有负面影响的原始细胞盘但也促进移植细胞的凋亡 13]。应该指出的是,间充质干细胞(msc)驻留在退化髓核组织的再生潜力。最近的一项研究证实,髓核组织中内生的msc (NPMSCs)更有耐高渗的酸性和缺氧的环境比脂肪来源的msc ( 14]。因此,退行性椎间盘微环境,激活或移植msc NPMSCs可能有更多的优势与其他组织。作为一个有用的MSC活化剂,PRP在组织工程策略被广泛研究其潜在的细胞增殖和细胞外基质( 15- - - - - - 17]。当激活时,多种生长因子,包括PDGF TGF, EGF, VEGF,从血小板分泌,造成联合对受损组织再生的影响( 18]。直接注入PRP在IDD治疗已被证明有效的综合研究( 19, 20.]。

尽管PRP广泛用于再生潜能,效果往往是在辩论中不确定的治疗效果。一些研究显示,PRP在肌腱损伤的修复是有效的 21- - - - - - 23),而其他人没有证实修复肌腱的功能恢复和缓解疼痛的病人 24- - - - - - 26]。不一致可能是由于患者的个体差异和不同的PRP制剂研究( 27]。不同的PPR准备推出各种组件,白细胞是重要的元素之一。排除白细胞PRP已被证明更有利于骨关节炎( 28)和骨缺陷( 29日]。此外,PRP丰富的白细胞(L-PRP)可以释放高浓度的炎性细胞因子,导致NF -的激活 κB通路( 28, 29日]。然而,在PRP的潜在有害影响白细胞核pulposus-derived间充质干细胞(NPMSCs)很少被研究。

本研究的目的是比较评估的影响P-PRP和L-PRP兔子NPMSCs体外,和提供了新的见解,提高PRP治疗椎间盘再生的效率。

 2。方法 2.1。制备L-PRP、P-PRP NPMSCs、脾细胞,和npc

兔子被批准和监督东南大学动物保健和使用委员会。自体全血和NPMSCs收获来自24个新西兰白兔(8个月大的时候,3.0 - -4.0公斤,女)。大约27毫升的自体全血收集从每个新西兰白兔通过颈动脉和3毫升acid-citrate葡萄糖溶液混合(圣克鲁斯,目录。sc - 214744) 30毫升的实际上全血。2毫升全血用于量化全血血小板和白细胞浓度,和其余28毫升血留给准备PRP (P-PRP L-PRP)。两步离心分离过程的方法( 30.)是应用P-PRP和L-PRP做准备。短暂,14毫升全血在250 g离心10分钟在室温下血液分成三层,platelet-containing等离子体顶部,淡黄色的外套(丰富的白细胞和血小板)在中间,底部和红细胞。顶部两层都被转移到一个新的管再纺250克10分钟;大部分的白细胞、血小板和纤维蛋白原沉淀。然后,大多数的上层清液(在血小板)丢弃。左边的等离子体和沉淀,几乎2毫升,L-PRP resuspended形成。其他14毫升全血在160 g离心10分钟platelet-containing分离血浆从巴菲外套(富含白细胞)和红细胞。然后等离子层吸气小心避免巴菲外套和红细胞污染。等离子层又离心机在250克15分钟。然后,大多数的上层清液(在血小板)丢弃。 The left plasma and precipitate, which were almost 1.5 ml, were resuspended to form the P-PRP.

髓核组织与试管的新西兰白兔,碎成1毫米3组织块,并使用0.2毫克/毫升II型胶原酶消化(热费希尔、目录号DS56580) DMEM-LG (GIBCO目录没有。AB10104399)中4 - 6 h。在1500 r / min离心后10分钟(DragonLab将D3024R),细胞颗粒从光盘(腰椎3 - 5)相同的兔子被培养在25厘米2细胞培养皿的密度104细胞/厘米2。在DMEM-LG培养基培养的细胞补充10%胎牛血清(的边后卫)(σ,目录不。BK20170120), 100 U /毫升青霉素G (Hyclone,很多:J150019)和0.1毫克/毫升链霉素(Hyclone、目录号K270109) 95%的调湿大气的空气和5%的股份有限公司2在37°C。每3天中被改变,直到sub-confluence细胞达到80% -90%,然后用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA细胞收获(Hyclone,很多:J160004)和re-suspended在同一介质。那么细胞悬液接种到组织培养菜50个细胞的密度/厘米2为进一步的文化。细胞形态学的图像使用显微镜进行附加镜头(OLYMPU IX51)。通道2的NPMSCs被选为进一步实验。

