1。介绍
心肌梗死(MI),造成对心脏的血液供应中断,是实验的主要目标干细胞/祖细胞疗法。虽然间充质干细胞(MSC)的疗效已被归因于他们的分化成修复或更换细胞类型(
1),治疗心血管血统的重要性还有待阐明。趋化因子受体CXCR4、G-protein-coupled 7-transmembrane受体,结合其主要配体基质细胞衍生因子(SDF) 1
α作为干细胞/祖细胞活动的主要监管机构。SDF-1的重要性
α/ CXCR4信号已经被记载在趋化因子受体CXCR4基因敲除老鼠,死在子宫内。这表明这receptor-ligand轴的基本发展作用[
2]。从我们实验室之前的研究,转基因使用MSC
体外adenoviral转导过度表现趋化因子受体CXCR4在MSC (
MSC
CR
4
)[
3]。这些研究决定,
MSC
CR
4
分泌多种细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子- 1 (IGF)
α为了应对缺氧,增加内源性再生过程(
3]。
液是天然膜结合nanovesicles (50 - 100 nm),扮演一个角色在膜的选择性释放或胞质蛋白质,rna,和/或小分子核糖核酸(microrna),调节细胞间信号的某些方面(
4]。然而,一般来说这些液不是技术选择性释放”的“负责任的信号分子,因为他们并没有“选择”分子货物本身;他们只是作为转运蛋白。最近,A2B1 (hnRNPA2B1)已经证明人为选择小监管rna加载到液通过识别特定的短序列(
5]。在细胞内液形成水泡的大多数细胞释放细胞当多泡体与质膜融合(
6]。先前的研究表明,液从祖细胞含有分泌释放旁分泌刺激新血管形成的因素,从而调节心脏保护在心肌缺血/再灌注损伤(
7]。目前的研究重点是确定的影响采用cell-patch包含分离和纯化液
MSC
CR
4
在大鼠心肌梗死(MI)的模型。梗塞区,补丁被植入和多种技术被用来研究移植血管形成的水平和变化。本研究使用这些结果来调查的机械参与液的影响
MSC
CR
4
MI后获得任何表达式包括VEGF和IFG-1 proangiogenic变化因素
α。假设液来自
挂式
CR
4
将植入细胞释放血管生成因素表,主要通过血管生成恢复心脏功能,心肌梗死区域内部和外部的心外膜(电池片)。
2。材料和方法
2.1。隔离和鼠骨髓MSC的文化和新生儿心肌细胞(CM)
实验用动物或动物材料按照指南进行的护理和使用实验动物(NIH出版数量85 - 23,1996年修订),在辛辛那提大学的指导方针和协议批准机构动物保健和使用委员会。MSC从健康8-week-old Sprague-Dawley (SD)大鼠骨髓中分离的吸入物(如前所述
3,
8]。通道2 - 4 MSC被用于这项研究。MSC在高葡萄糖培养杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)和1%的抗生素(青霉素和链霉素)37°C潮湿的空气中有5%的公司2。当细胞人口达到70 - 80%的融合,所有细胞实验进行无血清或抗生素和至少重复三次。新生儿厘米是孤立的新生大鼠心室的幼童使用新生儿厘米隔离设备(卫氏生化)所描述的
9]。细胞被维护在杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM培养基,Hyclone)和10%的边后卫。
2.2。与慢病毒转染的MSC结构
慢病毒载体主干pGreenPuro成分(pGP)购买了从系统生物科学(CA)山景城。多个克隆站点之间的pGP BamHI和EcoRI限制性内切酶小干扰rna模板设计的网站被替换为我们构建shRNA向量pGP-siR /制造商的协议。慢病毒载体overexpressing CXCR4是我们之前的出版物中描述
10]。生产用于MSC慢病毒转染,293元生产细胞(系统生物科学)与pGP-siR暂时性的转染和pGP-null pPACKH1 HIV Lentivector包装设备(系统生物科学)。病毒上层的收获和添加到宿主细胞对病毒基因组72小时融入MSC基因组。MSC在这项研究中被分成以下组:(1)MSC与零慢病毒载体转染(
MSC
Ctrl
);(2)MSC与慢病毒载体转染过多表达的趋化因子受体CXCR4 (
