SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/1929536 1929536 研究文章 液从人类脐带间充质干细胞:识别、净化和生物学特性 张 本 1 盛ydF4y2Ba 李 1 史 回族 1 锅 Zhaoji 1 吴 一派 1 杨ydF4y2Ba Yongmin 1 张 徐 1 毛 范 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 0098 - 3196 钱 回族 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 0903 - 1973 徐 Wenrong 1、2 2 Ballini 安德里亚 1 江苏省重点实验室实验室医学 医学院的 江苏大学 镇江 江苏 中国 ujs.edu.cn 2 附属医院 江苏大学 镇江 江苏212000年 中国 ujs.edu.cn 2016年 25 12 2016年 2016年 18 06 2016年 19 07年 2016年 20. 07年 2016年 25 12 2016年 2016年 版权©2016本Zhang et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

我们和其他组织发现,间充质干细胞(msc)导出液是许多疾病的新治疗方法。在这项研究中,我们总结了一个方法来提取和净化hucMSCs-exosomes使用超滤和梯度离心法在我们的实验室和证明hucMSCs-exosomes准备根据我们的过程是稳定和生物活性。结果表明,液源自hucMSC 40 ~ 100 nm CD9和积极的研究。功能,hucMSCs-exosomes促进细胞增殖和保护对抗氧化压力诱导细胞凋亡 在体外ERK1/2和p38的激活。有趣的是,紫外线照射废除液在氧化应激的监管角色,表明hucMSCs-exosomes exosomal航天飞机可以调节细胞生长和凋亡的RNA。此外,细胞因子分析显示,hucMSCs-exosomes含有高剂量的il - 6,引发和其他细胞因子。建立方法是实用和有效的,它提供了一个基础为进一步评估hucMSCs-exosomes作为治疗药物的潜力。

 中国国家自然科学基金 31340040 81272481 81270214 81572075 81670549 81670502 江苏省高校优秀科技创新团队 SJK2013-10 江苏省优秀医学学术领袖和科技创新团队项目 LJ201117 优先级的学术程序开发江苏高等教育机构 1。介绍

液是40 - 100纳米细胞外膜的囊泡内吞作用的起源,是首先在1980年代早期发现( 1- - - - - - 3]。液释放到细胞外环境与质膜融合的多泡体( 2, 4- - - - - - 6]。液被大多数细胞分泌,已经检查了到目前为止,包括肥大细胞、树突状细胞( 7, 8),B细胞( 6),T细胞( 9),肿瘤细胞( 10, 11),上皮细胞。此外,液被发现在许多生物体液( 1, 11- - - - - - 16)包括等离子体( 12),尿 13],唾液[ 14),和母乳 15]。

它已经表明exosomal蛋白质成分取决于研究液的细胞来源。不论起源、几种常见蛋白质存在于液,包括监护人,细胞骨架蛋白,和tetraspanins如CD9、CD63,研究[ 17- - - - - - 20.]。此外,更多的研究表明,液也含有大量的小分子,可以从一个细胞转移到另一个地方。液可以很容易地与靶细胞通过特定receptor-ligand交互和航天飞机的模式定义组件(如蛋白质,生物活性脂质,RNA诱导生物效应( 19, 21- - - - - - 24]。因此,许多调查执行演示液在旁分泌/内分泌的作用过程和遗传信息交换在不同细胞中因其重要的生物活性组织微环境( 21, 22]。

越来越多的研究指出人类间充质干细胞的潜在贡献在不同类型的组织损伤的恢复 25- - - - - - 28]。虽然它已经证明了msc调解组织修复通过旁分泌和分化转移机制,负责他们的角色的细节不是很清楚。我们最近的研究表明,液源自人脐带msc (hucMSCs)缓解CCl4-induced肝纤维化、增强皮肤的伤口愈合,修复cisplatin-induced急性肾损伤(AKI) [ 29日- - - - - - 33]。在这些研究中,我们建立了一个方法来提取和净化液从hucMSCs超滤和梯度离心法。在此,我们发现更多的关于这个方法的详细信息和其他hucMSC-exosome的函数 在体外。