npc被孤立和收获之前报道( 31日]。髓核组织获得从上面的兔子立刻碎成1 mm3组织块并使用0.25%胰蛋白酶消化(热费希尔,目录不。25200056)5到分钟,0.25%的I型胶原酶(热费希尔、目录号17100017)20到25分钟。离心后(1500 r / min, 10分钟),细胞颗粒在单层培养re-suspended补充与含有10%胎牛血清的DMEM培养基(σ,目录没有。BK20170120), 100 U /毫升青霉素G (Hyclone,很多:J150019)和0.1毫克/毫升链霉素(Hyclone、目录号K270109)在标准条件下(37°C、O的21%2,5%的公司2)。媒介改变了主后每3天开始增加静态依从性。npc被收集和亚文化在1:3的比例,直到subconfluence细胞达到80% -90%。P2 npc被用于总RNA提取。

脾细胞被孤立根据先前描述的方法( 32]。短暂,收获脾脏组织从上面的兔子是70年碎和过滤 μm细胞过滤器(康宁,目录没有。431751年)获得单细胞的解决方案。电池解决方案随后离心机在1000 r / min 10分钟。细胞颗粒随后接受血液细胞裂解缓冲(Solarbio、目录号r1010 - 500毫升)去除红细胞。沉淀的细胞用于总RNA提取的混合物。

 2.2。成分分析P-PRP, L-PRP和全血

白细胞和血小板的浓度在PRP和全血测定的自动血液分析仪(xp - 300, Sysmex、休斯顿、美国)。P-PRP和L-PRP激活10%氯化钙溶液,然后孵化在37°C 7 d。此外,上层清液提取的PRP在2800 g离心液15分钟。肿瘤坏死因子-的浓度 α和il - 1 β探讨了使用酶联免疫试剂盒(西塘、上海、中国)根据制造商的指示。

 2.3。髓核鉴定间充质干细胞

通道2的NPMSCs受到诱导分化培养他们在chondrogenic,脂肪形成的,分别和成骨的媒体。这些细胞被评估使用阿尔新蓝(σ,目录不。B8438)、油红O(σ,目录不。O8010)和茜素红(Solabio目录没有。G8550-25),分别染色。结果被一个倒置显微镜检查。rt - pcr用于确定MSC(间充质干细胞)标志基因的表达(CD166 CD44、CD29, CD14、CD8和CD4)从NPMSCs npc(髓核细胞)和脾脏细胞。从NPMSCs短暂,总RNA提取,npc,脾组织使用试剂盒试剂(热费希尔,目录不。10296010)根据制造商的指示。逆转录获得了逆转录工具包(热费舍尔,目录no.AM334)根据制造商的指令序列。 The sequences of primers which were used in the reactions are listed in Table 1。

用于rt - pcr引物序列。

基因 正向引物(5 ′ 3 ′ ) 反向引物(5 ′ 3 ′ )
GAPDH ACTTTGTGAAGCTCATTTCCTGGTA GTGGTTTGAGGGCTCTTACTCCTT
CD29 GTCACCAACCGTAGCAA CTCCTCATCTCATTCATCAG
CD44 CGATTTGAATATAACCTGCCGC CGTGCCCTTCTATGAACCCA
存在 GGACAGCCCGAAGGAATACGAA GACACAGGCAGGGAATCACCAA
CD4 GATGGAGGTGGAACTGC GGAAAGCCCAACACTATG
CD8 GGGTGGAAAAGGAGAAGC AGGTGAGTGCGGGAGAC
CD14 CAGGTGCCTAAGGGACT AATAAAGTGGGAAGCGG
il - 1 β CGGTCAAGGAGAGGAGCTTAC GGACTAGCCCTCGCTTATCTTT
肿瘤坏死因子- α GGAGAAGCCGGTAGTGGAGAT GGTCTGGTCACGGTTTGGAA
金属蛋白酶- 1 CGACTCGCTATCTCCAAGTGA GTTGAACCAGTCTCCGACCA
MMP-13 GGAGGCGAGAACATCAAGCC CGGCCTTCCCTCGTAGTGA
Oct-4 ACCTTCATCGGAAACTCCAAAG ACTGTTAGGCTCAGGTGAACT
Nanog CTGTGGGTTTCTGTGCTGG CCGGCTTCAAGGCTTTCAG
胶原蛋白II CAGGATGTCCAGGAGGCT GCAGTGGCGAGGTCAGTAG
Aggrecan GGAGCCCGAGCCTATACTATTT CCCAAGGACCAATCA
2.4。NPMSCs扩散在不同浓度的prp (P-PRP L-PRP)

