SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2014/891518 891518年 研究文章 马间充质基质细胞进入细胞的分化神经血统:临床应用潜力 克鲁兹冰雪融化 克劳迪亚 1、2 Amelse 丽莎 2 Neilsen 南希 3 邓拉普 约翰 4 达哈 Madhu 2 Quesenberry 彼得·J。 1 比较和实验医学的部门 田纳西大学 诺克斯维尔 TN 37996 美国 tennessee.edu 2 临床科学部门的大型动物 田纳西大学 诺克斯维尔 TN 37996 美国 tennessee.edu 3 生物医学与诊断 田纳西大学 诺克斯维尔 TN 37996 美国 tennessee.edu 4 先进的显微成像中心 田纳西大学 诺克斯维尔 TN 37996 美国 tennessee.edu 2014年 24 11 2014年 2014年 25 07年 2014年 29日 10 2014年 31日 10 2014年 24 11 2014年 2014年 版权©2014克劳迪娅·克鲁兹冰雪融化等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

间充质基质细胞(msc)能够分化成extramesodermal血统,包括神经元。取得了积极成果移植后神经诱导msc在神经损伤后实验动物,但在马这是未知的。我们的目标是测试能力的骨髓间充质细胞分化成马的神经血统 在体外,评估不同的形态和lineage-specific蛋白表达,并调查如果马的年龄和细胞通道数量达到分化能力的影响。来源于msc的骨头从幼年和成年马了。具备干细胞的示范后,msc是神经诱导和显微镜下在不同的时间点评估。结果表明,商用nitrogen-coated组织培养板支持增殖和分化。形态变化直接和所有的细胞显示神经crest-like细胞表型。的神经祖细胞蛋白质的表达,是评估通过免疫印迹和免疫荧光。在我们的研究中,msc中青年马没有显示差异产生的能力进行分化。细胞通道数量的影响,然而,是不一致的,需要进一步的实验。正在进行的工作是针对transdifferentiating这些细胞为雪旺细胞移植在马为周围神经损伤模型。

 1。介绍

脊髓和周围神经损伤在马群创伤后,有毒/代谢和传染病。次数少,退行性和遗传性疾病也构成了威胁。这些事件触发炎症级联的事件导致表现不佳,残疾,甚至死亡。此外,马的周围神经损伤的影响反映在大型金融和情感投资。周围神经可以通过热或化学损伤,受伤的压缩、破碎、拉伸或横断( 1, 2]。受伤后,2屏障通透性增加和炎症反应导致雪旺细胞增殖和活化发起当地的巨噬细胞,对组织损伤( 2, 3]。其中一些细胞分泌神经营养因子和其他物质,最终促进轴突再生和remyelination,根据病变的大小和它的长期性 1, 2, 4- - - - - - 10]。损失与外部神经的轴突连续性结构(neurotmesis, Seddon分类)最贫穷的预后恢复( 1]。

间充质基质细胞(msc)骨髓和脂肪组织已经向transdifferentiate进入细胞以外的其他血统的中胚层的血统。 在体外研究表明啮齿动物和人类的能力msc诱导后获得神经crest-like细胞表型与特定的培养基( 7- - - - - - 9, 11- - - - - - 13]。神经蛋白标记,主要波形蛋白,巢蛋白, β 3 微管蛋白和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达在这些神经诱导细胞,尽管从不同的研究结果是矛盾的,因此不确定( 10, 13- - - - - - 18]。有趣的是,小说的研究涉及K的评价+和钠+电流在神经细胞crest-like透露,化学诱导大鼠msc,这些细胞似乎失去了上述电生理学性质相比,noninduced msc;结束,尽管形态和分子变化类似于神经细胞,这些化学物质诱导细胞缺乏神经元的功能性质 14]。然而,一些研究表明积极的相关性 在体外和 在活的有机体内结果( 2, 7, 9, 12, 14, 19- - - - - - 21]。例如,骨髓和脂肪细胞未分化的msc揭示了积极的结果,当这些细胞被allogeneically移植神经受伤的老鼠,兔子和狗 2, 9- - - - - - 11, 18- - - - - - 20., 22, 23]。另一方面,对老鼠的研究也表明有益的反应和恢复神经功能移植后通过化学诱导msc许旺细胞样的表型或纯粹的雪旺细胞获得新鲜的周围神经组织( 9, 11, 23, 24]。提是很重要的,然而,在这些研究中细胞疗法后立即发生神经或脊髓损伤。

