1。介绍
雪旺细胞(SCs)发展起到关键作用,功能,周围神经的再生。然而,SC移植的临床应用有限由于SCs的内在缺陷,如入侵隔离要求,其体外增殖能力有限,他们的高免疫原性(
1 ,
2 ]。最近,越来越多的证据表明,成人干细胞移植(ASC)是一种理想的替代SC移植和诊所(可能是有前途的
2 - - - - - -
4 ]。移植对asc未分化已经证明是有益的周围神经修复,最有可能通过旁分泌神经营养因子的生产而不是对SCs直接分化转移。因此,为了改善ASC-based治疗周围神经修复的好处,一些研究试图对asc predifferentiate Schwann-like细胞体外移植前(
5 - - - - - -
7 ]。predifferentiation的主要目的是改善生存的在受伤部位对asc predifferentiated驻留,促进其与内源性SCs融合,同时减少的可能性成不受欢迎的类型的细胞移植细胞的分化。
对asc的新定义,月经血液(MenSCs)子宫内膜干细胞临床应用。MenSCs mesenchymal-like干细胞,可以收获从人类每个月经血从子宫内膜脱落,有一个特定的分化条件下高增殖和分化能力。方便获取MenSCs没有侵入性手术治疗或住院治疗,目前还没有任何相关的伦理问题与他们隔离为临床应用提供合理的优势MenSCs [
8 - - - - - -
10 ]。除了经典的间充质干细胞标记物阳性(CD29、CD44、CD73 CD90、和CD105)和消极的造血细胞表面标记(CD34、CD45和CD133), MenSCs也表达一些多能性标记,包括OCT-4 SOX2, SSEA-4 [
11 ]。MenSCs分化为脂肪细胞,软骨细胞,骨细胞、肝细胞、心肌细胞和胰腺细胞已被证明。已经证明了的有前途的治疗潜力MenSCs中枢神经修复(使用实验中风和帕金森病小鼠模型),和MenSC政府的安全评估
10 ,
12 ,
13 ]。
N-Cadherin (N-cad)主要表达在神经组织和中起关键作用的神经系统的发展。N-cad负责管理维护、增殖和分化的神经前体细胞(npc)在开发过程中
14 - - - - - -
16 ]。基于先前的研究,predifferentiation MenSCs Schwann-like细胞可能更有利于周围神经修复;然而,毒性的化学因素和生物因素的高成本predifferentiation过程大大限制其临床应用。因此,我们的研究旨在首先确认的旁分泌作用MenSCs分化转化成glial-like细胞对神经保护及其潜力,随后,在研究水平的改变N-cad predifferentiation期间MenSCs探索另一种转基因源MenSCs治疗周围神经损伤。
2。材料和方法
2.1。质粒、细胞和动物
质粒(pCAG-MCS-EGFP和人类pCAG-N-cad-EGFP)建造在我们的实验室。本研究中使用的MenSCs收获与女性捐赠者,知情同意,本研究通过新乡医科大学的伦理委员会。八周大BALB / c小鼠(20 - 25克)购买的重要河实验室(中国,北京)和繁殖和安置在无菌环境中12小时光暗周期在动物保健设施。所有实验协议是通过动物研究委员会新乡医科大学委员会根据中国动物保健指南。
2.2。隔离和MenSCs文化
样品收集经血从健康女性捐赠者(
n
=
5
,30±5岁)和月经杯在月经的前三天,并迅速与相同体积的混合PBS含0.25毫克/毫升两性霉素B, 100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升、EDTA和2毫米。一旦微生物污染物被淘汰,MenSCs 72 h内孤立使用标准的聚蔗糖方法如前所述[
8 ],悬浮在生长介质[high-glucose DMEM(美国HyClone)补充10%的边后卫(美国Gibco), 100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升),和播种T25烧瓶在37°C, 5%的公司2 。经过2天的孵化,不依从细胞被冲走,生长介质是每三天更换一次。当细胞达到80 - 90%的融合(通道0,P0),这些细胞被分离与胰蛋白酶和亚文化新烧瓶的比率1:3。
2.3。识别MenSCs
经典的成人干细胞的特征,包括体外multilineage分化潜力和典型immunophenotype在P3 MenSCs例行检查,每个分别检查重复MenSCs隔绝3捐助者(
n
=
3
)。总之,MenSCs的形态(P0, P3和P9)是由成像;表面标记物的表达,如CD29、CD44, CD73, CD90、CD105, HLA-ABC, HLA-DR, CD34、CD45、使用流式细胞仪进行了测试。成骨的脂肪形成的,chondrogenic分化诱导和鉴定如下:脂肪形成的分化培养基(生长培养基+ 1
