SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/4612531 4612531 研究文章 恢复聚胺代谢模式 在活的有机体内和 在体外模型的人类间充质干细胞治疗缺血性中风后 胫骨 Tae圆 1、2 2 Phukan 创始人Geetika 2 垫片 Jeom很快 2 阮 Duc-Toan 3 金 Yongman 4 Oh-Lee 贾斯汀D。 5 李 Hyeon-Seong 2 沉重的一击 人宋 6 李 Gwang 2 刘 杨ydF4y2Ba 1 分子科学与技术 亚州大学 水443 - 749 韩国 ajou.ac.kr 2 生理学和生物医学科学系的部门 亚州大学医学院 水443 - 721 韩国 ajou.ac.kr 3 国家药品质量控制 48海英航Trung街 河内 越南 4 Pharmicell有限公司 有限公司 凭借462 - 806 韩国 5 心理学系 中央密歇根大学 健康专业建设 MI 48859 美国 cmich.edu 6 药学院 顺天国立大学 韩国顺天540 - 950 韩国 sunchon.ac.kr 2016年 16 6 2016年 2016年 18 12 2015年 22 04 2016年 04 05年 2016年 16 6 2016年 2016年 版权©2016 Tae圆Shin et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

我们研究了PA水平变化的人类从骨髓间充质干细胞治疗缺血性中风(hBM-MSCs)在大鼠大脑模型和培养神经元SH-SY5Y细胞暴露于oxygen-glucose剥夺(OGD)。在缺血大鼠模型中,短暂性大脑中动脉闭塞(MCAo)执行2 h,紧随其后的是静脉移植hBM-MSCs或磷酸盐(PBS) MCAo后的那一天。代谢分析的分析不是从三组:检查在大脑控制老鼠,接受pbs MCAo大鼠(MCAo)和hBM-MSCs-treated MCAo大鼠(MCAo + hBM-MSCs)。在缺血性细胞模型中,SH-SY5Y细胞暴露于OGD 24 h,对待hBM-MSCs (OGD + hBM-MSCs)持续有氧孵化之前,然后收集的样本在coculture 72 h。在 在活的有机体内MCAo缺血性模型中,水平的一些不是大脑MCAo样本和MCAo + hBM-MSCs组与对照组有显著不同。特别是,腐胺、尸胺、亚精胺的脑组织MCAo + hBM-MSCs组相比显著降低MCAo组。在 在体外OGD系统, NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine、亚精胺、 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine,精胺的细胞OGD + hBM-MSCs组的OGD组相比显著降低。

 1。介绍

从骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)被认为是有前途的特工在缺血性中风治疗( 1- - - - - - 4因为分化的可塑性,可获得方便,和免疫反应的诱导能力弱 5- - - - - - 8]。此外,间充质干细胞也被称为抑制炎症相关的中风的病理( 9, 10]。因此,BM-MSCs已被证明是有效地改善功能性赤字以及恢复组织损害发生卒中后( 11, 12]。

在之前的临床报告,自体移植人类从骨髓间充质干细胞(hBM-MSC)对缺血性中风患者建议hBM-MSC提供功能恢复的潜力 13]。虽然这项研究表明自体hBM-MSC移植可能是一个安全的治疗缺血性中风的方法,精确的潜在治疗hBM-MSC移植机制仍然未知。此外,复杂的化学、细胞和生理过程参与的动态监管代谢物在患病的状态。因此,很难即时监控和配置文件动态代谢病状态的变化和治疗结果准确。在不同的生物化合物与低分了权重发生代谢途径,多胺(PAs)作为最重要的生化指标对各种病理条件( 14- - - - - - 16]。天然di -三,tetra-amines,多胺(腐胺、尸胺、亚精胺和精胺),发生在代谢途径,发现在大脑中高浓度 17, 18]。不是从细胞分泌隔间在几个中枢神经系统(CNS)损伤,包括缺血级联(局灶性脑缺血 18, 19]。不受监管的分解代谢的不引起有害代谢物的生产,如过氧化氢、螯合铁2 +通过芬顿反应( 20.),从而增加缺血性损伤( 21- - - - - - 23]。然而,精确的描述和明确的角色不是在脑缺血条件下仍然未知。