据我们所知,没有报告在文献中描述的能力来源于msc (eBM-MSCs)的马骨细胞分化成神经血统或证明移植后的临床好处到马患有疾病。我们以前报道,有关干细胞疗法改善临床结果,重要的是评估msc的生物学和功能之前,他们的应用程序在临床情况下( 25]。鉴于我们长期的目标使用马msc在神经病变,本研究设计作为第一步评估eBM-MSCs的增殖和生存 在体外和他们的能力后分化成神经crest-like细胞化学感应。我们比较这些属性和评估变化,如果有的话,在马(捐赠者)两个年龄组。此外,我们比较神经分化的变化相对于通道的数量eBM-MSC文化。我们使用了神经祖标记巢蛋白表达谱,波形蛋白, β 3 微管蛋白和GFAP调查这些变化。

 2。材料和方法 2.1。动物和骨髓的愿望

从胸骨骨髓吸入物得到2年轻的混合品种(范围:1 - 4岁)和4成人美国夸特马(范围:卖地岁)母马和1年轻的美国季马去势如前所述[ 26]。所有程序都是按一个批准的协议进行机构的动物保健和使用委员会田纳西大学诺克斯维尔,TN。简单地说,马镇静盐酸detomidine 0.01 - -0.02毫克/公斤,静脉注射。10厘米乐队在腹侧剪和手术的准备方面的胸骨。3毫升的2%盐酸利多卡因注射皮下和肌肉水平的5日或者6日sternebrae下腹正中,紧随其后的是一个刺切口15-blade皮肤,皮下组织,肌肉组织。一卷针插入垂直于皮肤,直到它到达骨膜。针然后被迫胸骨骨髓从5日或6日sternebrae是通过温和的愿望注射器装满1000 IU / 10毫升的硫酸肝素。

 2.2。隔离和msc的扩张

这些程序是如前所述 25- - - - - - 27]。简而言之,骨髓抽出物稀释1 x PBS和分层的淋巴细胞分离媒体,聚蔗糖。在200 g离心20分钟后在室温下,包含单核细胞(跨国公司)的淡黄色的外套。增长的跨国公司是resuspended媒体包含杜尔贝科的修改鹰介质/火腿F-12 [(DMEM-F12), Cellgro,马纳萨斯,弗吉尼亚州),10%胎牛血清(的边后卫),和1%的青霉素和链霉素。大约20×106细胞被播种在175厘米2发泄组织培养瓶(热科学,罗彻斯特,纽约)和维持在37°C和5%的公司2。第一个生长介质变化进行了5至7天当时的殖民地在相差显微镜下可见。70 - 80% confluency达到时,这些细胞被收获0.25% trypsin-EDTA为2分钟37°C(通道1:P1)。离心后,细胞颗粒重组与发展中开始一个新的实验或冻结DMEM-F12媒体含50%,50%的边后卫,5% DMSO对低温贮藏下液氮为将来的实验。根据需要重复这些步骤是为了获得细胞通道2段4 (P2 P4;低段)和细胞从票数P12(高通道)和用于未来的实验。

 2.3。具备干细胞的低段马从7捐助者msc 2.3.1。集落形成单位化验(CFU)

通道1的马msc被播种密度1×106在100毫米的组织文化菜(热科学,罗彻斯特,纽约)和维护在7到10天,直到集群生长介质的殖民地。中被取代后每2 - 3天。殖民地和4%多聚甲醛固定和染色0.5%的结晶紫(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。染色后,菜被允许风干和图像与富士胶片las - 4000获得成像系统(通用电气医疗集团生命科学)。

 2.3.2。MTS扩散分析

低段(P2-P4)马msc被播种密度的2×104每在24-well细胞培养板。媒介是每2 - 3天更换一次。细胞增殖测定在2、4、7天后播种。CellTiter 96水非放射性(MTS)试验(Promega,麦迪逊,WI)使用后,制造商的指示。短暂,MTS试剂5:1的比例相对于媒体添加到每个和孵化3 h在37°C和5%的公司2。490纳米的吸光度测量和数据获得使用Gen5数据分析软件(Biotek Winooski,佛蒙特州)。生长介质只有没有细胞作为一个空白的读数为每个样本。