μ mol / l地塞米松+ 10
μ 重组人类胰岛素+ 200 g / ml
μ 吲哚美辛+ 0.5毫米IBMX), 14天;成骨分化培养基(生长培养基+ 0.1
μ 0.05 mol / l地塞米松+更易与l抗坏血酸+ 10毫米
β 甘油磷酸盐),21天;和chondrogenic分化培养基(生长培养基+ 0.1
μ 0.2 mol / l地塞米松+更易与l抗坏血酸+ 1% insulin-transferrin-selenic酸+ 10 ng / ml TGF -
β 3),21天。在诱导期结束后,细胞被洗和固定。去证实了油红O染色,证实了成骨分化茜素红染色,证实了和chondrogenic分化阿尔新蓝染色。
2.4。体外神经源性分化试验
P3 MenSCs (
n
=
3
,MenSCs隔绝3捐助者)悬浮在生长介质和播种密度2×104 细胞/在6-well板直到融合。然后,生长介质改为胶质分化培养基(生长培养基+ 1毫米
β 巯基乙醇,1天;生长培养基+ 35 ng / ml all-trans-retinoic酸,3天;生长培养基+ 5 ng / ml血小板源生长因子+ 10 ng / ml碱性纤维母细胞生长因子+ 14
μ forskolin + 126 ng / ml胶质生长因子2,14天)。控制细胞培养生长介质,介质是每三天更换一次。
2.5。rt - pcr
从细胞总RNA分离有或没有神经源性分化(2×106 ),2的互补脱氧核糖核酸制备
μ 总RNA的g使用PrimeScript RT主设备根据制造商的指示。用于放大目标基因的引物合成表中列出
1 ;管家基因(GAPDH)作为内部控制。PCR产品放大使用2×Taq大师混合(Cwbiotech,中国),分析了在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。最终的数据归一化的强度(灰度值)GAPDH信号表示为mRNA表达相对GAPDH。
表1
引物序列。
基因
寡核苷酸序列(5
′
3
′
)
大小(英国石油公司)
参考
NT3
感觉
TACGCGGAGCATAAGAGTCAC
333年
(
17 ]
反义
GGCACACACACAGGACGTGTC
NT4
感觉
CTTTCGGGAGTCAGCAGGTGC
399年
(
17 ]
反义
CAGGCAGTGTCAATTCGAATCC
脑源性神经营养因子
感觉
TTCCACCAGGTGAGAAGAGT
474年
(
18 ]
反义
ACTAATACTGTCACACACGC
据
感觉
TGGCTAGCAAGGAAGATTCGT
519年
(
19 ]
反义
AATATAATGGCTCCCACGTGC
神经生长因子
感觉
CACACTGAGGTGCATAGCGT
389年
(
18 ]
反义
TGATGACCGCTTGCTCCTGT
生活
感觉
ATGTCACAACAACCTCATGAA
466年
(
19 ]
反义
GATCTGCTTATACTTCCCCAG
反义
AATGGTGATCCGGTTCTCCTC
CNPase
感觉
AAGGACTTCCTGCCGCTCTA
466年
(
20. ]
反义
TGTCCACATCACTCGGCCAC
S100
感觉
ATGTCTGAGCTGGAGAAGG
338年
(
21 ]
反义
CTGTCTGCTTTCTTGCATG
GFAP
感觉
GTGGTACCGCTCCAAGTTTGCAG
376年
(
17 ]
反义
AATGGTGATCCGGTTCTCCTC
N-cad
感觉
TGTTTGACTATGAAGGCAGTGG
151年
(
22 ]
反义
TCAGTCATCACCTCCACCAT
GAPDH
感觉
GAAGGTGAAGGTCGGAGT
226年
(
23 ]
反义
GAAGATGGTGATGGGATTTC
2.6。免疫荧光
这些细胞被固定在4%的PFA 20分钟和permeabilized 0.05% Triton x - 100为10分钟;非特异性结合被5%的山羊血清30分钟。Anti-S100、anti-GFAP anti-N-cad(美国Abcam)抗体分别补充道,和细胞孵化一夜之间在4°C。488 -和Cy3-conjugated山羊anti-mouse或Alexa萤石anti-rabbit二级抗体(美国生活技术)在37°C细胞孵育1 h。细胞核与DAPI染色。最后,这些细胞被观察和成像在倒置荧光显微镜下观察(德国徕卡)。神经源性分化后,GFAP的百分比——/ S100 - / N-cad-positive MenSCs量化基于10细胞图像随机收集。