MSC
CR
4
);(3)对趋化因子受体CXCR4 MSC与核转染(
MSC
siCR
4
)击倒趋化因子受体CXCR4表达。
2.3。外来体隔绝条件培养基
所有细胞都生长在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)中补充5%的exosome-depleted的边后卫(足协)(青霉素和链霉素系统生物科学)和1%(表达载体)。MSC被播种在100 mm细胞培养皿2×105细胞/菜。一夜之间允许细胞连接后,介质被取代和细胞培养3天的大约80%融合的新媒介。液随后被隔离条件培养基使用ExoQuick-TC外来体净化试剂(系统生物科学)制造商的协议。由此产生的外来体颗粒resuspended约200
μ在−80°C L PBS和存储后续量化(使用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂)和分子分析。液在这项研究中被分成以下组:(1)液隔绝
MSC
Ctrl
(
挂式
Ctrl
);(2)液隔绝
MSC
CR
4
(
挂式
CR
4
);(3)液隔绝
MSC
siCR
4
(
挂式
siCR
4
)。
2.4。透射电子显微镜(TEM)分析
外来体颗粒是由2%戊二醛和2%多聚甲醛固定(PFA) 0.1米索伦森磷酸盐缓冲剂的3小时(描述
10]。四氧化锇固定在1% (OsO430分钟),在分级系列液洗,脱水的50%,70%,80%,90%,100%乙醇和嵌入在环氧树脂812。(~ 60海里)超薄部分被剪掉了,莱卡Ultracut开普敦大学超微切片机,与雷诺兹醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色,观察用透射电子显微镜(JEOL jem - 1230)。
2.5。液的内化
液与PHK67 prelabeled(σ)所描述的
11),然后用厘米cocultured DMEM包含10%的边后卫48小时。液的吸收厘米被清洗停止在寒冷的PBS,紧随其后的是固定在4% PFA的MSC exosome-transduced CM使用奥林巴斯显微镜BX41配备CCD (MagnaFire,奥林巴斯)相机。
2.6。TUNEL分析
CM处理各种液被暴露于低氧条件(O2/公司2incubator-MCO-18M,三洋)37°C O为1%2:5%的公司2N: 94%2为24小时。然后从各种细胞治疗组与4%多聚甲醛固定在室温下30分钟。TUNEL使用无出路进行了荧光TUNEL系统(Promega)按照制造商的指示。核与DAPI染色在室温下5分钟。TUNEL阳性细胞核的数量确定后计数细胞在随机选择的微观领域在20 x使用荧光显微镜(BX41,奥林巴斯)。使用数码相机图像记录和分析使用MagnaFire 2.1软件。
2.7。管形成分析
管形成的试验进行分析工具包(Chemicon)根据制造商的指示
12]。简而言之,capillary-like结构的形成是评估在24-well板使用增长因素都可以降低人工基底膜。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC) (3×104细胞/)被播种在固化人工基底膜(500
μ信用证)2小时。前液(100
μ信用证)治疗。后的HUVEC被视为组:(1)HUVEC +
挂式
Ctrl
,HUVEC处理
挂式
Ctrl
;(2)HUVEC +
挂式
CR
4
,HUVEC处理
挂式
CR
4
(3)HUVEC +
挂式
siCR
4
,HUVEC处理
挂式
siCR
4
;(4)HUVEC +
挂式
Ctrl
+ LY, HUVEC +
挂式
Ctrl
额外的PI3K抑制剂LY294002(治疗组10
μ米);(5)HUVEC +
挂式
CR
4
+ LY, HUVEC +
挂式
CR
4
额外的LY294002(治疗组10
μ16小时后米)。。,the total tube length was quantified using software Image-Pro Plus 5.1. LY294002 was purchased from Cell Signaling Technology.
