iPS1和iPS2 ([ 13];WiCell)和hESC线、H9 ([ 14];WA-09;WiCell),被用于这项研究。段数字范围从71到94年(iPS1), 33至48 (iPS2),和85年到140年(H9)。使用无菌技术进行了组织培养过程中II级生物安全柜,最近描述( 12]。干细胞维持在37°C, 5%的公司₂,分化37°C, 10%的公司₂在湿润的孵化器。

干细胞是维护和分化使用[描述程序之前 12]。简而言之,未分化的细胞保持在淘汰赛血清替代媒体(1:1 DMEM / F12 Glutamax,分离血清替代20%,10毫米不必要的氨基酸,和55毫米 β巯基乙醇;所有购买的生活技术)补充10 μ克/毫升的基本成纤维细胞生长因子(bFGF;Peprotech)一层mitotically灭活人类喂食器(ccd - 1079人类包皮成纤维细胞细胞系sk;写明ATCC)。这些细胞被例行每周通道。

对神经干细胞分化谱系的细胞治疗与‘诺金’媒体,包含neurobasal媒体(现;B27 neurobasal N2为1%,2%,2毫米谷酰胺、青霉素、链霉素和0.5%;所有从生命技术),购买500 ng / mL的‘诺金’(研发系统),重组和4 ng / mL bFGF的两周。促进neurosphere形成,细胞殖民地机械切割成小段和转移到96 -低依恋板(Sigma-Aldrich)含有非补充表皮生长因子(EGF);Peprotech)和bFGF (20 ng / mL)。四天后(18 DIV), neurospheres被镀到糊化器官培养菜含有一层灭活人类喂食器(ccd - 1079 - sk;写明ATCC),现补充EGF和bFGF (20 ng / mL),其次是治疗Rho-kinase抑制剂Y27632 (25 μ在19和20 M, Sigma-Aldrich) DIV [ 12]。neurospheres是cocultured与早期产后耳蜗移植组织21岁和28个DIV。

Time-mated怀孕Hooded-Wistar老鼠从生物研究中心获得阿德莱德大学,澳大利亚。两个coculture化验工作。第一个试验涉及coculturing神经元干细胞与耳蜗外植体(毛细胞和外围一个纤维)从产后一天获得3/4 (P3/4)老鼠幼崽。外植体只有控制设置为每个实验相同。第二coculture试验涉及培养的神经元干细胞去神经的耳蜗外植体(毛细胞只有[ 3, 15从P2/3])解剖老鼠幼崽。每个实验重复使用动物从三个不同的窝一式三份。

耳蜗移植组织的解剖老鼠从早期产后使用[描述方法之前 16]。毛细胞突触发生化验,从外围ANs的过程,剖析从而切除神经耳蜗外植体,使用先前描述的技术( 3, 17]。耳蜗移植组织和去神经的耳蜗外植体(仅毛细胞)是生长在0.4 μm organotypic膜(微孔)coculture媒体包含现补充脑源性神经营养因子和neurotrophin-3(每个添加给10 ng / mL的最终浓度;Chemicon)。

整个耳蜗外植体是两种21-day-old cocultured hiPSC或hESC neurospheres(图 1)。去神经的耳蜗外植体与21个DIV或28 cocultured DIV hiPSC或hESC neurospheres。cocultures孵化在37°C, 10%的公司₂1 DIV(外植体只控制),或10 DIV(干细胞+外植体/去神经的外植体cocultures)。每2 DIV coculture媒体补充(100 μL /膜)。

cocultures和外植体被浸泡在4%多聚甲醛固定约10分钟,随后仔细冲洗三次(5分钟),磷酸缓冲盐(PBS)。后的外植体只控制固定1 DIV,而实验cocultures固定后10 DIV。外植体都是应用与相关组合下列主要抗体:兔子anti-Myosin VIIa (1: 100;蓝宝石生物科学;25 - 6790),鼠标反神经丝(IgG1) (hNFM;1:1500;蓝宝石生物科学;MAB5186),鸡anti-Neurofilament H(免疫球蛋白)(1:1000;微孔;AB5735)、山羊anti-Prestin (1: 400;ThermoFisher科学; sc-22692), mouse anti-Peripherin (IgG1) (1 : 1000; Millipore; MAB1527), rabbit anti-synapsin 1 (1 : 200; Life Technologies; A6442), and goat anti-parvalbumin (1 : 3000; Swant; PVG-214).

