生成和表征 pdx1-Cre和 LSL-Kras ^G12D动物被前面描述的( 2, 19]。鼠标菌株杂交获得 喀斯特 ^G12D; pdx1-Cre动物。所有菌株C57Bl / 6的背景。PCR、PCR进行消化后尾巴削减通过PCR缓冲与非离子去污剂(PBND)和蛋白激酶(Applichem,达姆施塔特,德国)。慢性胰腺炎的感应,8-week-old老鼠受到caerulein (50 μ克/公斤,3次/周)或二甲亚砜(DMSO)治疗4周。动物实验都使用协议执行机构批准的动物保健和使用委员会菲利普斯大学在德国马尔堡。

腺泡的细胞如前所述[执行隔离 17]。简单地说,整个胰腺解剖和孵化37°C胶原酶I-containing解决方案。切碎的胰腺是经过105年 μ米尼龙过滤分离腺泡的细胞。重复洗涤步骤后腺泡的细胞暴露在含30%胎牛血清培养液在短时间内。然后细胞培养在胶原蛋白补充heat-inactivated 1%胎牛血清,除非另有指示,DMSO和/或ddH对待₂O, CsA (1 μ米),TGF α(50 ng / mL)或EGF (20 ng / mL)。管道被数表示时间点后使用brightfield显微镜和赫斯特33324染色显示细胞的可行性。

腺泡细胞行266 - 6获得Jemal et al。 20.]。原发肿瘤细胞 喀斯特 ^G12D; p 53 Δ / w t ; pdx1-Cre和 喀斯特 ^G12D; p 53 Δ / w t ; 表皮生长因子受体^−−/; pdx1-Cre老鼠一种礼物Jens Siveke你德国慕尼黑。细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM Gibco,达姆施塔特,德国)补充10%胎牛血清(Gibco)或在血清DMEM不必要的氨基酸补充了1%,分别。EGF和TGF β治疗,采用无血清细胞饥饿24 h,然后刺激与EGF (20 ng / mL)或TGF β (10 ng / mL)表示。

NFATc4成分交付的腺泡细胞外植体,NFATc4 shRNA (# 1 5′-CGAGGTGGAGTCTGAACTTAA-3′;# 2 5′-GCCAGACTCTAAAGTGGTGTT-3′)或控制成分(5′-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′)被感染使用慢病毒感染系统如前所述[ 21]。266 - 6的转染腺泡的细胞,NFATc4 siRNA从生活中获得了技术(5′-ccaguccaggucuacuuuutt-3′)。细胞转染与NFATc4 siRNA 48 h,使用lipofectamine 2000(表达载体)。本构活性表皮生长因子受体从马丁Privalsky。构造了reexpression本构活跃的表皮生长因子受体、细胞转染与3 μ克的表皮生长因子受体或控制向量利用lipofectamine 2000(表达载体)。

对RNA隔绝腺泡的细胞,胶原蛋白凝固是我(σ)使用胶原酶溶解。从细胞系和腺泡的细胞RNA分离利用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)和第一链互补DNA合成的1 μ总RNA的g使用随机引物和Omniscript逆转录酶工具包(试剂盒)。RPLP0被用作看家基因基因表达的规范化。鼠标使用以下序列用于表达特定的引物分析:NFATc1(转发:5′-tgggagatggaagcaaagac-3′;反向:5′-atagaaactgacttggacggg-3′), NFATc2(转发:5′-aagaggaaacgaagtcagcc-3′相反:5′-tgggtgctgtgggtaatatg-3′) NFATc3(转发:5′-gaaactgaaggtagccgagg-3′相反:5′-ctggtaaaatgcatgaggtcg-3′), NFATc4(转发:5′-tcttcaggacctctgcccta-3′;反向:5′-agcctaggagcttgaccaca-3′), Sox9(转发:5′-cgtgcagcacaagaaagacca-3′;反向:5′-gcagcgccttgaagatagcat-3′)、细胞角蛋白19(转发:5′-cctcccgcgattacaaccact-3′;反向:5′-ggcgagcattgtcaatctgt-3′)、细胞角蛋白6(转发:5′-gagcagatcaagaccctcaac-3′;反向:5′-aaacataggctccaggttctg-3′)、表皮生长因子受体(转发:5′-acactgctggtgttgctgac;反向:5′-cccaaggaccacttcacagt-3′)和RPLP0(转发:5′-tgacatcgtctttaaaccccg-3′;反向:5′-tgtctgctcccacaatgaag-3′)。