决定细胞生存能力和细胞增殖能力,细胞与CCK-8化验检查。P2 NPMSCs获得如上所述被播种在24-well板(Yu可以康宁/合演,目录没有。3415)在10000细胞/好和维护培养基含有2%的边后卫和P-PRP L-PRP在不同体积百分比分数:0%,5%,10%,15%,20%为7天。100年 μ包含0.5%的边后卫和10 l的新鲜培养基 μl CCK-8被添加到每个板块和孵化为4 h 37°C。在450纳米光学密度检测,实验独立完成了三遍。

 2.5。Coculture NPMSCs体外

transwell系统(合演,目录no.jm - 3450)被用于coculture NPMSCs的研究。这个transwell由微孔膜(0.4 um)上部和下部之间的隔间,这样有两个隔间的自由流动的培养基。基础培养基的P2 NPMSCs (DMEM + 2%的边后卫)被播种到transwell底部的系统分配给三组(P-PRP、L-PRP和控制)。实验小组(P-PRP或L-PRP集团)被投入L-PRP P-PRP 10%或10%,分别在前室transwell系统和舱顶部包含基础培养基仅是设置为对照组。所有组的NPMSCs cocultured 14天,培养基是改变每3天。浓度的prp在这项研究中调整到10%(卷/期)使用基础培养基(DMEM + 2%的边后卫)根据上述NPMSC扩散试验。

 2.6。测量金属蛋白酶- 1的表达,MMP-13, il - 1 <斜体>β< /斜体>,和肿瘤坏死因子-α<斜体> < /斜体> Coculture NPMSCs

从上面提到的所有组细胞被胰蛋白酶化和离心收获14天。细胞颗粒是由汽车cellometer用来测量细胞计数(Nexcelom cellometer汽车2000年,美国),和上层清液用于估计金属蛋白酶- 1的浓度,MMP-13, TNF - α,il - 1 β按照制造商的指示由各自的ELISA试剂盒(西塘,上海,中国)。每个实验重复一式三份。

 2.7。存在分析

的NPMSCs培养14天在上述transwell收获2.5%胰蛋白酶和0.02% EDTA。髓核基因闲暇的基因(胶原蛋白II和aggrecan),间充质干细胞相关基因(Oct-4 Nanog),炎症标记基因(TNF - α,il - 1 βMMP-13)和分解代谢的基因(金属蛋白酶- 1)是由存在决定的。总之,试剂盒试剂(表达载体、钙、美国)用于从细胞中提取总RNA根据制造商的指示。实时PCR进行使用SYBR预混料交货Taq II(豆类、大连、中国)和测量iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad大力神,CA)。PCR条件由变性4分钟的互补脱氧核糖核酸在94°C,紧随其后的是40周期放大:94°C 40年代,40年代52°C, 72°C为数据收集40年代。所有样本归一化控制和计算使用2−ΔΔCT分析方法。我们使用GAPDH表达式作为内生控制和反应中使用的引物序列表中列出 1。