2.8。西方墨点法
短暂,MSC和导出液细胞溶解在裂解缓冲,pH值7.4 (50 mM玫瑰、5毫米EDTA和50毫米氯化钠),1% Triton x - 100、蛋白酶抑制剂(10
μg / mL抑肽酶,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,10
μg / mL亮抑酶肽)和磷酸酶抑制剂(50毫米氟化钠,1毫米原钒酸钠、焦磷酸钠和10毫米)。蛋白质样品(40
μg)使用SDS-polyacrylamide凝胶电泳和electroimmunoblotted描述(
8]。蛋白质转移后,样本对PVDF膜可视化使用一个增强化学发光系统(表达载体),暴露在x射线胶片,然后由激光扫描测密度术量化。感兴趣的特定用于检测抗原的抗体在下面列出:anti-CXCR4(微孔),anti-Akt, anti-pAkt(手机信号技术),anti-IGF-1
α、anti-CD9 anti-CD63,反
β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术)。
2.9。定量rt - pcr (qPCR)
收集细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(技术)。总RNA中用于逆转录miScript II RT工具包(试剂盒)。中使用的引物序列如下:VEGF正向引物5′-GGCAGCTTGAGTTAAACGAAC-3′,反向引物5′-TGGTTGGTGTGA-CATGGTTAATCGGTC-3′;
β肌动蛋白正向引物5′-TGTCATCCTCCCAATCCCTCAGAA-3′,反向引物5′-TGTGGTGCCAGATCTTCTCCATGT-3。每个目标的褶皱变化mRNA表达相对
β肌动蛋白基于阈值的计算周期(CT),
r
=
2
- - - - - -
Δ
(
Δ
C
T
)
,ΔCT= CT(目标)−CT(
β肌动蛋白)和Δ(ΔCT)=ΔCT(实验)−
Δ
C
T
(控制)。一个Bio-Rad CFX96实时系统和计算进行了使用Microsoft Excel。
2.10。细胞表准备
MSC (3.2×105细胞/厘米2)液处理
MSC
Ctrl
或
MSC
CR
4
被播种到3.5厘米鬼屋方面的菜肴从CellSeed购买公司(日本东京)和培养细胞为15% FBS-DMEM在37°C。然后,汇合的细胞在鬼屋方面的菜肴是孵化20°C。10 - 20分钟,细胞分离自发和漂浮到介质单层细胞板。后立即超然,细胞表转移到心肌梗塞的面积的描述(
13,
14]。
2.11。心肌梗死的外科手术
结扎左冠状动脉前降的执行(小伙子)在SD雌性大鼠(200 - 250克),如前所述[
12]。简而言之,吸入异氟烷麻醉诱导了自发的和维护在全身麻醉下1 - 2%异氟烷。吸入气体是空气和氧气和异氟烷的混合物。动物被机械通风使用啮齿动物呼吸机(型号683,哈佛装置,南纳蒂克,MA)连接到一个气管导管。体温维持在37°C整个手术。开胸心脏暴露了左侧有限和小伙子与一个6 - 0聚酯的结扎缝合1毫米从通常的位置左心耳。之前关闭胸腔,呼气末正压通气应用于肺部充分膨胀;然后,肌肉层和皮肤分别被关闭。这个模型提供准确和可再生的梗塞大小的信息。调查外来体心脏功能的作用,SD大鼠随机分为以下组:(1)虚假的组:虚假的老鼠有一个宽松的缝合操作周围放置童子冠状动脉; (2) MI group (MI alone created by LAD ligation); (3) MI + PBS group (MI + Phosphate buffered saline alone treatment); (4) MI + MSC group (MI + ordinary MSC sheet); (5) MI +
MSC
ExoCtrl
集团(MI +液分离MSC与零慢病毒转染向量,然后用MSC治疗表);(6)心肌梗死+
MSC
ExoCR
4
集团(MI +液分离MSC与趋化因子受体CXCR4过度表达慢病毒转染向量,然后用MSC治疗表);(7)心肌梗死+
MSC
ExosiCR
4
集团(MI +液分离MSC与核与趋化因子受体CXCR4慢病毒载体转染然后用MSC治疗表)。
2.12。免疫组织化学分析
发现的血管化是血管性血友病因子(vWF)表达(
12]。MI简要、心脏组织在4周后被收获,10%福尔马林固定,切片在5
μ米厚度。心肌肌钙蛋白T (cTnT)是用来确定厘米。信号是可视化二次抗体共轭驴anti-rabbit (FITC;杰克逊ImmunoResearch)或驴anti-mouse (Tritc;杰克逊ImmunoResearch),分别。DAPI被用来识别核。与奥林巴斯BX41显微镜和荧光成像进行船舶数量每毫米2在4个随机选择的字段数。