耳蜗外植体cocultures,主抗体稀释在主屏蔽解决方案(0.1% Triton-X (Sigma-Aldrich),包含2%的相关血清,山羊(Abacus ALS)或驴(微孔)在PBS稀释),然后添加到膜在200 μL /前一夜之间被存储在4°C湿润容器。第二天,这些细胞被冲洗三次五分钟在初级阻塞的解决方案。Alexa Fluor-conjugated二级抗体(所有从生活购买技术)稀释在二级屏蔽解决方案(渐变(Sigma-Aldrich) 0.1%, 2%在PBS山羊血清或驴,如上所述)被添加到膜卷200 μL /。幻灯片被转移到箔覆盖,湿润的容器,在室温下2小时在黑暗中与温和的旋转。2小时后,这些细胞被洗了三次五分钟在PBS,安装与ProLong-Gold不变色试剂包含核染色4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;表达载体),第二天用清漆。

去神经的耳蜗外植体,cocultures被封锁在初级屏蔽解决方案(山羊血清在PBS Triton-X 0.1%, 10%) 1小时与温和的旋转。更高比例的血清用于减少突触化验cocultures背景染色。主要的抗体稀释在初级屏蔽解决方案在200年 μL /添加到细胞膜,并存储在一夜之间在4°C湿润容器。第二天,细胞在初级阻止溶液清洗(8×10分钟)。Alexa Fluor-conjugated二级抗体被稀释在二级屏蔽解决方案(0.1%的渐变,10%的山羊,或驴血清在PBS)并添加到膜在200年 μL /。二次抗体稀释前后纺在二级屏蔽解决方案。幻灯片被转移到箔覆盖,湿润容器和留给1.5小时在室温下在黑暗中与温和的旋转。1.5小时后,膜在PBS洗了三次五分钟,安装与ProLong-Gold不变色包含DAPI试剂,第二天和密封的清漆。

彩色外植体可视化使用共焦显微镜和图像被使用一个LSM 510元共焦扫描激光系统蔡司AxioImagerZ1显微镜。光学切片厚度被设置为8.49 μm。禅宗数码影像软件(卡尔蔡司)被用来处理和分析图像。

耳蜗外植体cocultures,外植体的四个区域随机选择和量化40 x放大。神经干细胞的数量过程接触与毛细胞数相对于毛细胞的总数在选定的区域。另外,我们注意到总数的外植体干细胞毛细胞观察神经支配,并与同期的总数外植体的研究。我们以后用这个号码为了能够直接比较我们的结果与最近的相关出版物使用鼠标iPSC-derived神经元( 9]。

突触发生化验,总数去神经的耳蜗毛细胞的外植体数在63 x放大。头发细胞的数量使接触synapsin 1阳性神经干细胞过程计算[ 17),相对于毛细胞的总数。

coculture数据的统计分析进行了使用GraphPad棱镜(第6版)。数据是正态分布(Anderson-Darling测试),一个学生的 t 以及使用。对于非参数数据,克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析(方差分析)是用来确定统计学意义组之间的比较。的值 p < 0.05 被认为具有统计学意义,与范围的意义吗 p ∗ ≤ 0.05 , p ∗ ∗ ≤ 0.01 , p ∗ ∗ ∗ ≤ 0.001 。数据提出了均值的平均值±标准误差(SEM)。

