分离、培养男性hAECs如前所述[ 12]。简言之,丢弃胎盘从男性胎儿在怀孕期间获得简单的剖腹产与书面知情同意女人测试为阴性HIV-I和肝炎B和c .剖腹产的迹象是臀先露,重复操作,胎儿窘迫,双胞胎。人类羊膜的机构伦理委员会批准使用这个项目。

机械去皮后的绒毛膜部分胎盘,羊膜,看起来像一个半透明的纸,放在250毫升玻璃瓶包含杜尔贝科鹰中等DMEM / F12的修改。减少剃刀后产量0.5 - 1.0厘米²段,胎盘段与0.25%胰蛋白酶消化/ EDTA在37°C 45分钟。离心机在250×g 5分钟25°C,细胞与PBS resuspended上层清液后丢弃。然后过滤后100年 μ与PBS m细胞过滤器,清洗一次,resuspended,由此导致细胞悬浊液被播种six-well板在DMEM / F12培养基补充10%胎牛血清(美国纽约的边后卫,Gibco大岛),链霉素(100 U /毫升;Gibco)、青霉素(100 U /毫升;Gibco)和谷氨酰胺(0.3毫克/毫升;Gibco)和37°C 5%孵化有限公司₂在湿润的空气。一旦hAECs融合达到80至90%,细胞为实验做好准备。

hAECs固定用4%多聚甲醛在室温下20分钟,然后洗两次与PBS(5分钟)。细胞permeabilized 0.1% Triton x - 100在室温下10分钟然后洗两次1×PBS。然后用阻断细胞被封锁在一夜之间解决方案30分钟和孵化在4°C anti-Cytokeratin 18(博士德鼠标反1:200年,武汉,中国),anti-CD34抗体(Abcam兔子反1:100年,剑桥,妈,美国),和anti-Vimentin(兔子反1:100年,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。与PBS洗了三次,细胞;探讨了FITC-labeled免疫球蛋白g(1: 200年,圣克鲁斯、钙、美国)或罗丹明- (TRITC)标记免疫球蛋白g(1: 100年,表达载体、钙、美国)。荧光图像得到用徕卡DMI3000显微镜(德国海德堡)。

的厘米hAECs准备根据杨协议前面描述的et al。 18),小的修改。百分之八十的支流hAECs与PBS洗两次,然后用无血清培养基为24小时。然后收集并用于媒介 在活的有机体内实验。对于每一个动物,我们使用4×10厘米生成⁶hAECs。CM在300 g离心5分钟通过220纳米过滤和消毒。收集到的CM集中使用Amicon Ultra-15离心过滤单元(3 kDa截止;微孔)。

六个女性C57BL / 6野生型小鼠购自上海SLAC实验动物有限公司有限公司所有的动物保持在12小时光/暗周期可以随意提供食物和水。建立化疗所致卵巢损伤的POI模型,共有85只老鼠作为接受者被一个腹腔内消毒(IP)注入Bu / Cy (busulphan 30毫克/公斤,环磷酰胺,120毫克/公斤,resuspended在DMSO) ( 6]。所有程序涉及动物被批准的机构进行了上海和动物保健和使用委员会按照国家研究委员会指导护理和使用实验动物。注射后,布鲁里溃疡/ Cy-treated和控制动物体重每周两次在9点。

C57BL / 6野生型小鼠被随机分为六组。正常的控制老鼠没有接受治疗 n = 20. )。Bu / Cy组,老鼠只管理Bu / Cy ( n = 15 )。Bu / Cy + hAECs(24小时)组( n = 20. ),老鼠收到Bu / Cy政府然后IP移植4×10⁶hAECs体积的0.2毫升PBS 24 h后。Bu / Cy + hAECs-CM(24小时)组( n = 15 ),老鼠收到Bu / Cy政府然后IP注入0.2毫升厘米由4×10⁶hAECs 24 h后。Bu / Cy + hAECs (7 d)组( n = 20. ),老鼠收到Bu / Cy政府然后IP移植4×10⁶hAECs 7天后。Bu / Cy + hAECs-CM (7 d)组( n = 15 ),老鼠收到Bu / Cy政府然后IP注入4×10厘米生成的⁶hAECs 7天后。管理hAECs或hAECs-CM重复第二天。在每组5只老鼠交配实验,其他老鼠扑杀后28天或14 Bu / Cy管理或第二个治疗。两国从每个动物卵巢收集进行分析。