2.7。在子宫内电穿孔
的协议在子宫内电穿孔(拜访)之后如前所述
24 ]。pGPU6-GFP-neo-shRNA-N-cad (plasmid-based成分)被命令从南方(Abgent、江苏、中国)基于鼠标N-cad特定成分序列(5
′
-GCCTATGAAGGAACCACATGA-3
′
),pGPU6-GFP-neo-shRNA-Control作为消极的控制。加强效果,可见一个8:1的比例plasmid-based成分和pCAG-MCS-EGFP质粒是由于强度较弱的GFP小鼠胚胎诱导plasmid-based成分。解决方案(1
μ 包含pCAG-MCS-EGFP质粒(0.5 l)
μ g)和pGPU6-GFP-neo-shRNA-N-cad或pGPU6-GFP-neo-shRNA-Control (4
μ g)是通过子宫壁注入侧脑室的胚胎E15(胚胎第15天)。注射后,叶片状电极放置在胚胎的头部的两侧,和五个60平方脉冲女士600毫秒间隔在35 V应用与electroporator(纳帕基因、CUY21、日本)。electroporated胚胎进一步培养5天,和GFP-positive大脑(
n
=
3
)收集调查E20使用立体荧光显微镜(德国徕卡M205FA)。大脑cryosections准备根据先前描述的协议,和部分是在荧光显微镜成像(尼康ECLIPSE 80 i,日本)配备数码相机(德国徕卡DFC300FX)。
2.8。转染
MenSCs (
n
=
3
,MenSCs隔绝3捐助者)转染了Lipofectamine™3000试剂(美国英杰公司有限公司)后,制造商的协议。总之,MenSCs被播种密度1×105 细胞/到24-well板转染前24小时。随后,最后一卷50
μ l(无血清DMEM包含500 ng的质粒(pCAG-MCS-EGFP或人类pCAG-N-cad-EGFP), 1
μ l P3000™试剂,1.5
μ l 3000年Lipofectamine试剂添加到每个。中被替换为新的介质(high-glucose DMEM补充2%的边后卫)每3天,和GFP荧光倒置荧光显微镜检测。14天培养后,通过免疫荧光细胞被收集和分析。
2.9。统计分析
并给出了数据均值±SD;所有的实验都重复至少一式两份MenSCs隔绝3捐赠者;和手稿中给出的数据显示代表图像。学生的
t 以及用于确定统计学意义,
p
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。隔离和MenSCs的识别
隔离使用标准聚蔗糖方法后,群体看作形态显然是观察到的主要文化MenSCs(图
1(一) ),亚文化MenSCs证明生长特性对asc的典型(轴呈形态与径向或螺旋增长模式)。此外,确定表型稳定整个亚文化时期从P0票数(数字
1(一) - - - - - -
1 (c) )。随后,P3 MenSCs流仪分析证明了培养细胞阳性CD29、CD44, CD73, CD90、CD105, HLA-ABC但不利于CD34、CD45、HLA-DR(图
1 (d) )。最后,multilineage分化分析也证实了MenSCs接受脂肪形成的(图
1 (e) ),成骨的(图
1 (f) ),和chondrogenic(图
1 (g) 与特定的感应媒体)分化后接受治疗。
图1
隔离和MenSCs的识别。相衬,图像显示了初级MenSCs的形态在不同的段落:(a) P0, P3 (b)和(c)票数。(d) MenSCs的表型。确定细胞的immunophenotype, P3 MenSCs沾了表示共轭抗体,通过流式细胞仪分析。古典ASC标记P3 MenSCs是积极的(CD29、CD44、CD73 CD90、和CD105)和HLA-ABC和消极的造血干细胞标记(CD34、CD45)和HLA-DR。(e)脂肪形成的,(f)成骨和(g) chondrogenic常规诱导分化,结果评估和积极的油红O,茜素红,和阿尔新蓝染色,分别。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
3.2。旁分泌MenSCs在神经保护的效果
rt - pcr分析,神经营养因子(图
2 )显示高水平的NT3 NT4,脑源性神经营养因子、神经生长因子的表达与CTNF和生活水平P3 MenSCs体外培养。然而,随着时间的增加文化,上述神经营养因子的表达MenSCs明显减少,特别是在P18,这表明MenSCs通道对周围神经修复是最佳的。
图2