 2.8。免疫荧光

从实验收集NPMSCs组和对照组如上所述。然后,这些细胞被固定在PBS含有4%多聚甲醛(σ,目录没有。D56988) 20分钟,洗PBS包括1% Triton 5分钟。疣状的髓核闲暇的蛋白(胶原蛋白II和aggrecan)是实现通过阻断细胞2%小鼠血清(罗福斯生物制品,目录没有。nb600 - 504),然后用鼠标anti-rabbit胶原蛋白II抗体(孵化Aridobio,目录不。ARG62450)或anti-rabbit aggrecan(罗福斯生物制品、目录号nb600一夜之间在4°C - 504)。这些细胞被洗3次,每次PBS 5分钟和孵化Alexa萤石594 -共轭山羊anti-mouse lgG二级抗体(Bastet神庙、目录号在室温下BK0027) 90分钟。细胞核是由赫斯特33342年复染色(热费希尔、目录号 62249). The inverted fluorescence microscope (BX53, Olympus, Japan) was used to observe the stained cells.

 2.9。免疫印迹分析

上面提到的所有组织的细胞在培养两周后收获。提取细胞总蛋白质是由使用m /(哺乳动物蛋白分离试剂)(Fermenta,目录不。26616)补充1.5%(卷/期)蛋白酶抑制剂(Bio-Rad目录。161 - 0156)。上层清液中蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质分析工具包(热费希尔目录没有。EC60980)根据制造商的指示在10000 r / min后离心10分钟。20 μ从每组g细胞总蛋白的提取分离25% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(热费希尔、目录号DF65896)在100 V为60分钟,然后转移到PVDF膜(微孔目录。IPVH00010) 100 V 30分钟的阻挠与3%的无脂牛奶Tris-buffered盐在室温下30分钟。这些墨迹孵化了anti-P65抗体(Abcam目录。ab154036)、anti-aggrecan抗体(罗福斯生物制剂、目录。nb600 - 504), anti-collagen第二抗体(Aridobio、目录号ARG62450)和anti-GAPDH抗体的稀释1:1000年在4°C一夜之间,其次是孵化IgG-HRP(山羊anti-mouse peroxidase-conjugated二级抗体)(Bastet神庙、目录号BK0027)的稀释1:5000 1小时在室温下。蛋白质的表达被ECL工具包(Biyuntian,目录没有发现。根据制造商的建议协议ce7827)。 GAPDH was used as an internal control.

 2.10。统计分析

区别不同的两组学生的三个独立的实验进行了分析 t 以及。单向方差分析(方差分析)是用于分析以上两组之间的差异。这些数据意味着±s.d P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。NPMSCs具有自我更新的msc的典型特征,Clonogenicity,干细胞标记,和Multidifferentiation潜力

接种后,与椎间盘的髓核细胞开始增加静态坚持10 - 14天之后,和主细胞表现出各种形状。他们主要包括macrophage-like细胞和纤维母细胞纺锤状(图 1(一))。后低密度(50个/厘米2细胞)细胞通道,形成典型的殖民地sunflower-like细胞(图 1 (b))。此外,细胞显示统一cobblestone-like形态在通道2(图 1 (c));rt - pcr进行基因表达的典型MSC表面标志。如图 1 (d),结果表明,通道2中标记的表达包括CD166 CD44、CD29经常存在于msc显著高于在npc。此外,标记包含CD14、CD8和CD4很少表达负面的msc。同时,软骨形成的细胞诱导分化成骨、和脂肪生成(数字 1 (e)- - - - - - 1 (g))。当成骨培养基中的细胞培养,细胞的形态改变了第五日。细胞中的钙沉积高度可见的后3周,然后他们被“茜素红固定和染色。”相比之下,对照组的细胞不产生任何钙沉积在基础培养基培养(图 1 (e))。脂肪形成的诱导培养基中培养1周后,细胞逐渐发达的脂质滴。这些细胞被沾染了“油红O”21天。对照组的细胞没有任何改变(图 1 (f))。细胞分化成位于细胞出现了更高水平的“阿尔新蓝染色chondrogenic分化培养基中培养后而控制细胞(图 1 (g))。