2.13。分析左心室(LV)纤维化
固定的心脏组织嵌入石蜡,LV截面从mid-LV顶点沾马森三色的被用来量化各治疗组左心室的纤维化。LV区域每个幻灯片上的图像被使用一个奥林巴斯BX41显微镜拍摄配备CCD (MagnaFire,奥林巴斯)相机。LV纤维化面积和总LV的每个图像测量使用Image-Pro +(媒体控制论Inc .,卡尔斯巴德、钙、美国),和纤维化区域作为一个LV总面积的百分比计算(纤维化面积/ LV总面积)×100%。
2.14。通过超声心动图心脏功能评估
超声心动图(iE33超声波系统,菲利普斯)15 MHz探针进行电池片放置4周后,研究小组或治疗失明,评估收缩压,舒张压的维度。心脏成像在2 d烈度看来最伟大的LV的直径与动物在全身麻醉。LV舒张和收缩末期直径测量从M-mode录音使用前沿的方法。左室射血分数(EF)计算EF(%) =(左心室舒张末期维度(LVDd)3−左心室收缩末期维度(LVDs)3)/ (LVDd)3×100%。部分缩短(FS) MI和补丁程序的水平也决定为[(LVDd−LVDs) / LVDd]×100%。所有测量进行根据美国超声心动图学会尖端技术和平均连续心脏周期。
2.15。统计分析
结果统计分析使用StatView 5.0软件包(Abacus概念Inc .,伯克利,CA)。所有的值被表示为±SEM。对比组超声心动图纵向数据是由双向方差分析(方差分析)重复措施。由单向方差分析所有产生的差异进行了分析,其次是邓恩Bonferroni /测试或未配对
t
以及。
P
价值
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。MSC-Secreted液囊的隔离和标识
假定的外来体分数条件媒体MSC被隔离调查通过外来体释放MSC的旁分泌作用。高分辨率透射电子显微图显示,MSC-derived液表现出圆形和双层膜结构的大小大约40 - 90纳米(图
1(一)),这是类似于先前的描述(
6,
7]。DLS分析定义这些液的大小。大小分布剖面显示一个钟形曲线,表明身体均匀的人口峰值在90纳米(图
1 (b))。免疫印迹分析证实了外来体分数表示CD9和CD63,同时完善的外来体标记(
4)(图
1 (c))。相比之下,外来体释放MSC被鞘磷脂酶抑制剂GW4869预处理,CD9和差别的重要对这些CD63的表达水平。液直接贴上PKH67(绿色荧光),然后用厘米来确定cocultured分泌液被整合到受体细胞。采用免疫分析表明PKH67(绿色)与最sarcomeric
α辅肌动蛋白阳性厘米(红色)后48小时。coculture(图
1 (d))。
表征MSC-derived液。(一)透射电子显微镜(TEM)液纯化MSC的显微照片。隔离液显示球形和膜封装直径不同的40到90海里。(b)代表动态光散射(DLS)人口数量分布测量隔离外来体演示了一个峰值(~ 90 nm直径)表示他们是免费的污染。(c)的表达特定exosomal标记,CD9和CD63液被西方墨点法确定。
挂式
Ctrl
、液分离MSC与零慢病毒转染(
MSC
Ctrl
);
挂式
CR
4
、液分离MSC与慢病毒转染overexpressing趋化因子受体CXCR4 (
MSC
CR
4
);
挂式
siCR
4
、液分离MSC与慢病毒转染核与趋化因子受体CXCR4基因(
MSC
siCR
4
);挂式+ GW4860液分离MSC与额外的鞘磷脂酶抑制剂GW4860。(d)吸收液的新生儿心肌细胞(CM)。厘米被心脏特殊抗体染色,sarcomeric
α辅肌动蛋白(红色)。
MSC
CR
4
提取液与PKH67标签(绿色)和孵化与CM 48小时。
![]()
![]()
![]()
![]()
3.2。MSC发布CXCR4-Enriched液
为了评估是否MSC-derived液具有趋化因子受体CXCR4和提供另一种趋化因子受体CXCR4蛋白输送系统、慢病毒输送控制向量,趋化因子受体CXCR4 overexpressing向量,CXCR4-siRNA被构造为经免疫印迹(图
2(一个))。液被孤立的细胞培养介质的各种识别货物装载趋化因子受体CXCR4 MSC行。西方墨迹显示液来自
MSC
CR
4
(
挂式
CR
4
)趋化因子受体CXCR4水平显著高于展出
MSC
Ctrl
导出液(
挂式
Ctrl
)(图
2 (b))。然而,随着核与趋化因子受体CXCR4在MSC (
MSC
siCR
4
),趋化因子受体CXCR4水平明显下调,导致明显降低趋化因子受体CXCR4水平液(