神经营养基因的表达在不同的段落(P3,票数,P18) MenSCs体外培养。(一)rt - pcr分析MenSCs神经营养因子表达在不同的段落。(b)定量分析MenSCs神经营养因子表达在不同的段落。对数据进行归一化的强度(灰度值)GAPDH表达和表达mRNA的表达水平相对于GAPDH。
∗
p
<
0.05
;
∗
∗
p
<
0.01
。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.3。MenSCs成Glial-like细胞的分化
按照先前的报道,神经源性分化的潜力MenSCs在这项研究证实。经过诱导的神经分化,形态的MenSCs从原始轴呈形态转变成了glial-like形态(数字
3(一个) 和
3 (b) )。随后的免疫荧光分析证明了分化MenSCs GFAP阳性和S100(> 80%,数字
3 (c) ,
3 (d) ,
3 (g) ,
3 (h) ),易于辨识的神经胶质细胞标记,和rt - pcr结果显示CNPase mRNA水平的增加,S100、GFAP(数字
3 (e) 和
3 (f) )。
图3
MenSCs成glial-like细胞的分化。(a, b)形态学的P3 MenSCs有或没有神经性的归纳。(c, d)神经源性分化的P3 MenSCs诱导,通过检查和结果评估的积极表达胶质细胞标记(GFAP和S100)。(e, f) CNPase rt - pcr分析,GFAP和S100 MenSCs有或没有神经性的归纳。(g, h) GFAP的百分比-或S100-positive细胞后神经源性分化。
∗
∗
p
<
0.01
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
(h)
![]()
3.4。神经源性分化MenSCs促进N-cad表达式
免疫荧光和rt - pcr结果表明N-cad的表达在神经源性分化后的MenSCs(数字
4(一) - - - - - -
4 (e) )。相比于未分化MenSCs, N-cad的表达显著增加在分化MenSCs mRNA和蛋白的水平,这表明N-cad MenSCs神经源性分化中扮演重要角色。
图4
(安妮)神经源性分化MenSCs促进N-cad表达式。免疫荧光染色法(a, b)和rt - pcr (c)被用来确定在MenSCs N-cad的表达或没有神经性的感应。的百分比N-cad-positive细胞(d)和N-cad的相对mRNA表达水平(e)在MenSCs神经源性分化。(f)抑制N-cad表达影响npc体内的迁移。GFP-positive胚胎大脑收集和成像在E20立体荧光显微镜下,和随后准备cryosections清楚地表明,GFP强度下降是由于异常保留GFP-positive npc的心室区。
∗
∗
p
<
0.01
。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.5。抑制N-cad表达影响神经祖细胞的迁移
等量的pGPU6-GFP-neo-shRNA-N-cad和pGPU6-GFP-neo-shRNA-Control转染到大脑半球的中心目标的侧脑室E15拜访。然后,GFP-positive胚胎和大脑收集并在E20立体荧光显微镜下成像。如图
4 (f) ,与阴性对照组相比,GFP pGPU6-GFP-neo-shRNA-N-cad-transfected胚胎和大脑的强度明显下降,和随后准备cryosections清楚地表明,GFP的减少是由于异常保留GFP-positive NPC的心室区(VZ),这表明抑制N-cad表达显著影响人大迁移和成熟。
3.6。Upregulation MenSCs N-cad促进神经源性分化
是否对asc upregulation N-cad可以促进神经源性分化,MenSCs是暂时性的转染与N-cad超表达向量(人类pCAG-N-cad-EGFP)和免疫荧光结果如图
5 。转染后,EGFP-positive MenSCs人类pCAG-N-cad-EGFP-treated组阳性N-cad(图
5 (g)和S100(图)
5 (o))表达式,但pCAG-MCS-EGFP-treated组的细胞为阴性N-cad(图
5 (c)和S100(图)
5 (k)表达式。
图5
的奖励的效果N-cad upregulation MenSCs神经源性分化。MenSCs与不同的质粒,转染和介质代替新鲜中每3天。细胞培养14天后,免疫荧光。(模拟)和(我)EGFP-positive MenSCs pCAG-MCS-EGFP-treated组为负N-cad和S100表达式。(情况)和(mp) EGFP-positive MenSCs人类pCAG-N-cad-EGFP-treated组阳性N-cad和S100表达式。