在先前的报道,精胺和亚精胺被报告为自由基拾荒者在老鼠脑匀浆,能减少引起的脂质过氧化prooxidant代理,包括喹啉酸(QA)、铁(Fe+ 2)和硝普酸钠(SNP) [ 17, 24]。特别是,精胺减少梗死和神经赤字在老鼠脑缺血模型由使用磁共振成像( 25]。虽然血脑屏障(BBB)严格控制大脑和血液之间的交流在正常代谢条件,诱导聚胺腐胺冻伤的大脑变化焦点的完整性BBB功能障碍( 26]。这些研究,总的来说,支持的建议不是及其代谢起着重要的作用作为关键代谢组组件与细胞在脑缺血后神经退化和化学事件。

为了进一步阐明的有益或有害的作用改变了PA水平作为氧化剂调制代理商中风,本研究旨在分析PA hBM-MSCs评价治疗效果的变化在两个不同的缺血模型。第一个模型利用缺血性中风条件老鼠经历了大脑中动脉阻塞(MCAo),而第二个模型采用oxygen-glucose剥夺(OGD)在培养神经元SH-SY5Y细胞。在我们以前的报告,对于大鼠中风模型,尽管没有显著差异在违反MCAo诱导组卷和神经状态无论hBM-MSCs治疗前7天( 27),游离脂肪酸的水平(远期运费协议)在大脑样本在MCAo显著变化和hBM-MSC-transplanted MCAo组与对照组相比在MCAo后5天。研究发现,肉豆蔻,亚麻油酸和eicosenoic酸的水平hBM-MSC-transplanted MCAo组明显低于对照组( 28]。因此,我们分析了聚胺代谢物在5天,因为这反映了表型相对较好。根据这些观察,其他代谢组学资料,如相关,可能与生理、化学、或细胞条件在缺血性hBM-MSC移植条件。因此,我们将我们的研究扩展到评估代谢的不使用这两种模式 在活的有机体内动物和 在体外细胞模型。

尽管干细胞的治疗效果在缺血性动物模型进行了研究,分析变化不相关分析这些条件还没有尝试。因此,在目前的研究中,同时代谢分析分析脂肪族和乙酰化不进行检查修改的代谢模式不是在MCAo大鼠的大脑静脉hBM-MSCs注入和OGD SH-SY5Y细胞治疗hBM-MSCs使用coculture系统。从目前的实验结果可能会提供新的见解我们理解复杂的生化和生理事件发生在缺血性脑损伤后,hBM-MSC替代疗法在治疗中风和其他相关疾病。

 2。结果 2.1。检测到了移植hBM-MSCs缺血性边境地带

评估MCAo模型,2、3、去除氯(TTC)与脑缺血大鼠进行染色。梗塞,出现白色区域,大多位于同侧皮层和纹状体(图 1(一))。跟踪移植hBM-MSCs 在活的有机体内,我们评估细胞的荧光标签与PKH-26缺血性脑区注射后4天。缺血性地区被发现DAPI和hBM-MSCs贴上NuMA的保证金(约1×10的3 - 5%6hBM-MSCs,图 1 (b));这些结果与以前的报告在同一个模型相一致( 27, 28]。然而,我们没有发现NuMA PKH-26阳性细胞在对照组和MCAo组的大脑部分。确认后中风动物模型和移植的hBM-MSCs缺血性脑区,我们分析的代谢模式不是移植后4天hBM-MSCs到MCAo模型中。

2、3、去除氯(TTC)染色和hBM-MSC anti-NuMA抗体染色,PKH-26, DAPI。(a) TTC-stained日冕大脑部分的控制(上半部分)和MCAo后5天(下半部分)。比例尺= 5毫米。(b) hBM-MSCs贴上MCAo后5天。的本地化hBM-MSCs缺血性地区确定了NuMA(绿色),PKH-26(红色),和DAPI(蓝色);白色箭头表示double-positive细胞。比例尺= 20 μm。