挂式
siCR
4
(图),相对于其他组
2 (b))。
趋化因子受体CXCR4的表达在MSC和MSC-derived液。(一)趋化因子受体CXCR4表达被西方墨点法在MSC与定量分析不同群体。((b)和(c))趋化因子受体CXCR4的表达在MSC-derived外来体是由免疫印迹检测和定量分析。所有的值表示为±SEM。
P
*
<
0.05
与
MSC
ctrl
或
挂式
Ctrl
,
n
=
4
为每个组。
![]()
![]()
![]()
3.3。的Antiapoptosis效果CXCR4-Enriched液通过激活PI3K / Akt-Associated信号通路在厘米
为了评估功能转移的趋化因子受体CXCR4液和潜在纠正各种低氧诱导瀑布和防止细胞凋亡的发生,老鼠与液来自厘米
MSC
Ctrl
,
MSC
CR
4
,或
MSC
siCR
4
在缺氧条件下探索治疗液是否促进治疗蛋白质的吸收为受伤的细胞,导致心脏保护。TUNEL分析显示凋亡细胞的数量(绿色)显著降低
挂式
CR
4
厘米(公分+治疗
挂式
CR
4
组,21.3%±1.3)相比
挂式
Ctrl
厘米(公分+治疗
挂式
CR
4
组,53.6%±2.7;数据
3(一个)和
3 (b))。趋化因子受体CXCR4的凋亡效应被废除,就是明证TUNEL阳性的厘米数厘米+增加
挂式
CR
4
+ LY (PI3K抑制剂LY294002)组与CM +
挂式
CR
4
组(图
3)。CXCR4-enriched液囊的影响被核完全废除针对趋化因子受体CXCR4(62.4%±2.9,数据
3(一个)和
3 (b))。igf - 1的
α/ PI3K / Akt途径评估阐明潜在机制负责提高生存率
挂式
CR
4
在缺氧条件下对待厘米。
的影响
MSC
CR
4
提取液对细胞凋亡。(一)TUNEL染色厘米在缺氧条件下细胞凋亡。CM贴上心脏特殊抗体,sarcomeric
α辅肌动蛋白(红色)。核与DAPI标记(蓝色)和TUNEL阳性细胞核(绿色)。原来放大×200。(b)定量数据TUNEL阳性细胞核的数量在不同实验小组。所有的值表示为±SEM。
P
*
<
0.05
与
挂式
Ctrl
;
n
=
6
为每个组。厘米+
挂式
Ctrl
,CM处理
MSC
Ctrl
提取液;厘米+
挂式
CR
4
,CM处理
MSC
CR
4
提取液;厘米+
挂式
Ctrl
+ + LY,厘米
挂式
Ctrl
治疗与LY294002 (PI3K抑制剂);厘米+
挂式
CR
4
+ + LY,厘米
挂式
CR
4
LY294002处理;厘米+
挂式
siCR
4
,CM处理
MSC
siCR
4
提取液。
![]()
![]()
igf - 1
α一种蛋白激酶和磷酸化(pAkt)以及procaspase 3厘米+水平大幅度增加
挂式
CR
4
组相比厘米+
挂式
Ctrl
集团和厘米+
挂式
siCR
4
组,而活跃的水平半胱天冬酶3显著下调(图
4(一))。相比之下,与选择性PI3K抑制剂LY294002 (LY),激活PI3K / Akt通路引起的
挂式
CR
4
被显著抑制显示pAkt和procaspase 3的表达降低,增加表达的活跃半胱天冬酶3厘米+相比
挂式
CR
4
(数据
4 (c),
4 (d),
4 (e))。然而,没有观察到显著差异在厘米+
挂式
Ctrl
厘米+
挂式
siCR
4
厘米+
挂式
Ctrl
+ + LY,厘米
挂式
CR
4
+ LY组。有趣的是,LY294002没有对igf - 1的影响
α表达式(图
4 (b))。
一种蛋白激酶信号通路相关基因的表达在CM中各种外来体治疗。(一)pAkt的表达水平,IGF-l
α、procaspase 3和活跃的半胱天冬酶3厘米被免疫印迹分析。((b) - (e)) pAkt定量数据,IGF-l
αprocaspase 3,活跃的半胱天冬酶3厘米。
P
*
<
0.05
与CM +
挂式
ctrl
。所有的值表示为±SEM,
n
=
6
为每个组。
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
3.4。效果< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M88 " > < mml:多行文字> < / mml:多行文字>交货< mml: msup > < mml: mrow > < mml:多行文字> o < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml:多行文字> CR4 < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < / mml: msup > < / mml:数学> < / inline-formula >在HUVEC管形成
