1。介绍
升主动脉瘤是一种高风险的血管疾病,表现为扩张或膨胀的升主动脉有多种原因,如主动脉壁受损。随着升主动脉瘤的发展,削弱了主动脉壁的压力无法承受血流量和最终破裂
1]。因此,升主动脉瘤是最致命的心血管疾病。目前,升主动脉瘤的发病机理和病理生理学并不完全清楚,但血管平滑肌细胞(VSMCs)是公认的最重要的因素的发展升主动脉瘤(
1,
2]。现有研究表明,主动脉疾病可能发生当主动脉壁不能处理压力
1,
3- - - - - -
5]。机械破坏、疾病相关的细胞外基质(ECM),扮演着一个重要的角色在主动脉壁重构和凋亡VSMCs [
6,
7]。
Yes-associated蛋白质(笨蛋),参与细胞增殖和细胞凋亡的调控,是一个最重要的细胞信号的参与者
在活的有机体内(
4,
8]。最近的研究表明,YAP调节基因的表达参与了细胞增殖和细胞周期和细胞凋亡在转录水平
8],YAP促进细胞分裂和维护细胞的生活(
9]。狂吠的功能作用也被卷入心脏/ SMC增殖在心血管发育[
10]。根据我们先前的研究中,在肥厚性心肌病(YAP扮演一个重要角色
11]。此外,异常主动脉阳性在光滑
狂吠ko小鼠(
10]。因此,我们问废话还参与细胞外基质通过监管障碍在升主动脉瘤VSMCs的功能。我们的研究结果表明,YAP在人类升主动脉瘤样本表达下调,并增加细胞凋亡VSMCs观察。我们假设YAP与损坏的差别,对这些ECM在升主动脉瘤,已与肿瘤发生[
12,
13),导致VSMCs细胞凋亡的增加。我们也显示主动脉升主动脉瘤等疾病的发生与VSMC凋亡密切相关,这与先前的研究一致(
14- - - - - -
16]。总之,我们的研究结果表明,表达下调YAP与ECM障碍和有助于升主动脉瘤的发展。
2。材料和方法
2.1。临床样本
我们研究所的伦理委员会批准的使用人类主动脉组织样本。正常的人类主动脉从心脏移植捐赠者获得的样本。人类升主动脉瘤样本从接受手术的患者获得更换升主动脉。遗传患者主动脉疾病,如马方氏,Turner Loeys-Dietz,或恰当牵拉,被排除在外。所有组织样本后立即收集他们在手术切除。患者的临床信息如表所示
1。
升主动脉瘤病人的相关信息主动脉组织研究中使用。
| 数量 |
年龄 |
性别 |
升主动脉直径(毫米) |
主动脉窦的直径(毫米) |
主动脉不足 |
主动脉瓣二叶 |
并发症 |
手术 |
| 1 |
65年 |
男性 |
55 |
55 |
温和的 |
没有 |
斯坦福B型主动脉夹层 |
升主动脉置换+总拱支架后替换tetrafurcate贪污和象鼻管植入 |
| 2 |
70年 |
男性 |
52 |
52 |
温和的 |
没有 |
冠心病和主动脉弓的扩张 |
升主动脉置换+部分主动脉弓+搭桥术 |
| 3 |
59 |
男性 |
53 |
50 |
严重的 |
没有 |
没有一个 |
本陶 |
| 4 |
74年 |
男性 |
69年 |
41 |
温和的 |
没有 |
冠心病和主动脉弓的扩张 |
升主动脉置换+部分主动脉弓+搭桥术 |
| 5 |
52 |
女 |
59 |
40 |
温和的 |
没有 |
主动脉弓的扩张 |
本陶+部分主动脉弓替换 |
| 6 |
60 |
女 |
51 |
37 |
严重的 |
没有 |
二尖瓣返流 |
本陶+ MVR |
| 7 |
54 |
女 |
57 |
36 |
严重的 |
是的 |
没有一个 |
本陶 |
| 8 |
54 |
男性 |
50 |
35 |
温和的 |
是的 |
斯坦福B型主动脉夹层 |
升主动脉置换+总拱支架后替换tetrafurcate贪污和象鼻管植入 |
介入治疗:冠状动脉旁路移植;解决:二尖瓣替换。
2.2。弹性蛋白染色
人类主动脉弹性蛋白染色的方法建立了使用弹性纤维染色工具包(Maixin Bio) [
17]。除去石蜡,部分治疗二甲苯和水化。然后,下列程序进行:部分孵化了5分钟Lugol碘溶液,用PBS,孵化与硫代硫酸钠为5分钟,洗PBS和70%乙醇,孵化与aldehyde-fuchsin 10分钟,然后用酸橙孵化G为秒。
2.3。免疫印迹分析
人类主动脉样本收集和储存在不到−80°C。蛋白质提取使用含有蛋白酶抑制剂的一种蛋白质提取设备和蛋白质磷酸酶抑制剂鸡尾酒。等量的蛋白质提取物(40