 2.2。老鼠的大脑不是水平模型

调查PA水平的变化之间的控制,控制+ hBM-MSCs MCAo, MCAo + hBM-MSCs (1×106)组,大脑分析分析。九不被发现在老鼠大脑组织的水平的变化被观察到在每个组(表 1)。控制相比,水平的腐胺、尸胺、 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine,亚精胺在MCAo组显著增加,而腐胺、亚精胺的含量显著增加在MCAo + hBM-MSCs组。然而,聚胺水平没有显著差异之间的控制和控制+ hBM-MSCs,除了亚精胺增量。此外,腐胺、尸胺、亚精胺MCAo + hBM-MSCs组显著降低MCAo组相比,但是他们的高水平与对照组相比。

聚胺水平在对照组大鼠的脑组织,与瞬态MCAo组,与hBM-MSCs MCAo组移植后死亡。

数量 复合 聚胺水平(平均数±标准差nmol)在大鼠的脑组织(g)
对照组( n = 10 ) 控制+ hBM-MSCs集团( n = 7 ) MCAo组( n = 7 ) MCAo + hBM-MSCs集团( n = 7 ) p 价值 d
1 NgydF4y2Ba1-Acetylputrescine 374.7±15.3 365.6±12.0 (0.1) 一个 382.3±22.8 (0.2) b 376.6±15.0 (0.4) c 0.3
2 NgydF4y2Ba1-Acetylcadaverine 419.2±17.7 408.3±13.8 (0.1) 428.1±26.9 (0.2) 421.1±14.7 (0.4) 0.3
3 腐胺 109.3±5.0 107.4±3.6 (0.2) 141.9±14.2 (0.000003) 129.7±13.6 (0.0003) 0.06
4 5 -戊二胺 59.5±5.3 64.9±11.9 (0.1) 73.7±9.8 (0.0008) 62.4±5.2 (0.1) 0.01
5 NgydF4y2Ba1-Acetylspermidine 137.0±9.9 145.1±19.3 (0.1) 176.6±24.4 (0.0002) 158.0±25.7 (0.02) 0.1
6 NgydF4y2Ba8-Acetylspermidine 231.8±10.4 225.6±6.9 (0.1) 244.2±14.6 (0.03) 235.5±9.3 (0.2) 0.1
7 亚精胺 172.6±13.8 201.4±13.4 (0.0003) 248.4±44.3 (0.00006) 208.6±37.6 (0.007) 0.05
8 NgydF4y2Ba1-Acetylspermine 140.7±24.2 138.2±28.8 (0.4) 138.4±20.5 (0.4) 130.7±21.2 (0.2) 0.3
9 精胺 513.6±21.3 503.5±19.4 (0.2) 520.7±30.4 (0.3) 513.6±18.4 (0.5) 0.3

一个 学生的 t 以及在95%置信水平的平均值控制和控制+ hBM-MSCs组。

b 学生的 t 以及在95%置信水平的平均值控制和MCAo组。

c 学生的 t 以及在95%置信水平的平均值控制和MCAo + hBM-MSCs组。

d 学生的 t 以及在95%置信水平的平均值MCAo和MCAo + hBM-MSCs组。

每个9的水平不是MCAo的脑组织和MCAo + hBM-MSCs组规范化到相应对照组(图的平均值 2)。PA MCAo的水平和MCAo + hBM-MSCs组显示多个控制意味着值从0.9到1.4不等。与对照组相比,四和三个不被观察到显著的变化在MCAo MCAo + hBM-MSCs组,分别。MCAo和MCAo + hBM-MSCs组、亚精胺的水平被发现是最改变,其次是腐胺相比,对照组。有趣的是,不是,在MCAo升高,降低MCAo + hBM-MSCs组中,大多数不近似的水平对照组水平。代表SIM色谱还透露,腐胺、尸胺、亚精胺MCAo + hBM-MSCs组明显低于MCAo组的,但是他们的高水平比对照组(图 3)。

酒吧的情节MCAo和MCAo + hBM-MSCs组平均水平的基础上九个多胺在老鼠大脑组织变量标准化后相应的对照组的平均值。 p # < 0.05 (与控制) p ∗ < 0.05 (对比MCAo和MCAo + hBM-MSCs组)。数据显示意味着±SE为三个独立的实验。