 2.3.3。脂肪形成的诱导成骨的,Chondrogenic分化

低段(P2-P4)马msc被播种在2×10的细胞密度560 mm细胞组织培养菜(BD猎鹰,新泽西州)和维持在37°C和5%的公司2在生长介质。细胞汇合的约70%时,介质被删除,取而代之的是lineage-specific分化媒体如前所述[ 27]。简而言之,脂肪形成的分化诱导了添加DMEM-F12兔血清中含有15%,1 μ10 mol / L地塞米松 μ20 g / mL重组人胰岛素 μ0.5 mol / L吲哚美辛,更易与L 3-isobutyl-1-metylxanthine。成骨分化诱导了添加DMEM-F12介质包含100 nmol / L /毫升的地塞米松,更易与0.25 L抗坏血酸,和10更易/ L β甘油磷酸盐。Chondrogenic分化诱导了DMEM-F12, 100 nmol / L的地塞米松,0.25更易/ L抗坏血酸,5 ng / mL转化生长因子 β 1 。介质是补充每2 - 3天,分化是通过微观监测评估。未分化的msc保持定期的生长介质,没有任何分化试剂,相同数量的天,作为控制。分化确认使用lineage-specific细胞染色使用以前公布的方法( 27]。具体来说,脂肪形成的细胞被沾油红色的o,成骨细胞与茜素红染色,chondrogenic细胞与阿尔新蓝染色。图像获取与电子相机(尼康DS-Fi2、日本)连接到一个蔡司显微镜和评估NIS-Elements成像软件(尼康)。

 2.4。神经Crest-Like细胞分化低和高段马msc从选定的捐助者

神经crest-like细胞分化是在从7捐助者提到的msc。因为我们需要大量eBM-MSCs神经分化,获得适当的蛋白质样品,我们选择一个年轻人和一个中年人捐赠者进行免疫印迹和免疫荧光实验。捐赠者选择基于他们的扩散率,证明了上述MTS试验。

2.4.1。细胞培养

低(P2)、高(P9)马msc被播种在8到10×10的细胞密度6在聚苯乙烯或Primaria nitrogen-coated 100毫米组织培养菜(实验室的器具,正欲贝德福德,MA)。细胞维持正常生长介质在37°C和5%的公司2,至少48小时允许附件。神经分化诱导使用先前描述的组合方法( 13, 18]。简单地说,经济增长中被和细胞与中包含DMEM-F12 preincubated 20%的边后卫,1毫米 β巯基乙醇(Sigma-Aldrich) 37°C和5%的股份有限公司2,18 - 24 h。随后,细胞诱导的神经介质包含DMEM-F12、2% DMSO, 200 μ米叔丁基羟基茴香醚(BHA);Sigma-Aldrich)和细胞在37°C和5%孵化有限公司2、3、6、12、24、48 h。未分化的msc维护正常生长培养基相同数量的小时被用作相应控制。未分化和分化细胞分别在每个实验如下所述。

 2.4.2。核/胞质染色

核/胞质荧光染色法是用来显示神经细胞形态学的神经分化后msc。低和高的段落的马msc被播种密度为1.25×106在Primaria nitrogen-coated 60毫米在常规组织培养的菜肴和维护生长介质在37°C和5%的公司2,至少48小时允许附件。当细胞在80 - 90%汇合的他们化学诱导神经分化如上所述。未分化的控制上述msc维持正常的生长介质。胞质染色,神经诱导未分化的msc在12 h沾5 μg (WGA(麦芽凝集素,Alexa萤石488共轭;生命技术)10分钟,在室温下。细胞核染色,细胞进一步清洗和沾染了5 μ克TO-PRO-3碘染色(生活技术,大岛,纽约)10分钟,在室温下。洗后,细胞被安装SlowFade黄金不变色试剂(分子探针,宏伟的岛,纽约)和图像得到激光扫描光谱共焦显微镜(徕卡TCS SP2;徕卡Microsystems©,位于德国),在20 x 63 x放大。