μg / lane) 10% sds - page凝胶中分离了出来。GAPDH和YAP蛋白质的表达水平与主抗体被孵化探测anti-GAPDH(1: 2000稀释,Sigma-Aldrich)和YAP(1: 1000稀释,细胞信号),分别在6小时在4°C,其次是孵化与红外dye-conjugated二级抗体(1:5000年,罗克兰免疫化学,Gilbertsville, PA) 1小时。然后,结果分析使用一个奥德赛红外成像系统(LI-COR生物科学林肯,NE)。
2.4。组织学和免疫组织化学
人类主动脉样品在10%福尔马林固定,石蜡嵌入式,切割5点
μ米的间隔。使用建立方法进行免疫组织化学染色(
17]。除去石蜡,部分治疗二甲苯和水化。然后,他们孵化H为3%2O2在室温和离心10分钟洗3次磷酸盐(PBS)。与血清阻断后30分钟,部分是孵化主要抗体YAP(1: 1000稀释,细胞信号),
α-平滑肌肌动蛋白(
αsma, 1: 500稀释,σ),bcl - 2(1: 1000稀释,细胞信号),和裂解caspase-3(1: 300稀释,细胞信号),其次是孵化与ChemMate设想系统(Dako)。ImageProPlus 3.0 (ECIPSE80i / 90 i)被用来捕捉图像和分析结果。低温恒温器部分,人类和小鼠主动脉样本固定在4%多聚甲醛,嵌入在最佳切削温度(10月)化合物,在液态氮冷冻,切割5点
μ米的间隔。无出路荧光TUNEL (Promega)是用于检测凋亡细胞。凋亡VSMCs被TUNEL和检测
αsma双染色之前共焦荧光显微镜分析(徕卡微系统)。
2.5。统计分析
数据的统计分析与小动物——一张长有学生的表现
t
以及。数据提出了均值±SEM,除了荧光素酶测定数据的平均数±标准差。
p
∗
<
0.05
或
p
∗
∗
<
0.01
表示统计学意义。
3所示。结果
3.1。升主动脉瘤患者主动脉壁的样品展览损害ECM和增加VSMCs的细胞凋亡
调查升主动脉瘤的发病机制,人类主动脉壁样本8接受升主动脉置换术的患者和年龄在我们研究所收集心脏移植捐赠者。患者的临床信息如表所示
1。有5个男性和3女性的平均年龄
61年
±
8.02
(范围:52 - 72)年。升主动脉的平均直径升主动脉瘤患者术前超声心动图是校准
55.75
±
6.16
毫米,主动脉窦的平均直径
43.25
±
7.89
毫米。两个病人同时从主动脉瓣二叶。不同手术患者接受本陶过程和升主动脉置换术等满足主动脉介入的程度,以及解决方案的并发症,包括冠心病和扩张主动脉弓和斯坦福B型主动脉夹层。计算机断层扫描和术中图像显示典型的升主动脉瘤(图
1(一))。例如,在图
1一个明显的升主动脉瘤直径超过60毫米。错乱的VSMCs和解剖的弹性片晶的弹性蛋白染色观察患者样本(图
1 (b))。通过TUNEL和共焦荧光显微镜分析
αsma双重染色,VSMC凋亡的增加升主动脉瘤患者与正常相比明显控制样品(图
1 (c))。虽然也有一些凋亡细胞正常的人类升主动脉的主动脉壁,他们很少VSMCs(图
1 (c))。基于计算凋亡VSMCs的数量在不同的视图,VSMC凋亡的主动脉壁升主动脉瘤患者被发现显著高于正常的人类控制样品(图
1 (d),
p
=
0.0014
)。我们还检测到凋亡VSMCs升主动脉瘤患者的免疫组织化学染色法裂解caspase-3和bcl - 2(图
1 (e))。免疫组织化学显示,裂解caspase-3染色强和bcl - 2染色弱在升主动脉升主动脉瘤壁相对正常,这两种建议增加细胞凋亡在升主动脉瘤患者的主动脉壁。
(一)术中图像和CTA显示扩大升主动脉升主动脉瘤。(b)弹性蛋白染色显示明显的组织结构错乱的升主动脉升主动脉瘤。(c, d)共焦荧光显微镜显示,TUNEL和的数量
αsma double-staining细胞明显增加的升主动脉壁升主动脉瘤(
p
∗
∗
=
0.0014
)。(e)免疫组织化学显示,裂解caspase-3染色强和bcl - 2染色弱在升主动脉升主动脉瘤壁相对正常。
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3.2。YAP表达减少主动脉壁的升主动脉瘤患者