整整蛋白质隔绝细胞系,细胞溶解产物是准备使用裂解缓冲(50更易/ L玫瑰,pH值7.5 - -7.9,150更易/ L氯化钠,1更易/ L glycol-bis乙烯( β -aminoethylether) - N, N, N′, N′-tetraacetic酸、10%甘油、1% Triton x - 100、100 L更易与氟化钠,10更易与L Na₄P₂O₇×10 H₂O)含有蛋白酶抑制剂。免疫印迹分析20 μg蛋白质的提取是通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到硝化纤维素膜(微孔,达姆施塔特,德国)。使用以下抗体蛋白进行检测:NFATc4 (Abcam ab62613 1: 1000) β 肌动蛋白(σ1:20000)。

人类慢性胰腺炎样本来自9不同病人和来自菲利普斯马尔堡大学的病理学研究所按照伦理规定的研究所。免疫组织化学、formalin-fixed石蜡包埋组织被切割(4 μ米)。他走时染色和免疫组织化学进行了如前所述[ 22]。以下使用抗体:NFATc4(圣克鲁斯,sc13036)、表皮生长因子受体(Abcam ab52894) pEGFR(圣克鲁斯,sc101668)和Sox9 (Abcam ab26414)。

266 - 6细胞芯片分析如前所述执行( 23]。简单,细胞被交联中含有1%甲醛在室温下10分钟。交联是终止利用2.5 mol / L甘氨酸。细胞被洗了,在冰冷的PBS收获。得到了核溶解产物和DNA庆兴500个碱基对的碎片,声波降解法。下面的抗体被添加到事先批准染色质在4°C:隔夜孵化NFATc4 (Abcam ab62613 4 μ9727年代g), H3K4me3(细胞信号,2 μg), rna聚合酶II(微孔,05 - 623,2 μg)、兔免疫球蛋白(圣克鲁斯,sc - 2027, 2 μg)和小鼠免疫球蛋白(圣克鲁斯,sc - 2025, 2 μ克)。蛋白质或g琼脂糖添加和孵化2小时。珠子是像之前描述的那样洗 23)和执行回复使用核糖核酸酶(R4642σ),蛋白激酶5 mol / L十二烷基硫酸钠在一夜之间在65°C。DNA是孤立使用phenol-chloroform协议和分析通过使用以下序列中存在利用Sox9引物:+ 370(转发:5′-cgcgtatgaatctcctggac-3′,相反:5′-ggtgttctccgtgtccg-3′)和825−(转发:5′-ccgggaaaggacttgtcag-3′,相反:5′-tctggttcaacgaagctgg-3′)。