控制老鼠,Bu / Cy-treated只老鼠,老鼠接受Bu / Cy然后hAECs或hAECs-CM被安置与C57BL / 6雄性小鼠化疗后的一个月。成年男性的生育能力被安置与雌性的比例1:2。窝的数量每怀孕被记录。

收集一个月治疗后,卵巢和卵泡检测和分类。切除卵巢在4%多聚甲醛固定至少24小时。固定后,卵巢是脱水,石蜡包埋,连续切片在5 μ米,安装在显微镜玻片。常规苏木精和伊红染色())和光学显微镜进行组织学检查。原始、小学、中学,窦的毛囊数在每个第五部分。只包含一个卵泡卵母细胞被数,以避免任何卵泡计数两次。毛囊被分类如下:原始卵泡卵母细胞包围一层扁平颗粒细胞;初级卵泡,完好无损放大卵母细胞可见核和一层的立方形的颗粒细胞;次级卵泡,一层以上的立方形的颗粒细胞没有窦的空间;新兴窦的窦的毛囊(包括排卵期前的毛囊)、空间( 19]。

hAECs细胞收集当细胞达到90%到80融合。收集和卵巢样品最后一次治疗后2周。然后从卵巢总RNA分离样品和500 ng的总RNA从每个样本使用primescript RT反转录试剂盒(豆类生物有限公司、志贺、日本)。实时PCR进行互补使用SYBR预混料Taq交货(豆类)Mastercycler ep realplex(埃普多夫,汉堡,德国)。所有反应进行了一式三份,使用25 μL体积。总之,使用一个初始变性进行PCR扩增95°C 5分钟,其次是40周期为30秒95°C, 30秒60°C, 30秒72°C。样本缺乏模板DNA作为一个消极的控制。表中提供的基因的引物 1和 2。

卵巢从治疗和控制动物被固定,脱水,玻化,嵌入在石蜡。卵巢部分(5 μ米厚)deparaffinized二甲苯和水化使用乙醇梯度。水化部分在3%的过氧化氢甲醇洗20分钟在室温和阻塞在PBS(σ)含3% BSA(σ)30分钟。部分被抗体治疗主要包括兔子anti-CD34抗体(1:200;Abcam、剑桥、马、美国),兔子anti-VEGFA抗体(1:50;Abcam)、兔anti-VEGFR1抗体(1:200;细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),或者兔子anti-VEGFR2抗体(1:200;Abcam)抗体检测在一夜之间在4°C。洗后,幻灯片被孵化与合标记anti-rabbit抗体(过氧化物酶反应包、向量实验室、伯林盖姆、钙、美国)。过氧化物酶底物是由使用轻拍(3,39-diaminobenzidine)衬底工具包(向量实验室)。幻灯片与苏木精复染色QS(向量实验室),脱水和安装VectaMount永久安装介质(向量实验室)。

血管生成被MVD测量,由光显微镜分析评估(400×)地区的部分包含最微血管。两个独立的研究人员对实验条件也不被分配到观察和计算每隔十部分MVD在五个部分。微脉管被定义为一个棕色染色内皮细胞集群与不完整的CD34 +内皮和信息联系。五个部分的微脉管数字计算,计算出平均每个卵巢的微血管数量( 20.]。此外,从五个部分卵巢每组调查的平均MVD。

预测是否hAECs从男性胎儿胎盘可以移植到老鼠的卵巢,Y-specific的多重PCR扩增 对不起序列是由Tungwiwat et al。 21),进行小修改。使用TIANamp卵巢DNA提取基因组DNA工具包(TIANGEN,中国)协议提供的制造商。的 对不起特殊序列放大首先通过PCR引物对,Y1.5 (5′-CTAGACCGCAGAGGCGCCATC-3′)和Y1.6 (5′-TAGTACCCACGCCTGCTCCGG-3′)。使用第一个PCR产品作为模板,SRY-specific序列被另一对引物扩增Y1.7 (5′-CATCCAGAGCGTCCCTGGCTT-3′)和Y1.8 (5′-CTTTCCACAGCCACATTTGTC-3′)。十毫升的每个产品在2%琼脂糖凝胶电泳和可视化分析了溴化乙锭染色后光镜下紫外线。嵌套Y-specific片段 对不起基因的长度是198个基点( 21]。Y-specific序列的识别hAECs从男性和女性胎儿胎盘被用作正面和负面的控制。卵巢的雌性老鼠的DNA没有hAECs注射也用作负控制模板。