为了进一步评估狂吠的表达,我们进行免疫印迹和免疫组织化学染色法对蛋白质的丰度进行评估。我们发现显著减少狂吠的蛋白质水平升主动脉瘤患者。免疫印迹显示狂吠的表达降低的升主动脉壁升主动脉瘤患者与正常对照组相比(图
2(一个)使用《奥德赛》),结果分析了红外成像系统发现,这种差异显著(图
2 (b),
p
=
0.0047
)。此外,免疫组织化学显示主动脉壁YAP疲软的升主动脉瘤相对正常,狂吠的差别也建议对这些主动脉壁升主动脉瘤(图
2 (c))。狂吠的共焦荧光显微镜分析
αsma双重染色表明,狂吠的表达减少VSMCs升主动脉瘤患者的主动脉壁(图
2 (d)的差别),它揭示了对这些YAP VSMCs升主动脉瘤。
(a, b)免疫印迹显示表达式的YAP显著降低的升主动脉壁升主动脉瘤患者与正常对照组(
p
∗
∗
=
0.0047
)。(c)免疫组织化学显示,YAP弱在升主动脉升主动脉瘤壁相对正常。(d)共焦荧光显微镜显示,狂吠
αsma double-staining细胞减少升主动脉瘤。
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4所示。讨论
我们的研究结果对主动脉壁的变化是一致的与以前的研究报告(
18- - - - - -
20.)也表明VMSC凋亡的意义在主动脉的病理内侧变性。鉴于获得临床升主动脉瘤的困难样本,发病机制尚未完全阐明,大多数当前的假设来自腹主动脉瘤的研究(
21,
22]。然而,由于升主动脉瘤之间的显著差异,腹主动脉瘤的流行病学、胚胎起源、遗传发展,血流动力学,和病理学,这些假设病因推测从腹主动脉瘤的研究结果不能完全阐明升主动脉瘤的发病机理(
23]。近年来,随着各种实验技术的发展,升主动脉瘤的病因的研究逐渐增加。现有的研究结果表明,升主动脉瘤的发生是一个互动的结果ECM和VSMCs: ECM的变化将引起VSMCs的细胞凋亡,影响主动脉壁的作用,降低弹性纤维的生成,然后引起升主动脉扩张(
24- - - - - -
26]。许多主动脉疾病的发生密切相关的细胞凋亡主动脉VSMCs [
14- - - - - -
16,
27]。在动物主动脉损伤模型,观察到细胞凋亡的主动脉VSMCs [
28,
29日]。然而,没有已知的VSMC凋亡机制升主动脉瘤患者的主动脉壁。
主动脉的血管壁包含三层。VSMCs,媒体是由胶原蛋白和弹性计算约50名,可以高度拉伸(
30.]。升主动脉瘤的病因主要是组织病理学和遗传因素,这表明先前存在的弱点主动脉媒体升主动脉瘤的发生的基础是(
1,
31日]。媒体变性是指囊性变性或坏死的弹性纤维,包括弹性板破裂和凋亡VSMCs [
32,
33]。媒体也退化产生ECM机械应力。此外,细胞凋亡VSMCs可以循环拉伸引起的,这被认为是一个模拟的机械应力
17]。媒体退化,包括断裂的弹性板和细胞凋亡VSMCs,据报道在人类升主动脉瘤(
31日,
32]。与此一致的是,主动脉壁人类升主动脉瘤的样本显示中断弹性薄片,这表明内侧变性在我们的研究中。在costaining TUNEL
αsma, VSMC凋亡的增加患者的主动脉壁升主动脉瘤与正常相比是明确的控制样本。我们也通过执行染色检测细胞凋亡的VSMCs caspase-3裂解,和我们发现的结果类似于通过TUNEL costaining的获得
αsma。
Hippo-YAP通路已报告的一些成员能够诱导细胞凋亡在大鼠主动脉VSMCs [
34]。在这项研究中,我们观察到类似的现象,表达下调YAP伴随着VSMC凋亡,在升主动脉瘤与ECM障碍有关。上面的结果类似于那些由以前的研究报道:由于机械应力的差异造成的ECM调节狂吠的表达至关重要(
13),YAP会抑制细胞培养在软矩阵(
35]。显然,打乱了弹性薄片STAAD软化ECM可变宽度,这可能引起的差别,对这些基因的狂吠。
有几本研究的局限性。最明显的是,结果只描述现象的升主动脉瘤。然而,鉴于主动脉壁的珍贵价值人类升主动脉瘤的样品,这是最真实的描述升主动脉瘤。进一步的研究来阐明升主动脉瘤的机制
在活的有机体内和
在体外将继续在未来;然而,本文的结果提供这种机械研究的基础。此外,由于低数量的样本包含在目前的研究中,我们可能高估的差别的影响对这些VSMCs狂吠。最值得注意的是,细胞凋亡的狂吠的角色VSMCs媒体在升主动脉瘤的观察研究中需要进一步检查。