除了PDAC起始的关键作用,acinar-to-ductal化生代表一个细胞腺泡细胞的适应过程在应对外部压力信号从而防止stress-mediated细胞死亡,最终会导致逐步再生项目,重建胰腺组织完整性( 24- - - - - - 26]。急性或慢性胰脏炎导致化生的胰腺病变的形成可以宽容redifferentiate成腺泡的细胞细胞上下文( 27]。化生的病变的慢性胰腺炎患者经常表达高水平的表皮生长因子受体(EGFR)家族和他们的天然配体EGF和TGF α( 12, 13, 16]。最近的报告表明,表皮生长因子受体激活集成外部炎症信号到细胞内的程序调解腺泡的细胞适应和去分化( 9, 17, 18, 28]。因此,在一个 在体外方法利用腺泡的细胞从野生型小鼠外植体,激活与TGF表皮生长因子受体信号的刺激 α强烈促进分化转化外植duct-like特色腺泡的细胞进入细胞(图 1(一))。胰腺腺泡细胞的显著分化转移行为针对表皮生长因子受体信号激活基于逐步腺泡细胞的去分化过程和随后的激活导管启动程序( 9, 18]。这个关键的调节细胞可塑性是时空上至少部分由控制核转录因子的激活激活t细胞(NFAT)转录因子家族 22]。NFAT的Ca是一个关键的中介^{2 +}/钙调磷酸酶信号。NFAT功能最初在t细胞活化,调节至关重要的细胞功能相关的适应和分化( 29日]。重要的是,NFAT蛋白质的表达和功能绝不是仅限于免疫细胞。相反,在一些组织细胞适应归因于NFAT-dependent信号和转录 30., 31日]。在胰腺腺泡细胞、基底四Ca的表达水平^{2 +}/ calcineurin-responsive NFAT家庭成员较低(图 1 (b))。引人注目的是,TGF α刺激腺泡的细胞移植组织导致时间NFATc1和NFATc4 mRNA水平,而表达NFATc2 NFATc3并没有改变(图 1 (b)),与先前的报道一致表明NFAT蛋白质没有冗余功能( 32]。TGF最突出的反应 α治疗观察NFATc4,表明激活这个特殊的同种型可能是必要的在表皮生长因子受体signaling-dependent acinar-to-ductal分化转移(图 1 (b))。NFATc4所需检测表皮生长因子受体信号是否激活,我们利用主PDAC细胞 喀斯特 ^G12D; p 53 Δ / w t ; 表皮生长因子受体^−−/; pdx1-Cre小鼠表皮生长因子受体的纯合缺失。如数据所示 1 (c)和 1 (d),NFATc4表达EGFR耗尽细胞较低但诱导响应瞬态超表达的本构活性表皮生长因子受体(数字 1 (c)和 1 (d))。然而,胰腺外分泌细胞的诱导细胞可塑性也被报道TGF治疗炎性细胞因子 β ( 33)和TGF β 治疗胰腺肿瘤细胞促进分化转移程序导致上皮间充质转变(EMT) [ 33]。最引人注目的是,TGF β 基本PDAC刺激细胞获得 喀斯特 ^G12D; p 53 Δ / w t ; pdx1-Cre老鼠导致几个NFAT的诱导基因,包括强大的感应NFATc4 mRNA和蛋白(数字 1 (e)和 1 (f))。最后,我们观察到增加NFATc4染色细胞核的细胞化生的领域内的一个组织的慢性胰腺炎患者(图 1 (g))。综上所述,这些数据都一致认为NFATc4诱导过程中ADM在鼠标外植体模型和人类胰腺组织。

测试是否诱导NFATc4 acinar-to-ductal转换至关重要,我们cotreated腺泡的细胞与TGF外植体 α和环孢菌素(CsA),临床使用钙调磷酸酶抑制剂防止NFAT激活。抑制calcineurin-NFAT信号明显减弱acinar-to-ductal转换,即使在表皮生长因子受体激活(图的存在 2(一个))。因此,管道的形成是抑制和细胞角蛋白19表达减少治疗CsA(数字 2 (b)和 2 (c))。因为药物抑制磷酸酶专门抑制NFAT信号通路和目标个人NFAT家族的成员,我们扩展分析和基因耗尽NFATc4腺泡的细胞移植组织使用两个特定NFATc4 shrna(图 2 (d))。重要的是,损耗显著降低TGF NFATc4表达式 α在这个ADM试验(数字介导管形成 2 (d)和 2 (e))。一致的减少duct-forming能力NFATc4-depleted腺泡的外植体,我们发现减少的表达细胞角蛋白6和19日两个标记基因诱导过程中acinar-to-ductal分化(数字 2 (f)- - - - - - 2 (h))。综上所述,这些数据涉及NFATc4作为关键EGFR-induced转录因子参与腺泡的细胞重新编程。