数据表达每个实验组意味着±SEM。统计学意义是由统计分析软件(GraphPad棱镜,GraphPad软件Inc .)、美国),和学生的评价 t以及。统计学意义时给予 P < 0.05 。

在光学显微镜下,hAECs支流形成cobblestone-shaped单层上皮细胞(图 1(一))。研究干细胞特定基因和上皮基因hAECs,实时PCR。与先前的研究一致( 7),我们发现孤立的AE细胞表达 Oct-4 Nanog,和 Sox2,这些都是参与细胞多能性( 22- - - - - - 24]。此外,我们发现上皮的表达( 细胞角蛋白19( CK19), 钙粘蛋白)和间充质( N-cadherin,波形蛋白,和 蜗牛在培养细胞标记。如图 1 (c),两个 钙粘蛋白和 细胞角蛋白19培养hAECs细胞中高度表达。相比之下,mRNA的表达间充质细胞标记,包括 N-cadherin和 波形蛋白,很低的表达 蜗牛基因没有被探测到。

进一步确定纯度的新孤立hAECs,免疫荧光染色。这些细胞被澄清对CD34阳性染色细胞角蛋白18和消极和波形蛋白(图 1 (d))。几乎所有新孤立hAECs细胞角蛋白是积极的。同时,没有CD34染色观察,这表明,隔离不含有造血干细胞等脐带血液或胚胎成纤维细胞。同时,波形蛋白的缺失表明hAECs没有污染从羊膜间充质细胞。

评估的影响人类hAECs hAECs-CM全身重量,野生雌性老鼠被与Bu / Cy预处理,然后消毒腹腔内管理hAECs或hAECs-CM。正常控制老鼠相比,政府Bu / Cy导致显著减少体重超过7天( 18.72 ± 0.33 克和 17.07 ± 0.26 克, P < 0.01 ,数据 2(一个)和 2 (b))。之间无显著差异观察Bu / Cy-treated老鼠和老鼠收到hAECs或hAECs-CM治疗后Bu / Cy管理在任何时间点。

确认是否男性hAECs可以转移到受体卵巢,PCR分析 对不起序列的Y染色体。如图 2 (c)基因组DNA准备从男性hAECs清楚地展示了198个基点 对不起特殊序列。基因组DNA从女性hAECs和C57BL / 6小鼠卵巢作为消极的控制,与一些非特异性的乐队和缺席的198个基点 对不起特殊序列。有趣的是,虽然198 bp片段被确定在老鼠的卵巢样品接受男性hAECs化疗后的24小时内,没有检测到产品上的老鼠的卵巢样本对待男性hAECs化疗后7天。

确定hAECs通过腹腔移植和hAECs-CM治疗可能恢复卵巢folliculogenesis,串行部分从卵巢hAECs和hAECs-CM治疗1月后沾染了)。如图 3(一个)、管理与Bu / Cy诱导卵泡损失,间质纤维化,闭锁的毛囊。然而,组织学评估显示,hAECs或hAECs-CM治疗化疗后增加了受体卵巢的卵泡数量。