GC-SIM-MS色谱的腐胺(1),尸胺(2),和亚精胺(3)在老鼠大脑组织控制(a), MCAo (b),和MCAo + hBM-MSCs组(c)。是:内部标准(1,6-diaminohexane)。

 2.3。不是在细胞OGD水平

模拟MCAo动物模型中,我们使用Boyden室(Transwell)来评估是否coculture hBM-MSCs表现出同样的效果,OGD SH-SY5Y系统作为一个 在体外脑缺血模型。PA概要分析与控制( n = 3 ),OGD ( n = 3 ),OGD + hBM-MSCs ( n = 3 )组。七不被发现在每个组的细胞(表 2)。腐胺的水平, NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine, NgydF4y2Ba 8 -acetylspermidine、亚精胺、 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine,精胺显著升高OGD组相对于对照组。特别是, NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine和精胺是增加了2倍以上。与对照组相比,腐胺的水平, NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine、亚精胺、 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine,精胺OGD + hBM-MSCs组明显增加,而 NgydF4y2Ba 8 -acetylspermine明显减少。OGD组相比,腐胺水平在OGD + hBM-MSCs组显著增加,而水平的 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine、亚精胺、 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine,精胺显著下降。

聚胺水平细胞控制,OGD, OGD + hBM-MSCs团体72 h。

数量 复合 聚胺(ng,平均数±标准差)在细胞水平(4×105)
对照组( n = 3 ) OGD集团( n = 3 ) OGD + hBM-MSCs集团( n = 3 ) p 价值 c
1 NgydF4y2Ba1-Acetylputrescine ND d ND ND
2 NgydF4y2Ba1-Acetylcadaverine ND ND ND
3 腐胺 16.4±1.5 21.8±0.9 (0.002) 一个 28.1±0.9 (0.0003) b 0.001
4 5 -戊二胺 12.5±0.2 12.4±0.4 (0.794) 12.6±0.3 (0.861) 0.501
5 NgydF4y2Ba1-Acetylspermidine 45.6±1.8 66.5±0.8 (0.0003) 54.3±4.7 (0.026) 0.006
6 NgydF4y2Ba8-Acetylspermidine 64.4±0.6 56.7±4.0 (0.047) 50.1±3.3 (0.03) 0.082
7 亚精胺 132.5±3.0 212.1±16.7 (0.0002) 180.4±6.9 (0.004) 0.024
8 NgydF4y2Ba1-Acetylspermine 63.4±6.0 127.3±9.7 (0.0005) 110.6±0.6 (0.0005) 0.050
9 精胺 64.9±6.2 243.8±15.1 (0.0002) 177.6±9.5 (0.0003) 0.001

一个 单向方差分析, p 值< 0.05控制和OGD组之间。

b 单向方差分析, p 值< 0.05控制和OGD + hBM-MSCs组之间。

c 单向方差分析, p 值< 0.05之间OGD和OGD + hBM-MSCs组。

d 不确定。

类似于程序中使用MCAo动物模型中,每一层的7细胞的PAs OGD OGD + hBM-MSCs组是规范化到相应的对照组的平均值。这些规范化值被用于星七射线组成的图形,这样的差异之间的平均值控制,OGD, OGD + hBM-MSCs组表现出明显(图 4)。PA水平从OGD OGD + hBM-MSCs组升高歧管(从0.8到3.8),相比平均值控制。OGD和OGD + hBM-MSCs组、精胺是最变化紧随其后 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine,而对照组。有趣的是,不是,在OGD升高,除了腐胺,减少在OGD + hBM-MSCs集团类似 在活的有机体内结果。代表SIM色谱还透露,腐胺、精胺OGD + hBM-MSCs组相比显著改变OGD(图组 5)。

明星符号块OGD和OGD + hBM-MSCs团体基于七个多胺在培养细胞的平均水平为72 h变量标准化后相应的对照组平均值。 p ∗ < 0.05 和 p ∗ ∗ < 0.01 (对比OGD和OGD + hBM-MSCs组)。数据显示意味着±SE为三个独立的实验。

GC-SIM-MS色谱的腐胺(1), NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine(2),亚精胺(3), NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine(4),精胺(5)细胞控制(a), OGD (b), cocultured OGD细胞(c)与hBM-MSCs 72 h。是:内部标准(1、6-diaminohexane)。