为了调查hiPSC-derived神经元是否可以联系他们周边的目标(感觉毛细胞),21个DIV神经祖细胞来源于两个hiPSC线(iPS1和iPS2)和一个hESC (H9;控制)线与P3/4 cocultured整个耳蜗外植体(图 2(a))。10 DIV, hiPSC和hESC-derived神经元优先扩展他们的流程和外植体。相比直接组织神经支配模式中观察到孤立的耳蜗外植体(图 2(b)),神经干细胞的过程以杂乱无章的方式(数字增长 2(c) - 2(e))。此外,神经过程观察延长对和沿行人工耳蜗毛细胞的外植体。神经过程在丛生的束沿基底外侧表面的毛细胞在几个干细胞cocultures,类似于正常的模式在哺乳动物耳蜗OHC神经支配(数字 2(d)和 2(e))。更高的放大倍数下,hiPSC——和hESC-derived神经元观察进行直接接触的感觉毛细胞外植体。然而,hiPSC-derived神经过程由细胞接触更少的头发比为(iPS1 16.9 + 4.8%, n = 16 , p ∗ < 0.05 ;iPS2 16.4 + 3.6%, n = 17 , p ∗ < 0.05 ;H9 39.5 + 12.1%, n = 12 ;图 2(f))。总的来说,没有显著差异的平均数毛细胞iPS1和iPS2细胞系是联系整个cocultures检查( p = 0.38 ;图 2(f))。然而,当数据分析的外植体的毛细胞数量联系的神经元干细胞,神经支配的iPS2细胞系表现出更大的一致性iPS1线相比,(iPS1 n = 16 支配,62.5%的外植体;iPS2 n = 17 支配,94.2%的外植体; p ∗ < 0.05 )。

探讨神经干细胞的过程是否包含ihc联系,ohc,或者两者兼有,Prestin外植体的抗体被用来区分ohc cocultures(图 3(a))。所有头发细胞肌球蛋白VIIa积极,但只有外毛细胞表达蛋白质Prestin电动机。正如所料,后1 DIV中的ohc数量有显著提高外植体包含ihc相比(图 3(e); p ∗ ∗ ∗ < 0.001 )。10 DIV,显著减少的总体数字包含IHC和OHC在世,展示包含IHC的相对比例的下降和OHC通常观察耳蜗内。cocultures,没有观察到显著差异的数量包含ihc干细胞源性的神经过程,联系,ohc的数量相比,这些细胞联系(数字 3(b) - 3(d)和 3(e);iPS1包含ihc = 12.3 + 5.8%, ohc = 9.4 + 5.9%, n = 6 , p = 0.79 ;iPS2包含ihc = 18.5 + 12.2%, ohc = 23.2 + 12.2%, n = 7 , p = 0.73 ;和H9包含ihc = 27.1 + 12.4%, ohc = 32.9 + 5.8%, n = 6 , p = 0.68 )。值得注意的是,iPS1-derived神经元显示显著减少ohc相比H9-derived神经元(神经支配 p ∗ < 0.05 ;图 3(e))。

iPS2-derived神经元的神经支配方面的更有效率时考虑的总百分比支配外植体(94.2%, p ∗ < 0.05 )和更少的数量后由iPS1-derived神经元支配ohc 10 DIV ( p ∗ < 0.05 ;图 3(e)), iPS2和hESC-derived神经元的突触能力比较。我们首先检查去神经的耳蜗外植体1和10 DIV(数字 4(一)- 4(d),职责)。远端后去神经的耳蜗移植组织的流程缺席1 DIV,但残余NFM的积累在毛细胞somata(图 4(一))和synapsin 1积极puncta(图 4(b))是在这个时间点观察。相反,经过10 DIV,减少NFM头发细胞内积累somata(图 4(c))和突触puncta没有发现(图 4(d))。coculture后neurospheres干细胞去神经的耳蜗外植体(图 4(e)),神经过程预测对孤立的感觉毛细胞观察(数字 4(f) - 4(我))。21个DIV neurospheres被发现的神经过程表达高水平的synapsin 1和synapsin 1积极观察puncta colocalize parvalbumin-positive感觉毛细胞的去神经的外植体(数字 4(f)和 4(g))。此外,毛细胞和hiPSC-derived神经元之间的突触连接观察发生在一个 顺道方式:单一探明干细胞多次与多个毛细胞突触连接。类似的观察报告hESC-derived神经元(图 4 (g);( 3])。microisolate试验用于当前出版导致混乱的头发细胞生长和一些头发细胞衰老两周后 在体外( 3, 17]。这是由于文化,主要是成纤维细胞和支持细胞,分裂后外植体隔离和扰乱正常毛细胞安排在扩散。由于螺旋器从外植体的显微解剖,毛细胞通常不保留他们的安排行由于缺乏超微结构通常提供在整个组织。