 2.4.3。蛋白质提取和免疫印迹

总细胞溶解产物是由未分化和神经诱导马msc从低和高段12 h后分化使用标准协议。细胞每道菜都轻轻洗与哈佛商学院的缓冲和收集通过细胞刮。每个样本中获得的总蛋白质,细胞在200年细胞溶解 μL•瑞帕缓冲区(波士顿Bioproducts,亚什兰,MA)和用离心得到的上层清液。在每个样本估计的数量和总蛋白浓度得到使用修改BCA试验在660 nm(皮尔斯,热科学)。相同浓度的总蛋白神经诱导和未分化的msc electrophoretically分离丙烯酰胺凝胶10%,转移到硝化纤维膜。膜被封锁的5%牛血清白蛋白(BSA)和孵化与鼠标反 β 3 微管蛋白(1:1000;圣克鲁斯)和鼠标anti-GFAP (5 μ克/ 10毫升;1:1000;BD Pharmingen)。合山羊anti-mouse免疫球蛋白g (1: 5000;BD Pharmingen)作为二级抗体。抗原检测后进行接触ECL-2试剂(皮尔斯,热科学)。Beta-actin被用作加载控制。

 2.4.4。免疫荧光(如果)

低和高的段落的马msc被播种密度为1.25×106在Primaria nitrogen-coated 60毫米组织培养的菜肴和维护在生长介质37°C和5%的公司2,至少48小时,允许附件。细胞汇合的80 - 90%时,他们化学诱导神经分化如上所述。未分化的msc用作控制维护与定期生长介质。神经诱导未分化的msc与4%多聚甲醛固定,permeabilized Triton x - 100 0.1%(σ)10分钟,在室温下,和阻止5%正常血清30分钟,在室温下。细胞被洗和孵化一夜5 μg /样本主要巢蛋白抗体(BD Pharmingen)和波形蛋白(BD Pharmingen),在4°C。与哈佛商学院的缓冲区,洗后细胞孵化与二级抗体(Alexa萤石647驴anti-mouse免疫球蛋白在5 μg /样本;BD Pharmingen) 20分钟,在室温下。这些细胞被安装与DAPI SlowFade黄金不变色试剂(分子探针)和图像得到激光扫描光谱共焦显微镜(徕卡TCS SP2;徕卡Microsystems©,位于德国)。

 2.5。统计分析

小动物——一张长有学生的 t以及用于比较的平均神经crest-like细胞,与那些坚持polystyrene-coated Primaria nitrogen-coated组织文化板块。同样,巢蛋白和波形蛋白的表达细胞间的P2和票数中年马和细胞之间的P2中青年马从如果数据比较。两种蛋白质的表达也比未分化和神经诱导msc。时被认为是具有统计学意义的差异 P < 0.05 。

 3所示。结果 3.1。具备干细胞的马msc

具备干细胞的细胞从马MSC文化评估仅在低通道细胞。一旦干细胞的性质证明,从每组只有1捐赠(中青年)选择和msc的人口是通过神经实验。

3.1.1。形态

马MSC文化从骨髓收获坚持扩大聚苯乙烯表面并显示纺锤形成纤维细胞的形态。没有形态变化是观察eBM-MSC文化来自中青年捐助者。

 3.1.2。扩散

马从年轻(图msc 1:马和中年捐助者(图1 - 4) 1:马5 - 7)能够增殖和生存能力,以天2,4,7。作为显示在图中,有一个吸光度的3到6倍增长捐助者的7天确认其增殖和生存能力。预期,此前报道,细胞增殖是变量之间的马。马显示最高的扩散,从而生成足够数量的msc在给定的时间内被选为所有神经实验(捐助者2和6)。

eBM-MSCs的扩散速度的测量。MTS试验被用来比较eBM-MSCs扩散的利率从4年轻中年马马(数字1 - 4)和3(数字5 - 7)的7天。吸光度是光学密度(OD)以490海里比色测定。注意自我更新的速度在第七天所有的动物。每个样本的平均值( n = 7 )提出了误差标准差绘制。

 3.1.3。CFU

马的msc P1of中青年马能够在集群成长polystyrene-coated组织培养菜肴在第十天,这表明eBM-MSC文化建立代表msc或祖细胞。代表CFU试验(图所示 2)。

集落形成单位eBM-MSCs化验。代表的形象CFU播种10天后形成的通道1 eBM-MSCs从一个年轻的(a)和一个中年(b)马。注意的能力未分化两年龄组msc形成菌落。