NPMSCs具有自我更新的msc的典型特征,clonogenicity,干细胞标记,和multidifferentiation潜力。(一)主要细胞的形态学(100 x)。(b)一个典型sunflower-like细胞集落通道1 (100 x)。(c)细胞显示统一cobblestone-like形态(100 x)。(d)的基因CD29、CD44和CD166表达了强烈的细胞通道2而不是NP细胞和很少CD14表达,CD8和CD4,,脾细胞表达以上基因作为积极的控制;NP细胞不表达这些基因是一个消极的控制。(e)显微图显示累积矿化钙沉积在noninduced细胞(NI)和osteoinduced细胞(OS),由茜素红染色(100 x)。(f)显微图显示noninduced细胞中脂滴度(NI)和adipoinduced细胞(广告)作为评估油红O染色(NI100x AD400x)。(g) noninduced细胞显微图显示软骨形成的水平(NI)和chondrogenic感应细胞(CH),以阿尔新蓝染色。

 3.2。白细胞的浓度,炎性细胞因子(il - 1 <斜体>β< /斜体>和TNF -α<斜体> < /斜体>),在全血血小板,L-PRP, P-PRP

我们发现白细胞浓度在L-PRP明显高于全血白细胞的浓度在P-PRP明显低于全血(图 2(一个), P < 0.05 )。il - 1的水平 β和肿瘤坏死因子- α在L-PRP升高。如数据所示 2 (b)和 2 (c),il - 1的水平 β和肿瘤坏死因子- α在L-PRP明显高于全血和P-PRP,而il - 1的水平 β和肿瘤坏死因子- α在P-PRP明显低于全血( P < 0.05 )。血小板的浓度相似P-PRP和L-PRP之间。此外,血小板P-PRP和L-PRP浓度高于3.8倍在全血(图 2 (d))。

白细胞的浓度,炎性细胞因子(il - 1 β和肿瘤坏死因子- α),并在全血血小板,L-PRP P-PRP。(a - c)白细胞,炎性细胞因子,il - 1 β和肿瘤坏死因子- α在P-PRP L-PRP和全血。(d)血小板浓度P-PRP, L-PRP和全血。” ∗ ”表示区别P-PRP L-PRP和全血是统计学意义( P < 0.05 )。“#”表示区别L-PRP P-PRP是统计学意义( P < 0.05 )。统计分析采用方差分析, n = 8 。

 3.3。细胞的增殖是prp摄入量有关

确定PRP能否功能调节扩散,我们执行CCK-8化验评估进展的PRP细胞的作用。当细胞培养介质组成的不同浓度的prp如上所述,结果显示,细胞增殖速度显示响应P-PRP和L-PRP存在剂量依赖的相关性(图 3)。细胞增殖率没有显著差异的存在为5%,15%和20% P-PRP或L-PRP与对照组相比增加了60% (0% prp)。P-PRP 10%或10%的存在L-PRP获得最大的增殖率。之间没有显著差异L-PRP和P-PRP浓度( P > 0.05 )。

细胞的增殖来源于髓核在不同浓度P-PRP或L-PRP。细胞增殖受到CCK-8试验评估7天。细胞增殖显示最大影响L-PRP P-PRP 10%和10%。不同日期的每组(P-PRP或L-PRP)由使用单向方差分析。一个 t 测试是用于确定P-PRP之间的统计显著差异和L-PRP在每个prp的浓度。在酒吧不同的字母表明,区别是统计学意义( P < 0.05 )。

 3.4。prp促进NPMSCS成核Pulposus-like细胞的分化

观察NPMSCS P-PRP和L-PRP对分化的影响,我们首先研究细胞形态。结果表明,控制主要是cobblestone-like没有任何改变(图 4(一)),而细胞形态学实验群体逐渐从cobblestone-like细胞细长纺锤形核pulposus-like细胞(图 4 (b))。此外,存在的结果表明,干细胞标志基因的表达,包括“Oct-4 Nanog”实验组下降30%的价格相比控制数据 4 (c))。相比之下,髓核的表达闲暇的基因(胶原蛋白II和aggrecan)实验组是3 - 4倍高于对照组(图 4 (d))此外,P-PRP组之间没有显著差异,L-PRP组(数字 4 (b)- - - - - - 4 (d))。这些结果表明,L-PRP和P-PRP诱导NPMSCs向成熟NP-like细胞的分化。