管的形成进行分析使用HUVEC proangiogenic CXCR4-enriched液囊的影响进行评估
在体外。具体来说,治疗组(HUVEC + HUVEC的控制
挂式
Ctrl
)表现出小圆形状,不传播。然而,当HUVEC处理
挂式
CR
4
16小时。,they started migration and alignment, followed by the development of capillary tubes, sprouting of new capillaries, and finally formation of the cellular networks (Figures
5(一个)和
5 (b))。这些细胞变得细长,形成连接细胞的绳索,和分支形成一个capillary-like网络结构。管状结构的数量在HUVEC +显著增加
挂式
CR
4
组相比HUVEC +
挂式
Ctrl
或HUVEC +
挂式
siCR
4
集团或任何其他组织(图
5 (b)),伴随着重大upregulation VEGF水平(图
5 (c))。然而,proangiogenic效应
挂式
CR
4
被LY294002减毒治疗(HUVEC +
挂式
CR
4
+ LY) VEGF水平的差别的对这些数量相比显著降低管状结构
挂式
CR
4
治疗组。
的
在体外血管生成的属性
MSC
CR
4
提取液。(a)诱导HUVEC MSC-derived管形成的液囊。(b)总分支点在各组织的定量数据。(c) qPCR各组织VEGF表达进行了分析。
P
*
<
0.05
与
挂式
Ctrl
。所有的值表示为±SEM,
n
=
6
为每个组。HUVEC +
挂式
Ctrl
,HUVEC处理
MSC
Ctrl
提取液;HUVEC +
挂式
CR
4
,HUVEC处理
MSC
CR
4
提取液;HUVEC +
挂式
Ctrl
+ LY, HUVEC +
挂式
Ctrl
对待LY294002 (PI3K抑制剂);HUVEC +
挂式
CR
4
+ LY, HUVEC +
挂式
CR
4
LY294002处理;HUVEC +
挂式
siCR
4
,HUVEC处理
MSC
siCR
4
提取液。
![]()
![]()
![]()
3.5。< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M111 " > < mml:多行文字> < / mml:多行文字>交货< mml: msup > < mml: mrow > < mml:多行文字> o < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml:多行文字> CR4 < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < / mml: msup > < / mml:数学> < / inline-formula >促进血管生成,减少梗死面积
来验证是否CXCR4-enriched液修复在血管生成中发挥作用的梗塞的心
在活的有机体内,我们植入细胞补丁系统使用液从不同的群体。在外来体电池片预处理移植后4周,我们评估血管梗塞的使用疣状心血管性血友病因子(vWF)(图
6(一))。定量数据显示vWF积极船只的数量明显增加
挂式
CR
4
预防组(MI +
MSC
ExoCR
4
)与对照组相比(图
6 (b))。此外,梗塞大小在心肌梗死+ MSC,显著降低心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
心肌梗死+
MSC
ExosiCR
4
,心肌梗死+
MSC
ExoCR
4
组MI组或心肌梗死+ PBS组相比,但心肌梗死+
MSC
ExoCR
4
组马森的三色的染色(最低的数据
6 (c)和
6 (d))。
影响外来体MSC预处理补丁
在活的有机体内血管生成在心肌梗塞。(一)血管形成的梗塞的边境地区被vWF(绿色、黄色箭头)。心肌细胞是由心肌肌钙蛋白T (cTnT)和所有原子核与DAPI染色。比例尺= 100
µ原始放大×400 m。。(b)治疗组血管密度的定量数据。
P
*
<
0.05
与MI组;
P
#
<
0.05
与心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