 3所示。讨论

我们所知,目前的研究是第一个演示PA代谢改变在脑缺血大鼠的大脑和OGD hBM-MSCs细胞移植后死亡。尽管生成结果的复杂性,目前的结果提供了证据,hBM-MSCs移植可以改善PA代谢障碍与缺血性细胞损伤脑组织和OGD细胞。

在缺血性中风的老鼠模型中,与对照组相比,4 9的水平不增加大鼠MCAo组的大脑。所有不是MCAo组增加,除了 NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine,大大减少在MCAo + hBM-MSCs组(表 1)。在OGD细胞模型中,5 7的水平,除了尸胺 NgydF4y2Ba 8 -acetylspermine,增加oxygen-glucose剥夺了细胞与对照组相比。然而,所有不是OGD组升高,除了腐胺,显著的减少了在OGD + hBM-MSCs组(表 2)。这些结果共同表明PA代谢的干扰MCAo——OGD-induced缺血性条件可以hBM-MSCs移植后恢复到正常状态。

在目前的研究中,hBM-MSCs移植显示有限恢复细胞聚胺内稳态在大鼠MCAo模型因为完全恢复基础水平取决于各种内部和外部因素。此外,聚胺代谢是一个可逆过程中各种多胺改变之间的中间形式( 29日),这使得量化困难多胺的细胞。这也有助于解释有限的数据对聚胺改变OGD模型。为了准确地量化多胺OGD模型,跟踪radiolabelling他们多胺的前体鸟氨酸还是需要的。

在缺血性动物模型中,代谢物轮廓的变化观察亚精胺在MCAo MCAo + hBM-MSCs组。这支持MCAo可能诱发的亚精胺通过腐胺代谢途径,如激活的亚精胺合成酶(spd)由于缺血性条件( 30.]。据报道,精胺和亚精胺浓度的增加对胎鼠大脑急性缺氧反应正好与细胞分化和生长,表明大脑缺氧的保护作用[ 31日]。因为大生理变化描述了腐胺、尸胺在脑缺血,异常高水平的这些代谢物在当下MCAo组可能有助于进一步失衡其他不是 17]。此外,upregulation亚精胺和腐胺和乙酰化形式表明生物合成的增加以及互变现象的途径。我们的研究结果提供的证据表明,移植的hBM-MSCs缺血性脑能够恢复代谢障碍引起的缺血,进一步预防缺血性中风的可能是相关的,在某种程度上,从细胞内释放不正常化舱在大脑缺血。

干细胞是负责细胞更新和维护组织内稳态( 32]。越来越多的证据表明,hBM-MSCs促进功能恢复在缺血性中风动物模型。我们报道了upregulation peri-infarct内生恢复机制的区域(神经发生)的一个重要的角色在缺血性中风后功能恢复hBM-MSCs 14天( 27]。此外,移植hBM-MSCs恢复游离脂肪酸成分在缺血性中风鼠模型( 28]。在这项研究中,我们假设移植hBM-MSCs有助于维护代谢体内平衡之前或在缺血性中风早期病理条件下大鼠模型。

在此前的一项研究中使用类似的缺血性中风MCAo模型,据报道精胺和亚精胺含量都显著降低MCAo后在6 - 24小时缺血皮层比控制皮层( 33]。另一方面,目前的研究结果表明,亚精胺的水平增加,而精胺的水平保持不变的MCAo条件相比,控制条件。这些不同的结果可能认为,至少在某种程度上,不同的方法论的方法用于脑组织做准备。我们使用大脑,从大脑组织获得MCAo后5天。虽然血容量贡献只有1%总组织多胺( 34),本研究中的动物与生理盐水灌注前大脑组织收集为了排除这种可能性的血液对爸爸表达的影响。此外,脑组织的精胺对照组高于亚精胺,显示一个不同的模式相比,以前的报告( 35]。这可能是解释整个大脑的使用而不是特定的大脑区域。