 3.1.4。中胚层Trilineage分化

低段马msc年轻和中年捐助者能够分化成脂肪形成的,chondrogenic,成骨细胞在lineage-specific化学感应(图 3)。在第五天,脂肪形成的脂滴形成的细胞显示一个典型的模式可以沾油红色的o。证实了成骨和chondrogenic分化潜力茜素红和阿尔新蓝染色,分别后10 - 15天的化学感应。马之间没有观察形态学差异。差异存在,然而,在达到分化表型的时候,根据特定的染色。未分化的控制仍然与轴成纤维细胞的形状,没有lineage-specific阳性染色。按照我们先前的重要性和发表的论文( 25),成骨的从一个中年捐赠者和msc chondrogenic分化(马6)持续发生早于休息。

中胚层trilineage分化eBM-MSCs化验。代表图像从一个年轻的(a)和一个中年(b)马显示油红色的o (a),阿尔新蓝(b),和茜素红染色(C)的脂肪形成,软骨形成,骨,分别 在体外分化。每一个未分化的控制(b)所示。比例尺= 100 μm。

以上所有资料确认马msc从每个捐赠者祖细胞生成,他们满足的标准分为成人间充质基质/祖细胞。

 3.2。神经Crest-Like细胞分化

后确保msc的选择从低段细胞从之前的实验中,eBM-MSCs进一步扩大,通道,检测神经分化。

3.2.1之上。神经Crest-Like细胞形态

对简单的可视化,荧光显微镜是用来显示一个完整的细胞核和细胞质“健康”。TO-PRO-3染色,最敏感的探针在核酸检测,以及编剧,特定于细胞膜,被用来演示neural-like细胞的细胞核和细胞质结构。低和高段eBM-MSCs从选中的中青年马能够采用神经细胞形态学crest-like最早3 h后化学感应。这些形态特征包括细胞的伸长,胞体收缩,形成一个或多个细胞的过程(图 4)。12 h后的神经分化,细胞显示神经crest-like细胞形态。此外,这些细胞出现在是因为生长在一个集群模式。未分化的控制有梭形的成纤维细胞的外观MSC。没有差异,在显微镜下观察神经crest-like细胞的表型特征的低中青年马之间的通道。在分析高细胞,通过微妙的形态差异被发现。大多数的这些细胞也显示上述神经crest-like细胞特征;然而,他们似乎失去细胞质完整性和其中一些出现圆形和小。核和胞质染色帮助视觉评估这些分化细胞的形态特征(数字 5(一个)和 5 (b))。这些形态差异是更具体的通道数;也就是说,他们可以归因于细胞培养的过程本身,而不是供体的年龄。

eBM-MSCs分化转化试验。代表图像从一个年轻的(a)和一个中年(b)马显示神经crest-like细胞(白色箭头)12 h后化学感应。注意身体细胞的收缩和多个细胞进程的外观。放大倍数= 40 x。

核/胞质染色neural-like eBM-MSCs。代表共焦图像的细胞质(WGA)和核(TO-PRO-3-iodide)荧光染色显示神经的完整性crest-like细胞从低段eBM-MSCs的一个年轻的(a)和一个中年(b)马和从高通道eBM-MSC中年(c)的马。注意的典型呈形态无差别的msc (d, e, f)。酒吧= 25 μm。

最后,根据细胞的数量坚持两个不同类型的组织文化板块,nitrogen-coated板块(Primaria)显著提高细胞生存和增殖,患病率高于polystyrene-coated板( P = 0.0319 化学感应(图后) 6)。

核/胞质染色neural-like eBM-MSCs在不同的基质。代表共焦图像的细胞质(WGA)和核(TO-PRO-3-iodide)荧光染色显示分化细胞存活率从一个中年马12 h后化学感应,Primaria, nitrogen-coated (a)和polystyrene-coated (b)组织文化板块。注意稀缺的细胞在细胞培养板聚苯乙烯。比例尺= 100 μm。

 3.2.2。神经祖细胞蛋白质的正常表达

波形蛋白的表达被如果(数据证实 7和 8)。波形蛋白是细胞低表达的通道两个年龄组没有显著差异( P = 0.7653 );细胞通道数量并不影响波形蛋白表达在中年马( P = 0.7774 ),未分化之间没有差异波形蛋白表达是指出msc及神经诱导msc为年轻( P = 0.9660 )或中年( P = 0.1577 )马。