Acinar-to-ductal分化转移并不局限于细胞的生理机制适应,但现在升值的关键作用在PDAC启动( 8]。重要的是,发展inflammation-driven ADM需要致癌突变的肿瘤病变 喀斯特( 喀斯特 ^G12D)化生的上皮细胞阻止腺泡的再分化和正常胰腺架构的调整 34]。因此,inflammation-induced EGFR信号与致癌合作 喀斯特突变促进胰腺癌生成( 9, 22]。检查是否NFATc4激活参与PDAC起始,我们利用一个 在活的有机体内inflammation-driven胰腺癌生成模型。具体来说,我们使用一种转基因小鼠模型(GEMM)窝藏胰腺具体 喀斯特突变( 喀斯特 ^G12D; pdx1-Cre与caerulein老鼠)和治疗这些动物,一个完善的胰腺炎症诱导物,( 22, 30., 34]。四周治疗导致严重的外分泌胰腺损伤与无序的腺泡的结构和感应acinar-to-ductal化生和PanIN病变早期由于增加胰腺的腺泡细胞可塑性和启动致癌作用(图 3(一个))。重要的是,EGFR表达明显诱导化生的外分泌细胞在胰腺炎症、可视化增强胞质定位的活跃的磷酸化形式caerulein-treated老鼠(图 3(一个))。此前报道,化生的地区特点是强烈的核表达Sox9,感应细胞重新编程的一个关键标志(图 3(一个)),而对照组只显示低胞质表达的转录因子。引人注目的是,化生的地区和PanIN病变高表皮生长因子受体,pEGFR, NFATc4表达Sox9表达式还显示大幅增加(图 3(一个))。符合我们人类慢性胰腺炎样本,分析NFATc4表达应对caerulein ADM地区政府主要在细胞核中发现,因此表明转录因子的活动。

胰腺组织转化的病变的形成和维护依赖转录因子的表达和激活驱动腺泡的分化转移duct-like表型。最近, Sox9是涉及细胞可塑性PDAC起始和进展( 8, 22, 35]。根据这些观察,腺泡细胞外植体显示增加Sox9 mRNA表达表皮生长因子受体激活后(图 3 (b)),这表明Sox9表现在腺泡的细胞转换在转录水平调节。随之而来的表达式NFATc4和Sox9化生的胰腺细胞表明机械连接的转录因子。这种假设是由这一事实进一步加强遗传损耗NFATc4表达不仅改变管形成ADM模型还废除Sox9 mRNA的表达(图 3 (b))。此外,TGF β 调节时间诱导NFATc4原发肿瘤细胞中表达 喀斯特 ^G12D; p 53 Δ / w t ; pdx1-Cre老鼠与Sox9表达式(增加数据 3 (c)和 3 (d))。在一起,我们的数据识别 Sox9作为NFATc4目标基因和暗示这两个转录因子功能驱动分化转移过程在胰腺中合作。

进一步检查机械NFATc4和Sox9表达的相关性,我们执行染色质免疫沉淀反应(芯片)分析腺泡的细胞株266 - 6在激活表皮生长因子受体信号在原发肿瘤细胞 喀斯特 ^G12D; p 53 Δ / w t ; pdx1-Cre老鼠在TGF β 治疗。在这两种电池系统,表皮生长因子受体激活以及TGF β 治疗导致招聘NFATc4的增加 Sox9启动子(图 4(一)和 4 (b)),这与增强H3K4me3和rna聚合酶II的入住率 Sox9子,说明其转录活动(数据 4 (c)和 4 (d))。增加NFATc4绑定 Sox9启动子和增强子活动在细胞外刺激显示关键NFATc4参与Sox9的转录调控。来验证这个假设,我们耗尽NFATc4基因表达在266 - 6腺泡的细胞和调查对言论EGFR-mediated Sox9 NFATc4缺陷的影响。明显,NFATc4损失显著降低EGFR-dependent诱导表达Sox9 266 - 6腺泡的细胞(数字 4 (e)和 4 (f))。

综上所述,这些数据表明,EGFR-stimulated NFATc4基因表达的转录诱导和激活构成的先决条件 Sox9和acinar-to-ductal转分化的过程。