 2。材料和方法 2.1。液的分离和纯化

HucMSCs孤立如前所述在我们的工作( 34]。所有实验协议是江苏大学的伦理委员会批准。70% - -80%的支流hucMSCs文化是洗两次磷酸盐(PBS),然后采用无血清培养低葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(LG-DMEM) 48小时。条件培养基收集和离心机在1000 g×20分钟去除细胞碎片,随后在2000×g离心20分钟和10000 g×20分钟。上层清液的收集和集中使用100 KDa MWCO(美国微孔)在1000 g×30分钟。集中上层清液加载在5毫升30%蔗糖/ D2O垫子,然后离心器在100000 g×60分钟(最优- 90 k,贝克曼库尔特)。microvesicles-enriched分数是收获和PBS稀释,然后离心三次1000 g×30分钟使用100 KDa MWCO。最后,净化液收集和0.22进行过滤 μ美国米孔隙过滤器(微孔)和存储在−70°C。

 2.2。透射电子显微镜法

20 μL滴净化液被吸附到铜网格,在室温下放置1分钟,吸附多余的液,沾30 g / L磷钨酸在室温下(pH值6.8)5分钟;样例干半瓦灯下。样本使用透射电子显微镜成像(范Tecnai 12日飞利浦)。

 2.3。sds - page分析和免疫印迹

sds - page分析,总在hucMSCs和液分离蛋白质12% SDS-polyacrylamide凝胶和沾Coomassie蓝色。免疫印迹分析,蛋白质被electroblotted到硝化纤维膜分离后12% sds - page。膜阻塞和孵化主要抗体孵化与辣根peroxidase-coupled二级抗体紧随其后。乐队与发射极耦合逻辑+可视化系统从Amersham法玛西亚生物技术(英国白金汉郡)。抗体的来源主要是如下:CD9(美国Bioworld技术)的研究(美国Epitomics), β肌动蛋白(美国Bioworld技术)、p-ERK1/2 T-ERK1/2, p-P38, P38(美国圣克鲁斯生物技术),PCNA(美国Bioworld技术),GAPDH(上海康晨生物技术,中国)。

 2.4。细胞培养和氧化应激的治疗

H9C2(2 - 1)细胞培养在HG-DMEM 10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)。hl - 7702细胞培养国家统计局rpmi - 1640年为20%。国家统计局在HG-DMEM NRK-52E细胞培养的10%。诱导氧化应激,H9C2 (2 - 1), hl - 7702和NRK-52E细胞暴露在300年,300年和500年 μM H2O2分别为24、6和6个小时。H9C2 (2 - 1)、hl - 7702和NRK-52E细胞系都购自中国科学院细胞银行上海。

 2.5。细胞生存能力

细胞生存能力评估MTT试验( n = 5 )。1×103每口井的细胞被播种在正常条件和5×103每口井的细胞被播种在96孔板在氧化条件下,分别。然后,细胞接受不同剂量的hucMSCs-exosomes(100年和800年 μg / mL) 24和48小时在正常条件下使用hucMSCs-exosomes (800 μg / mL)在氧化条件下24小时。孵化后,吸光度测量使用标在570海里。

 2.6。细胞凋亡

细胞凋亡是评估使用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定和线粒体膜电位测定。TUNEL分析使用一个执行 原位细胞死亡检测设备(武汉博士德生物工程,中国)根据制造商的指示。TUNEL-positive凋亡细胞数连续的10个领域里的幻灯片。线粒体膜电势进行了使用JC-1检测设备(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)根据制造商的指示。荧光显微镜下观察荧光信号。

 2.7。免疫组织化学

免疫组织化学染色的细胞增殖核抗原(PCNA)是使用一个南非广播公司执行免疫组织化学检测设备(武汉博士德生物工程,中国)根据制造商的指示。这些细胞被固定、阻塞和孵化与主抗体(1:200)2小时1小时的二次抗体紧随其后。PCNA-positive连续的10个领域里的细胞数的幻灯片。

 2.8。紫外线照射

HucMSCs-exosomes受到紫外线照射(254海里)在4°C[1小时 35, 36]。控制是保持在4°C没有紫外线照射1小时。这两个液被添加到细胞在800的浓度 μg / mL和细胞培养在H2O2全身的氧化应激。