在缺血性大鼠MCAo模型中,重要的是要注意,在缺血性改变不是老鼠大脑测量在hBM-MSC移植后只有一个时间点,也就是说,hBM-MSC移植后4天。PA改变大脑也观察到缺血后只有一个时间点,即MCAo后5天。因此,未来的研究应该评估其他缺血后,以及具有重要时间点。这可能是重要的更精确的评估PA代谢物变化的概要文件时间的方式,允许分析缺血的影响 本身,以及其与hBM-MSC移植、干细胞生存的函数,移民,和功能集成到主机中枢神经系统组织。此外,其他因素,包括干细胞剂量和交付的路线,应该调查与特定的生化过程涉及PA新陈代谢以达到最佳的处理条件和验证hBM-MSC临床方面的潜在应用干细胞治疗缺血性中风和相关疾病。

此外,在一个OGD coculture系统,PA水平也以只有一个时间点,也就是说,在72 h与hBM-MSCs coculture之后,因为,在这种情况下,没有早些时候cytoprotective hMSC的影响。事实上,在接触OGD后24小时,SH-SY5Y细胞的生存能力约为80%或更少在缺乏hBM-MSCs治疗和保持在同一水平hBM-MSC治疗后(数据没有显示)。因此,未来OGD细胞实验应包括分析使用各种OGD曝光时间和/或不同浓度hBM-MSCs更好的描绘功能hBM-MSCs治疗效果之间的关系,改变了代谢组学在这个模型。它也是重要的认识到现在的重要性 在体外OGD实验利用SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系,良好的和成熟的细胞模型系统研究神经元的生长 在体外。干细胞在脑缺血大鼠的治疗效果,然而,不直接相关的神经母细胞瘤细胞,而是更密切相关的其他类型的细胞,如皮质神经元,小胶质细胞和星形胶质细胞( 36, 37]。未来 在体外研究有关的影响在缺血条件下hMSC应该结合使用这些细胞系以及主要细胞评价聚胺对受体的影响(即。门冬氨酸)与突触功能( 38]。然而,大脑的神经胶质细胞是免疫细胞的影响和评估OGD hBM-MSCs移植在这些细胞和神经元,复杂的多级调查如3 d文化是必需的( 39]。hBM-MSCs也导致microgliosis astrogliosis移植大脑( 40]。此外,二级旁分泌hBM-MSCs对居民的影响小胶质细胞和神经元缺氧微环境进一步复杂化。这样的研究将需要更多的仔细考虑的几个关键因素。因此,目前 在体外数据及其潜在临床意义应该被谨慎地直到完成将来的工作与额外的细胞系。

从爸爸的变化水平 在体外模型非常不同于那些获得在脑缺血大鼠模型。特别是,精胺浓度被修改的OGD之后hBM-MSCs cocultures。这种差异被认为是负责选择性神经细胞系 在体外模型和存在的几个细胞类型等脑组织神经元,小胶质细胞和星形胶质细胞。进一步的研究显然是必要的精确描绘底层恢复机制hBM-MSCs移植缺血,自不参与相关的缺血性损伤和改变仍然是未知的。

 4所示。材料和方法 4.1。瞬态MCAo动物模型

介绍了缺血性中风的管腔内的缝合在中风闭塞模型大鼠模型。成年男性Sprague-Dawley麻醉大鼠体重250 - 300克,通过使用面罩,4%异氟烷,维持1.5%异氟烷在30% O2和70% N2o .在手术期间,直肠温度维持在37.0 - -37.5°C和加热垫。瞬态MCAo使用修改后的管腔内的血管阻塞方法在我们的实验室使用( 28]。短暂,4:0手术单丝尼龙缝线与圆形的顶了通过颈总动脉(CCA)和用于屏蔽腔的颈内动脉(ICA)。MCAo后2小时,再灌注是由撤军的缝合,直到提示清除CCA的腔。手术对虚假的群体都是相同的那些用于MCAo手术,除了缝合插入的遗漏。使用动物是动物保健和使用委员会批准的亚州大学医院。