组。马森(c)的三色的染色纤维尺寸和定量数据在不同的治疗方法。(d)梗塞大小的百分比在不同群体的心。
P
*
<
0.05
与心肌梗死;
P
#
<
0.05
与心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
组。骗局:虚假的老鼠有一个宽松的缝合操作周围放置童子冠状动脉;MI(心肌梗死仅由小伙子结扎);心肌梗死+ PBS (MI + PBS单独治疗);心肌梗死+ MSC (MI + MSC移植);心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
(心肌梗死+
挂式
Ctrl
MSC移植预处理);心肌梗死+
MSC
ExosiCR
4
(心肌梗死+
挂式
siCR
4
MSC预处理);心肌梗死+
MSC
ExoCR
4
(心肌梗死+
挂式
CR
4
MSC预处理)。
P
*
<
0.05
与心肌梗死;
P
#
<
0.05
与心肌梗死+ MSC。所有的值表示为±SEM,
n
=
6
为每个组。
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3.6。评估心脏功能
为了了解MSC表是否用CXCR4-enriched预处理液有助于缺血性心脏的功能恢复
在活的有机体内、心脏功能(LVDd LVDs, EF和FS)被超声心动图评估。虽然LV腔(LVDd和LVDs)扩张4周后细胞表MI(图后植入
7(一))假组相比,心肌梗死+ MSC或心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
组或心肌梗死+
MSC
ExosiCR
4
组或心肌梗死+
MSC
ExoCR
4
组表现出显著降低LV重塑,MI +
MSC
ExoCR
4
集团展出最显著降低LV重建心肌梗死或心肌梗死+ PBS组相比,通过减少LVDd和LVDs(数据所示
7 (b)和
7 (c))。此外,EF和FS明显高于在心肌梗死+ MSC和心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
组,但大多数在心肌梗死+显著增加
MSC
ExoCR
4
组与心肌梗死或心肌梗死+ PBS组(数字
7 (d)和
7 (e))。
心脏功能评估超声心动图在4周后细胞移植。(一)M-mode超声心动图数据各实验小组。((b) - (e))量化分析LVDd, LVDs, EF和FS。LVDd:左心室舒张期左室直径、LVDs:收缩期左室直径、EF:左心室射血分数,和FS:左心室部分缩短。
P
#
<
0.05
与心肌梗死+
MSC
ExoCtrl
组。
P
*
<
0.05
与心肌梗死;
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0.05
与心肌梗死+ MSC。所有的值表示为±SEM,
n
=
6
为每个组。
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4所示。讨论
细胞治疗已经成为一种很有前途的战略通过心肌修复治疗缺血性心脏疾病。液的旁分泌作用引入一个可选择的解决方案治疗MSC在再生医学中的应用(
4,
15]。事实上,液可以实现一些有利影响通过使用小可溶性生物化合物如生长因子、趋化因子、细胞因子、转录因子、基因和rna (
15]。然而,这些因素的交付到目标细胞完整性和生物效价稳定仍然是一个挑战。作为生物脂膜囊泡、液不仅有能力携带大量的货物,但也保护内容如蛋白质和RNA的降解酶或化学物质
14,
15]。近年来,液也被卷入细胞通讯和发病机理。例如,液由据报道心肌细胞祖细胞分泌刺激内皮细胞的迁移
16]。
CXCR4-enriched液囊的潜在作用是证明的修复梗塞的心脏(图
8)。的
在体外公布的研究表明,CXCR4-enriched液
MSC
CR
4
被转移到心肌细胞,导致增加心肌细胞在缺氧条件下生存。这也是PI3K / Akt信号通路的激活有关。
在活的有机体内研究表明,细胞表用CXCR4-enriched预处理液促进血管生成,并演示了后续改善心脏功能。证据还表明,提供的
MSC
CR
4
提高proangiogenic因素的释放和促进MSC内皮分化在缺氧条件下,改善心脏功能
MSC
CR
4
细胞补丁被植入心肌缺血性心(
17]。赖昌星等人的研究还表明,液由MSC分泌能够减少心肌缺血/再灌注损伤(
18),支持这项研究的结果。净化液从骨骨髓来源MSC孤立使用差速离心和ExoQuick液的沉淀调查旁分泌活动的机制从趋化因子受体CXCR4 overexpressing MSC。发现MSC-derived液有表型类似来自其他来源(