NPMSCS P-PRP和L-PRP分化的影响。(一)细胞形态的控制。(b)形态的细胞治疗P-PRP L-PRP为10%和10%。(c)的mRNA表达干细胞标记Oct-4, Nanog是由存在决定的。(d)的mRNA表达NP闲暇的基因,aggrecan (AGC)和胶原蛋白II。” ∗ ”表示P-PRP或L-PRP和控制的区别是统计学意义( P < 0.05 )。注意,一个倒置的显微镜下观察细胞形态(×100)。

 3.5。L-PRP激活NF -κ<斜体> < /斜体> B途径分化Pulposus-like核细胞

探索的影响L-PRP和P-PRP NF -的激活 κB通路在新核pulposus-like细胞,促炎基因(il - 1的表达 β肿瘤坏死因子- α)和分解代谢的基因(金属蛋白酶- 1,MMP-13)是由存在决定的。我们发现这些基因的表达L-PRP组显著高于P-PRP和对照组(数字 5(一个)和 5 (b))。此外,我们使用ELISA试验进一步研究这些细胞因子产品在所有组。结果表明,L-PRP组也显著高于P-PRP和对照组(数据 5 (c)和 5 (d))。如图 5 (e)免疫印迹分析表明NF -的生产 κB / p65 L-PRP组在所有组最高。此外,没有明显差异的所有结果P-PRP和对照组。

P-PRP和L-PRP NF -激活 κB通路。(a, b) mRNA的表达炎性基因(il - 1 β肿瘤坏死因子- α)和异化的标记基因(金属蛋白酶- 1,MMP-13),以存在。(c, d)生产的促炎细胞因子(il - 1 β肿瘤坏死因子- α)和分解代谢的细胞因子(金属蛋白酶- 1,MMP-13),由ELISA测定。NF - (e)生产 κB / p65在细胞核中,评估免疫印迹。” ∗ ”表示P-PRP或L-PRP和控制之间的差异具有统计学意义( P < 0.05 )。“#”表示区别L-PRP P-PRP是统计学意义( P < 0.05 )。

 3.6。P-PRP诱导分化Pulposus-like核细胞产生更多的细胞外蛋白质相关矩阵

为了评估P-PRP和L-PRP作品的影响细胞外蛋白质相关矩阵的核pulposus-like细胞,我们测量了水平的胶原蛋白II和aggrecan通过免疫荧光染色和免疫印迹分析,分别。免疫荧光染色显示,PRP治疗调节胶原蛋白II和aggrecan的作品相比,控制和获得最高的细胞染色P-PRP治疗后(图 6(一))。我们进一步进行免疫印迹分析,以确定这些因素的水平;也确定了结果,结果表明P-PRP诱导的最大生产胶原蛋白II和aggrecan细胞(图 6 (b))。

P-PRP诱发更多的细胞外蛋白质相关矩阵。(一)胶原蛋白II和aggrecan coculture细胞的细胞质中由荧光显微镜成像。(b)生产胶原蛋白II和aggrecan,以免疫印迹。

 4所示。讨论

本研究确定的意义白细胞排斥在PRP NPMSCs体外的文化。孤立NPMSCs拥有自我更新msc的典型特征,clonogenicity, multidifferentiation潜力。血小板浓度超过3倍P-PRP或L-PRP相比全血。浓度的白细胞,TNF - α,il - 1 β显著降低在P-PRP L-PRP相比。L-PRP和P-PRP诱导NPMSCs走向成熟的NP细胞的分化。MMP-13 P-PRP诱导低浓度的金属蛋白酶- 1,TNF - α,il - 1 β卓越的功效在ECM(胶原蛋白II和aggrecan)的生产。此外,免疫印迹结果证实了NF -的高表达 κB / P65蛋白L-PRP组。

NPMSCs描述的,我们没有测试的经典表面标记msc缺乏特定的兔子抗原通过流式细胞术。为了解决这个问题,我们进行了RT-PCT来确定这些标记基因的表达水平。NP高度表达的细胞克隆形成孤立MSC-specific标记(CD29、CD44和存在),而最低限度表达造血标记(CD8、CD8和CD14)。脾细胞作为阳性对照在这项研究中,因为脾细胞,主要包括淋巴细胞和单核细胞阳性表达MSC-specific和造血标记( 33, 34]。