我们下一个量化中观察到的差异iPS2和H9-derived神经元的突触形成能力cocultured时要么分化的早期阶段(21 DIV)或后期的分化(DIV) 28日去神经的耳蜗外植体。21个DIV cocultures包含更多的干细胞的过程也包含synapsin 1点的接触感觉毛细胞,相比在28 DIV(数字cocultures检查 4(f) - 4(我))。更具体地说,神经元来自21个DIV H9 neurospheres更与毛细胞突触连接,相比来自28 DIV neurospheres (H9 21 DIV(31.1 + 9.1%)和28个DIV (12.5% + 16.7): n = 8 ; p ∗ < 0.05 ;图 4(j))。此外,H9-derived神经元支配来自21个DIV neurospheres也明显更大数量的毛细胞,相比从28 DIV neurospheres iPS2-derived神经元(iPS2 28 DIV (4.6% + 9.3): n = 8 ; p < 0.05 ;图 4(j))。

在耳蜗移植文化,hiPSC-derived神经元观察扩展他们的神经过程向感觉上皮,使直接接触包含ihc和上凸轮轴 在体外,一个重要的第一步突触重建的输入(图 3)。然而,与成人ANs的有序神经支配模式相比,神经突hiPSC-derived似乎杂乱无章的方式向感觉上皮生长,像神经支配的模式开发ANs(数字 2 (c) - 2 (e);( 18- - - - - - 20.])。这是由观察期间鼠标发展的早期阶段(E18-P0),从听觉神经突神经元表现出不成熟和高度支化形态,I型和II型ANs刺激活动包含ihc和上凸轮轴 在活的有机体内( 18- - - - - - 20.]。随着开发的进展,这些神经元接受大量的突触修剪和神经细化,这样最终I型神经元只包含ihc和II型神经元接触ohc [ 18]。

它曾被观察到早期产后ANs的传入树突突触标记孤立的感觉上皮的表达(synapsin 1和synaptophysin)与毛细胞再生他们的联系 在体外( 8, 21, 22]。还发现了各种探明干细胞表达synapsin 1地区毗邻毛细胞coculture模型( 3, 4, 7, 8]。因此,synapsin 1的表达被认为是神经干细胞的能力的初步指标/ ANs与毛细胞再生或可能形成功能性突触( 23]。在目前的研究中,大量punctate-like synapsin 1表达观察沿着hiPSC-derived神经过程的接触与毛细胞在去神经的外植体文化(图 4(f))。此外,观察突触puncta干细胞在基底外侧colocalize毛细胞表面,指示的能力与感觉毛细胞hiPSC-derived神经元形成突触 在体外(图 4(f))。