![]()
4所示。讨论
周围神经损伤的发病率高代表了病人的主要经济和生理负担由于功能恢复不佳(
25 ]。幸运的是,ASC-based疗法正在建立了通过实验和临床研究,并已取得相当大的进展在过去的几十年,这对疾病带来了希望,缺乏有效的治疗方法
26 ,
27 ]。MenSCs对asc一类新发现,周围神经修复的可能性,因为基本优势等丰富的来源,非侵入式隔离程序,缺乏伦理争议,和神经源性分化转化效能高(
8 - - - - - -
13 ]。我们不仅在体外研究分析MenSCs在神经保护(图的旁分泌作用
2 )也证实MenSCs predifferentiated Schwann-like细胞与传统感应协议(化学物质结合生物因素),这证明MenSCs并建议其潜在的神经源性分化能力transdifferentiate成Schwann-like细胞体内。上述结果显示MenSCs移植对周围神经再生的治疗潜力。
此外,一些研究报道,与移植对asc天真的相比,移植对asc predifferentiated更有前途,可以提高在受伤部位移植细胞的存活,促进他们与内源性SCs融合,同时减少的可能性,移植细胞的分化成不受欢迎的类型的细胞(
5 - - - - - -
7 ]。然而,保持对asc的分化成Schwann-like细胞体外,化学诱导物结合一个相当昂贵的生物因素常常混合使用,感应过程是极其复杂和耗时。虽然coculture SCs是一个简单的方法来区分成Schwann-like细胞也在体外培养SCs是困难的,因为它们通常含有成纤维细胞出现在轴膜(
3 ,
28 - - - - - -
30. ]。因此,对asc的predifferentiation Schwann-like细胞通过转基因技术可能是一个有前途的替代方法。
N-cad-based(能)粘合连接处并且参与各种神经发育过程,如神经胚形成、迁移的神经元,轴突伸长和指导,和突触发生,由于能的贡献和信息之间的附着力npc和神经元
14 ]。在这一领域的研究仍在继续,除了贡献五角的完整性和apicobasal npc的极性,N-cad被认为是负责监管维护、增殖,在神经系统发育和分化的npc (
15 ,
16 ]。大量的数据表明,发病神经源性分化的N-cad差别的特点是对这些不同的npc。据报道,顶端过程的促进差别N-cad对这些超然的VZ小鸡胚胎脊髓和异常持久性N-cad表达抑制顶端的撤军过程和细胞周期出口在未来的神经元
31日 ,
32 ]。此外,实验用斑马鱼模型的差别表明,对这些N-cad是分化的触发npc吻侧迁移期间(
33 ]。然而,与神经源性分化的npc,立即表达N-cad诱导多能干细胞(万能)大幅提高神经源性分化的效率,这表明早期激活N-cad决定了它强有力的神经性differentiation-promoting效果;后续可拆卸的实验也证实,抑制N-cad表达式的成分可以阻止神经源性分化(
34 ]。
因此,基于之前的研究结果和我们的初步研究结果,我们检查了N-cad表达式MenSCs神经源性分化后的变化,结果显示upregulation N-cad mRNA和蛋白水平,表明N-cad在神经源性分化的潜在作用。此外,我们的体内研究证实,击倒的N-cad拜访摄动鼠标npc的迁移和成熟,这是按照先前的报道表明N-cad东方多极细胞的迁移需要向皮质板,潜在的机制是由Jossin et al (
35 ]。进一步转染试验证实,upregulation N-cad MenSCs确实导致神经胶质细胞标记S100的表达,这表明移植的强有力的神经性differentiation-promoting效应对asc N-cad在。根据公布的数据,有效的神经性differentiation-promoting N-cad可能由的效果
β 连环蛋白和Notch信号通路,详细总结了一些优秀的评论和论文(
15 ,
16 ,
36 ]。此外,N-cad调节的分布和退化
β GSK3连环蛋白,
β / Akt信号转导可能扮演至关重要的角色在本条例(
15 ,
37 ]。因此,我们假定N-cad的表达水平可能会发挥重要作用的神经源性分化MenSCs通过调节细胞骨架的结构,这将间接影响极性和生物力学的细胞,从而促进MenSCs神经源性分化。
总之,我们的研究结果证实MenSCs的旁分泌作用对神经保护及其分化转化成glial-like细胞的潜力。此外,我们表明,upregulation N-cad可能促进MenSCs神经源性分化。未来的研究将验证转基因MenSCs-based疗法的潜在机制和效应促进周围神经损伤的修复。