 4.2。2、3、去除氯(TTC)染色和免疫组织化学

确认缺血性动物模型的建立、老鼠与水合氯醛麻醉MCAo后24小时。大脑被立即删除并分段冠方成六片(每2毫米厚度)的啮齿动物的大脑矩阵(哈佛仪器,南纳蒂克,MA),如前所述[ 28]。短暂、脑片被置于2%氯化三苯基四氮唑(TTC);t - 8887;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),孵化在37°C 40分钟,浸泡在10%福尔马林固定。使用平板彩色扫描仪,染色部分拍摄和扫描进行进一步分析。梗塞的大多是位于同侧皮层和纹状体在三片(图代表 1(一))。免疫组织化学,动物牺牲MCAo后一天。大脑被transcardial固定与生理盐水灌注,其次是灌注和沉浸在4%多聚甲醛。大脑一直在多聚甲醛在4°C,然后嵌入在30%蔗糖溶液直到他们沉没。日冕部分30 μ米厚度减少使用模型CM1800低温恒温器(徕卡,位于德国)。的部分被洗了三次磷酸盐(PBS),非特异性结合被马血清,10%,每个部分沾1:500稀释小鼠单克隆人类核矩阵的抗原(NuMA;圣地亚哥Calbiochem CA)。此后,部分和二次抗体清洗和孵化。评估的数量hBM-MSCs内移植,前脑NuMA-positive细胞的总数(bregma-1,大约1毫米)计算十顺序幻灯片每隔150年 μm, NuMA-positive细胞的数量是由加法计算发现在所有10个幻灯片如前所述 27, 28]。跟踪移植hBM-MSCs 在活的有机体内,这些细胞被标记使用PKH 26红色荧光细胞链接器套件(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示。短暂,大脑从MCAo收获或sham-operated动物和4%多聚甲醛固定过夜0.1磷酸盐缓冲剂。冰冻的大脑与Cryocut-microtome系统(德国徕卡)。与4部分被孵化,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;美国丙烯酰胺)在室温下15分钟复染色细胞核和安装。

 4.3。和实验动物组

MCAo后的一天,动物被随机分为三组,在我们以前的报告( 28):(1)虚假的缺血+磷酸盐(PBS)注入(控制, n = 10 ),(2)MCAo + PBS注入( n = 6 ),(3)MCAo + hBM-MSCs (1×106, n = 7 )注入。所有的动物都被允许MCAo后存活5天。MCAo + hBM-MSCs集团与adhesive-removal测试和修改后的神经功能恢复程度评分(mns)测试相比MCAo + PBS组,MCAo后14天( 27]。然而,我们不能发现任何功能恢复在两组5天。

组织提取,从大脑收集分析,由同质化DEPC水(σ,圣路易斯,密苏里州)。大脑样本获得的新鲜在禁食条件下,立即就被储存在 - - - - - - 7 0 °C到分析。排除饮食和其他因素的变化的可能性,我们使用老鼠喂养相同的饮食和保持相同的住房环境在整个研究期间。

 4.4。hBM-MSCs文化

hBM-MSCs提供从Pharmicell(首尔,韩国)文化在GMP(良好生产规范)的条件下在我们的以前的报告( 13, 28]。简而言之,在37°C细胞孵化有限公司5%2在烧瓶一天和不依从细胞被替换的媒介。一旦细胞融合达到约80%,他们收获0.05%胰蛋白酶和0.53 L更易与EDTA (GIBCO,宏伟的岛,纽约)5分钟37°C,山肩瓶,再培养3 - 5天,和收获。为了达到足够的剂量,hBM-MSCs用于这些实验收集从六个段落( 27]。

 4.5。化学药品和试剂

腐胺、尸胺、亚精胺、精胺 NgydF4y2Ba 1 -acetylputrescine, NgydF4y2Ba 1 -acetylcadaverine, NgydF4y2Ba 1 -acetylspermidine, NgydF4y2Ba 8 -acetylspermidine, NgydF4y2Ba 1 -acetylspermine, 1 6-diaminohexane ethylchloroformate (ECF)和pentafluoropropionyl酐(PFPA)从Sigma-Aldrich获得。乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷的农药获得年级关东大(日本东京)。氯化钠,获得Junsei(日本东京),被先后与甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙醚,紧随其后的是真空下干燥(100°C, h)。氢氧化钠是来自Duksan(韩国首尔)。所有其他化学试剂均为分析纯。