给定的值内生的MSC的代谢体内平衡盘,理想的治疗是激活和增殖人口居民MSC。PRP,由自体血,已经被证明是有效的在退化的恢复光盘 19, 20.]。当激活时,各种生长因子(PDGF、TGF EGF和VEGF)释放血小板 α颗粒PRP能增加细胞增殖和体外软骨基质分泌 18]。在这项研究中,两个P-PRP和L-PRP / 3倍血小板浓度比全血。7天后与prp coculture NPMSCs扩散速度比对照组。此外,NPMSCs表现出活跃的人大形状与髓核的表达增加闲暇的基因(胶原蛋白II和aggrecan)及其蛋白质生产的prp治疗后14天。因此,prp不仅改善了细胞增殖,还诱导移植的活跃的NPMSCs分化细胞外蛋白质生产相关矩阵。

PRP的构成的变化可能导致不同的结果( 21]。白细胞的排斥已经被证明是更有效应用于骨缺损的治疗( 29日),骨关节炎( 35),急性跟腱损伤( 36]。在这项研究中,类似的P-PRP血小板浓度和L-PRP导致ECM生产在每个组明显不同。P-PRP礼物更好的ECM生产函数,这可能归因于白细胞L-PRP相比的排斥。作为典型的促炎细胞因子,il - 1 β和肿瘤坏死因子- α高效活化剂的NF - κB信号通路( 37- - - - - - 39]。在目前的研究中,促炎基因(TNF - α和il - 1 β)以及各自的蛋白质的表达分化NPMSCs L-PRP组明显高于P-PRP组。免疫印迹结果表明NF -的高表达 κB / P65蛋白相比P-PRP L-PRP组。这些结果与以前的研究一致表明NF - κB通路被激活的高浓度的白细胞L-PRP [ 28, 29日, 40]。

NF - κB信号通路密切参与了移植降解的合成代谢和分解代谢增强受损细胞因子,金属蛋白酶- 1和MMP-13椎间盘细胞( 41]。PRP的抗炎效果也证实了先前的研究[ 42, 43]。此外,PRP乳沟产品报道能够终止NF - κB途径和表达下调生产cox - 2 ( 44]。然而,高浓度的白细胞在L-PRP可能抵消潜在的抗炎从血小板生长因子释放 45]。在我们的研究中,L-PRP高度诱导的炎症与PRP相比可以忽略不计白细胞(P-PRP)。此外,NPMSCs对待L-PRP调节catabolism-related基因(金属蛋白酶- 1,MMP-13)及其蛋白质与P-PRP相比。因此,NF -的激活 κB通路可以很大程度上归因于包含PRP的白细胞。排除PRP导致的白细胞减少il - 1的生产 β和肿瘤坏死因子- α的激活,从而禁止NF - κB信号通路。

我们的研究也有一些局限性。首先,我们初步证实P-PRP的优越性在L-PRP细胞外蛋白质积累NPMSCs相关矩阵。然而,精确的机制,特别是NF -的激活 κB途径,应该为进一步深入调查研究。第二,在这项研究中,我们只测试NPMSCs prp的体外影响。细胞培养系统不能必然保证P-PRP NPMSCs当注入的影响动物模型。第三,我们没有调查的影响prp NPMSCs退化的光盘。当应用在一个诊所,prp如何影响已经退化NPMSCs应该在进一步的研究确定。

 5。结论

我们证明L-PRP和P-PRP诱导NPMSCs向成熟NP-like细胞的分化,表现出类似NPMSCs扩散的影响。然而,不同的白细胞水平导致不同的NF -激活的影响 κB信号通路。集中在L-PRP白细胞释放促炎细胞因子水平高,导致强烈的NF -激活 κB信号通路。尽管P-PRP和L-PRP NPMSCs施加类似的扩散影响,P-PRP显示优越的功效在生产的细胞外蛋白质相关矩阵。因此,当应用于IDD疗法,P-PRP展出上级代理,可以更好地恢复退化ECM积累和NPMSCs的激活函数。

 数据可用性

数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

资金支持中国的国家自然科学基金(批准号81572188)为这个工作是感激地承认(CW)。

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