 2.9。细胞因子的数组

概要文件和细胞因子的浓度在hucMSCs-exosomes和hucMSCs的条件培养基使用Luminex分析量化。

 2.10。统计分析

数据是平均数±标准差。统计分析了方差方差分析使用棱镜软件(美国圣地亚哥图垫)。统计 p 值小于0.05被认为是重要的。

 3所示。结果 3.1。表征HucMSCs-Exosomes

透射电子显微镜分析显示一个球体形态净化液,平均直径为40 - 100纳米(图 1(一))。蛋白质提取液的分离12% sds - page凝胶和沾Coomassie蓝色。如图 1 (b)的提取液浓缩蛋白质分子量从55到72 KDa这浓缩并不是影响制冷或声波降解法。等量的蛋白质提取物hucMSCs和hucMSCs-exosomes分析使用抗体针对CD9和研究西方墨点法,exosomal标记。结果表明,CD9和研究持续表达hucMSCs-exosomes(图 1 (c))。在一起,这些结果表明,我们已经成功地分离和鉴定从细胞外液hucMSCs媒介。

从hucMSCs表征液。(一)透射电子显微镜分析hucMSCs细胞外囊泡分泌的。酒吧规模:100海里。(b) Coomassie蓝染色。蛋白质提取的hucMSCs-exosomes被sds - page分离。(c)的免疫印迹分析exosomal标记使用抗体CD9和研究。

 3.2。HucMSCs-Exosomes体外刺激细胞增殖<斜体> < /斜体>

孵化的H9C2 (2 - 1), hl - 7702,并与hucMSCs-exosomes NRK-52E细胞促进细胞增殖剂量和时间的方式相比,控制细胞的孵化与车辆单独(条件培养液(图) 2(一个))。进一步证明了信号通路由液,我们检测到的总水平和磷酸化ERK1/2通路与细胞生长紧密联系。结果表明,液治疗导致的增加的磷酸化ERK1/2(图 2 (b)),这表明hucMSCs-exosomes ERK1/2磷酸化可能通过upregulation促进细胞生长。

HucMSCs-exosomes促进细胞增殖 在体外。(一)HucMSCs-exosomes剂量和时间的方式促进细胞增殖。结果显示为均值±SD ( n = 5 )。 p ∗ < 0.05 , p ∗ ∗ < 0.01 , p ∗ ∗ ∗ < 0.001 与对照组相比。(b)的免疫印迹分析细胞内磷酸化ERK1/2处理800 μg / mL hucMSCs-exosomes表示。(一)H9C2 (2 - 1);(B) hl - 7702;和(C) NRK-52E。

 3.3。HucMSCs-Exosomes保护体外细胞生存能力<斜体> < /斜体>

氧化应激引起的H2O2导致损失的细胞生存能力 在体外。我们进一步测试如果hucMSCs-exosomes促进细胞存活在H2O2全身的氧化应激。液,添加了来自不同来源的细胞24小时,然后细胞暴露于氧化应激对不同时期的时间和细胞生存能力被MTT试验检查。如图 3(一个)H2O2减少细胞的可行性,但hucMSCs-exosomes增加细胞生存能力的比例相比,H2O2组,表明液的预处理对抗H2O2全身的细胞死亡。我们还发现exosome-free条件培养液没有显示修复作为hucMSC-exosome并不能扭转的H2O2全身的抑制增殖(图 3 (b))。我们证实了这种保护作用是特定于hucMSCs-exosomes液从人类纤维母细胞(细胞库的中国科学院上海)(HFL-exosomes)没有保护作用。Exosomal航天飞机的RNA对液的作用至关重要。测试如果exosomes-mediated细胞保护是由于RNA受伤细胞的转移,我们暴露出液为1小时紫外线(254海里)RNA紫外线灭活功能。结果表明,液,暴露于紫外线对细胞生存能力失去保护作用(图 3(一个))。我们进一步证明了H2O2治疗抑制磷酸化p38的细胞,但预处理液恢复的磷酸化水平(图 3 (b))。

HucMSCs-exosomes保护细胞生存能力 在体外。(一)MTT试验。H9C2 (2 - 1)、hl - 7702和NRK-52E细胞使用不同来源的hucMSCs-exosomes (800 μg / mL) 24小时,其次是暴露在H2O2(300 μ米)为24小时。结果显示为均值±SD ( n = 5 )。 p ∗ ∗ < 0.0 1 和 p ∗ ∗ ∗ < 0.0 01 相比,H2O2组。(b) MTT试验。H9C2 (2 - 1)、hl - 7702和NRK-52E细胞使用不同来源的hucMSCs-exosomes (800 μ克/毫升)或exosomes-free hucMSCs收集的条件培养基(EX-free-CM) 24小时,其次是暴露在H2O2(300 μ米)为24小时。结果显示为均值±SD ( n = 5 )。 p ∗ ∗ < 0.0 1 和 p ∗ ∗ ∗ < 0.0 01 相比,H2O2组。(c)磷酸化p38的蛋白免疫印迹分析。H9C2 (2 - 1)、hl - 7702和NRK-52E细胞使用hucMSCs-exosomes (800 μg / mL)其次是暴露在H2O2如上所述。