7,
14]。有趣的是,在趋化因子受体CXCR4的表达水平显著提高
MSC
CR
4
和
挂式
CR
4
在这的
MSC
Ctrl
和
MSC
siCR
4
,这表明的趋化因子受体CXCR4水平液可以增强overexpressing趋化因子受体CXCR4在MSC。
示意图描述MSC overexpressing功能液分泌的趋化因子受体CXCR4信号通路的激活MI后恢复LV功能。在外来体生成细胞趋化因子受体CXCR4被选择性地融入到管腔内的囊泡(IVLs)多泡核内体(mf)等离子体膜。然后,通过与质膜融合,mf释放CXCR4-enriched外来体进入细胞外环境。CXCR4-enriched液可以绑定到目标细胞的质膜。这些招募CXCR4-enriched液可以直接与质膜融合或者保险丝使用限定膜的内吞作用的隔间。然后,释放趋化因子受体CXCR4可以交付到目标细胞的膜或细胞溶质有助于SDF-1
α/ CXCR4相互作用。在梗塞的心脏组织,增加SDF-1的绑定
α趋化因子受体CXCR4 G-protein-coupled受体激酶激活,激活细胞内信号通路级联。预处理的干细胞/祖细胞CXCR4-enriched外来体可以降低MI-induced细胞死亡,促进血管生成通过PI3K / Akt信号通路的激活,从而提高心脏功能改善。
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趋化因子受体CXCR4 G-protein-coupled受体,可以激活几个G-protein-mediated下游信号通路刺激后(
2,
19]。这是一个关键因素参与归航,内皮细胞迁移,移植的造血干细胞和祖细胞
2]。趋化因子受体CXCR4信号端点之一就是转录因子的激活
19]。此外,SDF-1
α/ CXCR4轴被报道是至关重要的PI3K在缺血性心肌细胞的激活,从而调解急性心脏保护(
19]。此外,TUNEL分析显示,细胞凋亡在心肌细胞治疗
MSC
CR
4
提取液明显减少,与对照组相比,而这种保护作用是被PI3K / Akt抑制剂,LY294002,导致我们假设
MSC
CR
4
提取液可以通过一种蛋白激酶信号通路促进心脏保护。关键的表达一种蛋白激酶信号通路的下游分子被免疫印迹检测测试这个假说。VEGF信号通路中起着至关重要的作用在血管内稳态和血管生成级联(
20.]。igf - 1
α本身就是一个不那么有效的诱导的血管生成与其他血管生成生长因子VEGF等。igf - 1的antiapoptosis活动
α的差别归因于对这些裂解caspase-3 [
21]。半胱天冬酶3属于cysteine-aspartic酸性蛋白酶(半胱天冬酶)的家人和与半胱天冬酶8和半胱天冬酶9。顺序激活半胱天冬酶过程中扮演着重要的角色在细胞凋亡的执行阶段(
22]。它也证明了这一点
MSC
CR
4
导出液激活下游一系列的生长因子,如igf - 1
α一种蛋白激酶。细胞治疗LY294002, PI3k / Akt抑制剂,来确定旁分泌的影响
MSC
CR
4
导出液通过Akt介导的信号。尽管LY294002没有对igf - 1的影响
α表情,antiapoptosis效应以及管形成诱导
MSC
CR
4
提取液明显被废除。这些结果提供了进一步的证据支持我们的假设,Akt在血管生成过程中发挥着关键作用。我们还观察到液
MSC
CR
4
删除趋化因子受体CXCR4基因siRNA没有显示心脏保护效应
在体外以及功能恢复的梗塞的心
在活的有机体内(数据未显示),这表明,趋化因子受体CXCR4在干细胞功能中扮演关键角色。
前,有几个问题需要解决exosome-based疗法广泛应用于临床实践。因此,需要进一步努力,(1)确定组织特定的外来体族群;(2)工程师或修改外来体表面抗原和内部内容将大量cardioprotective-proteins或小分子核糖核酸(microrna);(3)发现细胞吸收的机制;(4)开发效率的目标策略;(5)开发成本有效的方法来生成最优patient-derived液囊。
的结果
在体外研究表明proangiogenic的影响
MSC
CR
4
导出液进一步证实了
在活的有机体内心肌梗死与细胞补丁系统模型。我们的数据表明,移植心脏功能改善的exosome-treated MSC通过增加血管生成在梗塞的心。此外,MSC overexpressing趋化因子受体CXCR4液显示更好的效率,减少左心室重构和促进恢复心肌梗死后心脏功能,证实趋化因子受体CXCR4是血管生成和细胞生存的关键因素。综上所述,本研究表明,超表达的趋化因子受体CXCR4 MSC将是一个有效的策略来提高液包含心血管因素的释放。