波形蛋白的表达在未分化和分化低通道eBM-MSCs。共焦显微镜显示波形蛋白的表达(红色)的神经从eBM-MSCs crest-like细胞中青年马3 h和12 h后的化学感应。DAPI用于染色细胞核(蓝色)。各自的未分化的控制在较低的面板中。注意分散的本地化波形蛋白,表达了在未分化和神经祖细胞。比例尺= 25 μm。

波形蛋白的表达在未分化和分化高通道eBM-MSCs。共焦显微镜显示波形蛋白的表达(红色)在神经crest-like细胞eBM-MSCs中年马12 h后的化学感应。DAPI用于染色细胞核(蓝色)。未分化的控制eBM-MSCs在右侧面板中。注意分散的本地化波形蛋白,表达了在未分化和神经祖细胞。比例尺= 25 μm。

免疫印迹分析评估GFAP的表达和执行 β 3 微管蛋白(图 9)。从低分化细胞通过细胞获得中青年MSC文化展示和GFAP的表达 β 3 微管蛋白(图 9(一个))。 β 3 微管蛋白不表达从高分化细胞通过细胞从年轻获得MSC文化。的重要性,如果有的话,这个时候不知道。有趣的是,低和高段未分化细胞生成来自捐赠者表达蛋白质,暗示的可塑性msc以外的中胚层的血统(图 9 (b))。

表达的神经祖细胞蛋白质免疫印迹分析。免疫印迹分析显示神经祖细胞蛋白的表达, β 3 微管蛋白和GFAP分化(a)和未分化(b) eBM-MSCs产生高低通过细胞中年(通道1和2,分别地。)和年轻(车道3和4,resp)。马。Beta-actin作为内部控制。5 μ克蛋白质每车道被加载。有趣的是在未分化神经祖细胞蛋白质的表达msc、表明马msc的可塑性可能超越extramesodermal血统。

我们不能检测巢蛋白表达通过免疫印迹分析,即使三个不同主要抗体与各种稀释(1:1000年,1:2000)。有趣的是,巢蛋白表达在未分化明显,神经分化msc的低和高通道两个年龄组(图 10)。巢蛋白表达在细胞低通过观察两个年龄组没有显著差异( P = 0.7325 )。此外,细胞通道数量没有显著影响巢蛋白的表达在中年马( P = 0.3467 ),并没有指出在巢蛋白表达差异之间无差别的msc及神经诱导msc为年轻( P = 0.9616 )或中年( P = 0.0830 )马。巢蛋白的细胞核周围的位置明显未分化和神经分化msc的低段和未分化的msc的高通过两个年龄组(图 10)。巢蛋白在神经分化细胞的位置高,然而,是不一致的,与其他一些细胞显示细胞核周围的位置和显示更加分散,细胞质表达(图 11)。可能是细胞的高通道接受变化,改变一些丝状蛋白的结构(即。巢蛋白)。

巢蛋白的表达在未分化和分化低通道eBM-MSCs。共焦显微镜显示巢蛋白的表达(红色)在神经crest-like细胞(上部面板)和未分化的控制面板(低)从eBM-MSCs中青年马3 h和12 h后的化学感应。DAPI用于染色细胞核(蓝色)。注意巢蛋白的主要细胞核周围的本地化。比例尺= 25 μm。

巢蛋白的表达在未分化和分化高通道eBM-MSCs。共焦显微镜显示巢蛋白的表达(红色)在神经crest-like细胞(左面板)和未分化的控制面板(右)eBM-MSCs中年马12 h后的化学感应。DAPI用于染色细胞核(蓝色)。注意,巢蛋白是不一致发现细胞核周围的细胞质或广泛的分化细胞。表达巢蛋白在细胞核周围的控制。此外,基于信号的强度,它的表达表现出较低的细胞相比,低通道。比例尺= 25 μm。

 4所示。讨论

周围神经损伤在马表现不佳的一个原因。这些伤害很难管理和治疗主要依靠物理治疗和抗炎药;然而,长期影响耗费时间和人员。神经系统细胞的发展分为不同阶段。确定自己的命运后,这些细胞迁移到特定位置的神经系统,实现不同的功能 18, 28]。先前的研究已经表明,未分化的msc可以表达一些神经蛋白标记,导致问题提前msc是否致力于神经血统( 29日- - - - - - 32]。此外,正如神经祖细胞发展成更多的特殊细胞,蛋白标记的变化也明显( 4, 13, 17, 30., 33]。