进一步计算卵泡的数量在所有阶段,每一个第五部分进行了分析,和原始的数量,小学,中学,和窦的毛囊数使用光学显微镜。与正常对照组相比,原始的数量( 251.25 ± 26.35 与 31.25 ± 8.5 , P < 0.001 ),初级( 184年 ± 21.57 与 35.75 ± 7.7 , P < 0.001 )、二级( 153.5 ± 12.77 与 2.75 ± 1.89 , P < 0.0001 )和窦的毛囊( 111.25 ± 17.28 与 2 ± 1.22 , P < 0.001 )在Bu / Cy-treated小鼠显著降低。在老鼠的卵巢hAECs处理24小时后化疗,原始的数量( 107年 ± 18.57 )和初级卵泡( 114年 ± 21.81 )相比显著增加Bu / Cy-treated集团( P < 0.05 ,数据 3 (b)和 3 (c))。然而,没有显著差异之间的大量的中等和窦的毛囊hAECs-treated组和Bu / Cy-treated组。此外,原始卵泡的老鼠接受hAECs-CM 24小时与hAECs Bu / Cy管理和小鼠移植后7天后Bu / Cy管理显著增加( 62.33 ± 5.67 和 97.33 ± 6.44 、职责)。此外,与Bu / Cy-treated小鼠相比,窦的毛囊的hAECs-CM-treated组显著增加,是否治疗或化疗后的7天内(24小时 13.33 ± 4.91 与 2 ± 1.22 和 7 ± 1.52 与 2 ± 1.22 分别地, P < 0.05 ,图 3 (e))。

估计的治疗是否hAECs或者通过腹腔hAECs-CM可以恢复卵巢功能,自然雌性老鼠交配雄性老鼠的生育治疗后4周。每个怀孕的窝数计算。的平均数量在布鲁里溃疡组/ Cy-treated老鼠窝( 1。5 ± 0.29 )明显低于正常对照组( 7 ± 0.58 )。治疗hAECs和hAECs-CM Bu / Cy管理24小时后显著增加每个怀孕的窝( 2。7 ± 0.3 和 2.75 ± 0 。 25 、职责)与Bu / Cy-treated老鼠。每个怀孕老鼠窝hAECs处理或hAECs-CM 7天后Bu / Cy管理增加,但没有明显差异。因此,老鼠可以部分改善生育向腹腔注入hAECs和hAECs-CM Bu / Cy-treated老鼠(图 4)。

,据报道,VEGFA及其受体可能参与调节卵泡发展( 17),我们试图检查是否VEGFA通路分子参与卵巢修复治疗后hAECs和hAECs-CM通过分析RNA和蛋白质表达水平使用实时PCR和免疫组织化学。如数据所示 5 (b)和 5 (c),VEGFR2卵巢中表达水平明显降低化疗后2周( P < 0.05 ),以及增加VEGFA表达式( P < 0.05 )的mRNA水平与正常对照组相比。治疗后与hAECs或hAECs-CM VEGFR1和VEGFR2都表达高于Bu / Cy-treated只老鼠(数字 5(一个)和 5 (b))。

免疫组织化学分析卵巢2周治疗后显示VEGFA及其两个受体也有类似的表达蛋白质水平的信使rna表达水平(数字 6- - - - - - 8)。免疫组织化学研究表明,VEGFA、VEGFR1 VEGFR2经常被观察到在正常对照组2周,1个月。VEGFA表达降低,有趣的是,VEGFR1, VEGFR2观察1个月化疗后Bu / Cy-treated组。然而,这些蛋白的表达在hAECs——或者hAECs-CM-treated小鼠卵巢部分恢复的水平与对照组(见补充数据 1 - - - - - - 3 在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2016/4148923)。

CD34,血管的内皮标记用于本研究评估,被免疫组织化学染色在卵巢组织评估MVD。组织学评估表明,CD34-staining船只的数量显著减少后卵巢组织Bu / Cy管理局(数字 9(一个)和 9 (c))。如数据所示 9 (b)和 9 (d)与正常对照组相比,卵巢MVD减少34% ( P < 0.01 )和60% ( P < 0.001 ),分别在小鼠卵巢后2周,1月Bu / Cy管理。治疗一个月后hAECs或hAECs-CM CD34在所有四个治疗组显著高于Bu / Cy-treated集团无论hAECs或hAECs-CM管理的时机。没有明显差异的四个治疗组在治疗后2周(数字 9(一个)和 9 (b))。然而,治疗1月后,卵巢水平hAECs-CM-treated组MVD明显高于hAECs-treated组无论注射时间,24小时或化疗后的7天内( P < 0.05 ,数据 9 (c)和 9 (d))。