我们最近报道,hiPSC-derived神经元有更高水平的感官神经标记表达式在稍后的时间点的区别(28-35 DIV;( 12])。因此我们怀疑干细胞分化的神经元从这些后期将有不同的潜力激发头发细胞相比,相同的神经元来自分化的早期阶段。我们发现hiPSC——hESC-derived神经元cocultured在早期阶段的区别(21 DIV)与更多的毛细胞突触形成,相比更分化神经元干细胞(28 DIV)。这些发现强调的重要性的阶段分化神经元干细胞的功能集成能力和支持基本原理,神经祖细胞可能有更好的功能结果 在活的有机体内相比,更加分化的神经元 24]。这个假设被最近的进一步支持 在活的有机体内研究报告,部分听力功能恢复可以实现移植后早期hESC-derived耳神经祖细胞进入耳聋沙鼠cochleae [ 10]。

同时hiPSC-derived神经元能够直接接触感觉毛细胞 在体外,他们也观察到接触较少的毛细胞相比hESC-derived神经元。此外,没有显著差异的毛细胞数量iPS1和iPS2-derived神经元直接接触 在体外,这表明类似的神经支配效率。然而,有趣的是,如果数据是量化基础上的文化观察神经支配,iPSC线检查之间的矛盾明显。具体来说,iPS1-derived神经元较低的文化头发细胞神经支配,iPS2相比,hESC-derived神经元( p < 0.05 ;图 2)。我们(和其他人)曾报道,hiPSCs更变量分化潜力相比为( 12, 25, 26]。与这些研究结果一致,本文提供的数据表明,人类多能干细胞的神经元存在差异,特别是hiPSC-derived神经元在神经支配的潜力 在体外。然而,这里需要指出的是,不同细胞系中可能出现在他们的最佳分化协议(例如,一个特定治疗的具体时间)。因此,未来的研究评估多个细胞系使用优化的差异化协议将被要求评估细胞系能力。另一方面,有可能观察到的可变性的存在可能是由于遗传和表观遗传异常最近发现hiPSC行来源于病毒整合重组方法( 23]。然而,当前研究的结果强调与使用相关的潜在关注人类多能干细胞移植的干细胞系。

在细胞移植治疗方面,存在可变性细胞系之间可能有几个后果。例如,可能会有不同数量的ANs来自每个病人和可变性的集成能力,因此可能导致不一致的功能结果患者获得治疗。进一步支持这个想法,陈和他的同事们报告了不同程度的听觉hESC-derived神经元移植后的功能恢复到沙鼠cochleae [ 10),这可能是由于细胞分化的潜在变化。这些发现重申的必要性来减轻潜在的病人之间的功能性结果不一致,干细胞疗法的临床前的翻译。hiPSC线使用病毒生成集成方法的使用可能会减弱,这是值得这些可变性调查前hiPSC-derived神经元移植到耳蜗。所描述的 在体外cocultures提供一个概念验证模型的测试不同的干细胞系的能力,他们之前在分化的不同阶段 在活的有机体内交付。

除了细胞移植疗法,能够成功地对功能区分hiPSCs ANs的发展可以促进患者的细胞系模型退化”的菜肴。”更具体地说,hiPSC-derived ANs的推导患者遗传形式的SNHL,包括开创的综合症,Branchiootorenal综合症,或者华尔登布尔氏综合症(等等),将使我们获得更深入地理解这些条件的机制。此外,它将允许使用最新的基因编辑技术,如定期聚集空间短回文重复——(CRISPR)相关的内切酶 24, 27, 28]纠正这些针对疾病的细胞系中的基因异常,还提供一个大规模药物筛选平台可能抑制一个变性 29日]。建模的好处使用hiPSCs显然是许多疾病;因此,这项研究提供有用的见解的潜力hiPSCs概括ANs的功能。

总之,目前的研究表明,hiPSC-derived可以直接接触并形成突触前神经元连接发展毛细胞 在体外。此外,观察到神经祖细胞来源于多能干细胞cocultured在分化的早期阶段相比有更高的潜在神经支配神经祖细胞cocultured在稍后的阶段。这些有前途的结果直接通知我们hiPSC聋人耳蜗移植研究和作为基础的进一步研究听觉神经诱导多能干细胞的使用替代品。