 4.6。样品制备的大脑组织

样品准备执行的不是在老鼠大脑样本分析根据我们以前的方法( 41)下列大脑样本:控制,控制+ hBM-MSCs MCAo, MCAo + hBM-MSCs组。脑组织中5毫升蒸馏水均质(3分钟,30000 rpm)在冰水浴使用Pro 200模型转子/ stator-type组织均质器(箴科学,牛津,CT)。脑组织的整除相当于20毫克,包括1、6-diaminohexane (0.2 μg),作为内部标准(是)匀浆,与1毫升vortex-mixed乙腈为3分钟。混合物在15000 rpm离心机,15分钟对蛋白质沉淀。简而言之,乙氧羰基(转换端)的反应是在水相10和20分钟涡 μL ECF出现在1毫升的二氯甲烷阶段。然后,混合物饱和氯化钠和顺序与乙醚提取(3毫升)和乙酸乙酯(2毫升)。提取氮温柔下蒸发流在40°C,它被转换为PFP导数(30分钟60°C)与PFPA (20 μL)分析的气相色谱分析-质谱法(gc - ms)在仿真模式(GC-SIM-MS)如前所述 41]。

 4.7。样品制备的细胞

PA分析分析,如前所述 41),在随后的细胞组:控制、oxygen-glucose不足(OGD),和OGD + hBM-MSCs组。(0.1 μg)被添加到每个细胞整除(4×105细胞)冻融裂解后,受到上述EOC-PFP反应。反应混合物然后分析GC-SIM-MS如前所述[ 41]。

 4.8。暴露SH-SY5Y Oxygen-Glucose剥夺人类神经母细胞瘤细胞

SH-SY5Y细胞(通过< ~ 50)是培养在一个有氧孵化器有限公司为5%2在37°C和湿润。高葡萄糖鹰杜尔贝科的修改中(DMEM),含10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫)和1% (P / S),用于培养。如前所述(执行Oxygen-glucose剥夺 42]。短暂的培养基是取代glucose-free DMEM包含10%的边后卫,和SH-SY5Y细胞被孵化的适应有氧4 h 8×10的孵化器4细胞每厘米2。OGD细胞被转移到一个厌氧室,包含95%的气体混合物N2和5%的公司2在37°C和湿润。媒体随后被glucose-free DMEM使用N被清除2。24小时OGD孵化后,OGD被删除的文化终止室和替换介质glucose-enriched DMEM。其他SH-SY5Y细胞暴露于OGD条件也接受105细胞每厘米2在插入使用transwell hBM-MSCs 72 h (OGD + hBM-MSCs)。OGD集团没有hBM-MSCs包括从有氧锻炼培养相同的一段时间。72 h后所有样本收集。

 4.9。气相

在我们以前的报告中提到,gc - ms分析SIM模式不是在老鼠大脑组织的定量分析进行了安捷伦6890 n气相色谱仪的安捷伦5975 mass-selective检测器(70 eV,电子的影响模式)和安装一个Ultra-2(键合相柱se - 54柱;25米×0.20毫米身份证,0.11 μ交联膜厚度)毛细管柱(安捷伦科技,圣克拉拉,CA) [ 28]。

 4.10。明星符号绘制

PA值测定细胞。对于每一个样本,PA值归一化到相应的正常组的平均值。每个标准化值然后绘制一条线辐射从一个共同的中心点。远结束的7行细胞连接在一起产生一个明星模式为每个组使用MS Excel计划,按照以前的报告( 43, 44]。

 5。结论

我们的代谢组学实验的结果提供了新的见解的理解复杂的生化和生理事件发生在缺血性脑损伤和hBM-MSCs治疗中风的治疗效果。考评的更重要的是,说明代谢hBM-MSCs移植后可以引导未来发展的有效措施或治疗策略对干细胞疗法预防脑缺血或减少缺血性损伤。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

Tae圆Shin和创始人Geetika Phukan同样这项工作。

 确认

作者感谢年轻Kyung Yoon,达研Lee Hyung金公园,和金Hakkyun帮助论文的准备。这项工作是支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会资助的教育、科学、技术(2015060192),重点研究中心计划在韩国国家研究基金会(NRF)由教育部科技(2009 - 0093826),ICT和未来规划(2015 r1a4a1041219),研究生院,亚州大学(2013)。

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