 3.4。HucMSCs-Exosomes促进氧化应激下细胞增殖

我们进一步证实hucMSCs-exosomes保护作用的细胞免疫组织化学染色可行性的增殖细胞核抗原(PCNA)。HucMSCs-exosomes被添加到细胞24小时,然后细胞暴露于氧化应激对不同时间。结果表明,H2O2治疗抑制增殖细胞的百分比,而液治疗废除这种效果(数字 4(一)和 4 (b))。

HucMSCs-exosomes促进氧化应激下细胞增殖。(一)增殖细胞核抗原的免疫组织化学染色。H9C2 (2 - 1)、hl - 7702和NRK-52E细胞使用hucMSCs-exosomes (800 μg / mL) 24小时,其次是暴露在H2O2(300、300和500 μ米)在不同时间点(24、6和6小时)。(a - c) H9C2 (2 - 1);(D-F) hl - 7702;和NRK-52E(胃肠道)。控制(A、D、G);H2O2(B, E、H);和hucMSCs-exosomes (C、F和我)比例尺:100 μm。(b)的定量分析PCNA-positive细胞的百分比。 p ∗ < 0.05 和 p ∗ ∗ ∗ < 0.001 相比,H2O2组。

 3.5。HucMSCs-Exosomes抑制H <子> < /订阅> O <子> 2 < /订阅>全身的体外细胞凋亡<斜体> < /斜体>

TUNEL染色表明,H2O2治疗导致的凋亡细胞比例的增加,但与hucMSCs-exosomes预处理减少凋亡细胞的比例较低程度(数字 5(一个)和 5 (b)),这表明hucMSCs-exosomes抑制H2O2全身的细胞凋亡 体外。为了进一步证明如果液调节细胞凋亡通路,我们进行线粒体膜电势分析和结果表明,H2O2治疗H9C2线粒体膜电势的增加(2 - 1),hl - 7702和NRK-52E细胞(结果未显示),而hucMSCs-exosomes治疗降低线粒体膜电位比H2O2组(图 6)。总的来说,hucMSCs-exosomes抑制H2O2通过调节mitochondria-mediated全身的细胞凋亡细胞凋亡途径。

HucMSCs-exosomes抑制H2O2全身的细胞凋亡。(一)TUNEL染色。H9C2 (2 - 1)、hl - 7702和NRK-52E细胞使用hucMSCs-exosomes (800 μg / mL) 24小时,其次是暴露在H2O2(300、300和500 μ米)在不同时间点(24、6和6小时)。(a - c) H9C2 (2 - 1);(D-F) hl - 7702;和NRK-52E(胃肠道)。控制(A、D、G);H2O2(B, E、H);hucMSCs-exosomes (C、F和I)。酒吧规模:100 μm。(b)的定量分析TUNEL-positive细胞的百分比。 p ∗ < 0.05 相比,H2O2组。

HucMSCs-exosomes抑制H2O2全身的线粒体激活。H9C2(2 - 1)是使用hucMSCs-exosomes (800 μg / mL) 24小时,其次是暴露在H2O2(300 μ米)为24小时。细胞受到JC-1染色,持续15分钟。荧光显微镜下观察到的信号。控制(a, d);H2O2(b, e);和hucMSCs-exosomes (c、f)。

 3.6。细胞因子的HucMSCs-Exosomes

液包含特定类型的细胞因子调节其功能。然后我们决定hucMSCs-exosomes细胞因子的浓度和条件培养液的hucMSCs Luminex试验( n = 3 )。结果表明,hucMSCs-exosomes表达了很多细胞因子包括gm - csf, IL-15, il - 6,引发,TNF - α,il - 1 β2、il - 10(表 1),il - 6和引发出现在高剂量(> 100 pg / mL)。

细胞因子的识别hucMSCs-exosomes并使用Luminex hucMSCs。

细胞因子的名字 HucMSCs-exosomes (pg / mL) HucMSCs (pg / mL)
gm - csf 1.75 8.94
IL-15 4.02 0.51
IL-17 < 0 < 0
il - 6 123.57 649.96
引发 285.26 5024.88
肿瘤坏死因子- α 0.02 0.11
伊尔- β 0.05 0.31
- 2 0.06 0.21
表皮生长因子 < 0 3.54
il - 10 0.74 0.73
VEGF < 0 13.65
4所示。讨论

在这项研究中,我们对此已进行了隔离和确定液从人脐带msc的生物物理和生物特性:(1)浮动30%蔗糖的缓冲液是一个特定的属性;(2)纳米尺寸分布的液(40 - 100 nm);和(3)exosomal蛋白表达(CD9和研究)( 17- - - - - - 20.]。我们的研究结果证实,我们孤立的细胞外介质的微泡hucMSCs液。我们建立的是一种实用和有效的方法从hucMSCs过程分离和净化液。

液的确切功能尚未完全了解,虽然收获液从不同的细胞调节多种生物效应,包括抗原,诱导细胞凋亡,促进肿瘤细胞生长( 6, 37- - - - - - 42]。似乎液从不同的细胞有不同的功能。在当前的研究中,我们表明,液源自hucMSCs刺激对细胞增殖的影响,保护作用对H2O2全身的细胞死亡( 43),这表明液从hucMSCs准备使用我们的过程是生物活性和支持性的角色在心肌细胞等细胞的生长,肝细胞、肾细胞。

来自不同实验室的工作表明,释放液是一种机制,细胞物质和信号转移到其他细胞。液是圆形膜囊泡。核酸和蛋白质在液膜结构的保护。液有一个特定的成分反映他们的起源和不仅可以转移膜组件也不同细胞之间的核酸。紫外线照射的液废除对防止氧化应激的影响细胞死亡,这表明RNA穿梭通过液是一种关键的效应器的生物效应。我们也确认液包含几种类型的细胞因子,il - 6和引发是最主要的。进一步的研究需要在hucMSCs-exosomes定义这些细胞因子的生理作用。

使用液的优势在再生医学而不是干细胞本身是避免可能的长期病理道细胞的分化。细胞疗法相比,non-cell-based疗法通常更容易生产和安全的,因为它们是不能存活的,不引起免疫排斥反应。因此,从hucMSCs液的分离和鉴定提供了一种新颖的方法来治疗疾病,如心肌缺血/再灌注损伤。

除了他们的组织再生能力,msc和他们的外来体也显示免疫调节特性( 44, 45]。msc持续低水平的表达主要组织相容性complex-I分子和不表达costimulatory分子如CD80、CD86,或CD40,从而缺乏免疫原性( 46]。基于这些特性,使用msc治疗自身免疫性疾病和移植物抗宿主病。MSC的免疫抑制特性的最早迹象来自研究与人类,狒狒,小鼠MSC证明MSC能够抑制早期激活和内扩散 在体外( 46- - - - - - 49]。msc抑制免疫球蛋白生产和逮捕在G0 / G1期细胞的细胞周期 50]。总之,msc具有一个非常不同的免疫抑制特性( 51]。MSCs-exosomes immune-modulating活动中可能会发挥不同的作用和机制。拉赫曼等人报道,异常或过量液释放这些MSC-like前体细胞在小岛可能引发的组织自身免疫NOD小鼠病毒( 52]。MSC-derived细胞外囊泡还能防止缺血后免疫抑制( 45]。这两项研究的回顾MSC-exosome能增强免疫的激活。然而,其他组织认为MSC-exosome抑制炎症反应,诱导组织再生。MSCs-derived外来体抑制促炎因子的分泌TNF - α和il - 1 β但增加抗炎因子TGF -的浓度 β( 53]。张等人认为MSC-secreted外来体有可能减弱一个激活免疫系统通过抗炎细胞因子的诱导和亚群 54]。上述研究表明,免疫调节也可能在组织再生外来体的一个重要机制。

总之,在这项研究中,我们建立了一个实用和有效的方法分离和识别液从人类脐带干细胞和演示hucMSCs-exosomes在刺激细胞增殖的作用,防止氧化应激细胞凋亡。我们的工作提供了一个基础为进一步评估hucMSCs-exosomes的潜在治疗药物。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

本张、李沈和回族施正荣同样贡献了这项工作。

 确认

这项工作得到了国家自然科学基金(基金号。31340040,81272481,81270214,81572075,81670549,81670502),江苏高校优秀科技创新团队(格兰特SJK2013-10),江苏省优秀医学学术领袖和科技创新团队计划(批准号LJ201117)和优先级的学术程序开发江苏高等教育机构。

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