脂肪细胞和骨骨髓来源从人类和大鼠msc能分化成神经细胞系( 4, 13, 18, 28, 29日, 33- - - - - - 37]。一些报告所描述的不同方法的化学诱导神经分化( 13, 30., 33, 37, 38]。中包含transretinoic酸或叔丁基羟基茴香醚是最频繁的报道。此外,与msc coculture系统和神经组织的细胞也成功的神经分化的诱导msc ( 29日]。

我们trilineage诱导分化成骨、chondrogenic和脂肪形成的)从中青年马骨骨髓来源msc描述他们的可塑性为中胚层的血统。我们也诱导这些细胞分化成细胞的神经中胚层血统以外的血统来评估他们的可塑性。细胞从所有的马都能够扩散,并进行了分化成脂肪形成的,成骨,chondrogenic血统。这是符合之前从我们实验室发布的一份报告 25),从而证实了具备干细胞培养的msc。我们不能确保细胞自我更新基于这些细胞的增殖能力。然而,我们可以假设马msc可以自我更新能力的基于细胞未分化状态下仍在实验和基于这些细胞也能够multipotency诱导时不同介质条件。神经分化,荧光显微镜显示,观察形态学变化早在化学感应后3小时以内所有的马。使用核/胞质染色我们能够证明获得了神经crest-like细胞分化的细胞形态,细胞的收缩soma和多个细胞的形成过程观察。最重要的是,有区别的msc的增殖神经下媒体在nitrogen-coated板块(Primaria)高于组织培养聚苯乙烯板,显示稳定的细胞膜通过提供一个正电荷。

结合的免疫印迹分析,我们发现所有msc、未分化和分化,表达神经祖标记;波形蛋白、巢蛋白、GFAP和 β 3 微管蛋白是很明显的。GFAP的表达 β 3 微管蛋白在未分化的msc是特别有趣的和数据支持先前的研究在老鼠和人类,暗示他们的神经谱系分化能力 39, 40]。巢蛋白已被证明是在肌肉和神经祖细胞,以及高度增殖的细胞(即。受伤后,有丝分裂率高,等等)。 41- - - - - - 43]。如果数据,巢蛋白主观地出现在细胞高通道低于细胞从低段,表明细胞增殖机制的丧失和可塑性的细胞。我们发现一个未分化的巢蛋白和神经细胞核周围的位置从P2 crest-like细胞。从票数分化细胞巢蛋白表达细胞核周围的,但也延伸到细胞质中。这是类似于先前的报道( 43, 44巢蛋白[],可能表明转译后的修改 42- - - - - - 44),分析超出了我们的研究范围。同样的,细胞的影响通过数字的表达这些标记还建议修改或细胞结构变化的时代,但还需要进一步的研究来证实这一点。

我们的研究主要依赖于形态变化和神经标记蛋白表达来描述eBM-MSCs神经分化期间发生的事件。我们的结果同意之前的观点 在体外研究在骨骨髓来源从大鼠msc,人类和狗的eBM-MSCs化学诱导成细胞显示形态学、遗传、神经祖细胞和蛋白质的特征。据我们所知,这是第一个报告描述了可塑性,形态特征、和蛋白质表达的变化eBM-MSCs进入细胞的神经化学感应后血统。我们不仅展示了 在体外分化模式也验证人类neural-specific抗体与马大的蛋白质样品。有更深入的研究,然而,调查这些马的功能细胞 在活的有机体内。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突。这项工作的一部分的研究报告是2014年ACVIM论坛,纳什维尔,TN。

 坎贝尔 W·W。 周围神经损伤的评估和管理 临床神经生理学 2008年 119年 9 1951年 1965年 10.1016 / j.clinph.2008.03.018 2 - s2.0 - 47749121773 Forostyak 年代。 Jendelova P。 Sykova E。 间充质基质细胞在脊髓损伤的作用,再生医学和可能的临床应用 Biochimie 2013年 95年 12 2257年 2270年 10.1016 / j.biochi.2013.08.004 2 - s2.0 - 84887820691 Woodhoo 一个。 阿隆索 m b D。 Droggiti 一个。 Turmaine M。 主席特蕾 M。 帕金森 d·B。 威尔顿 d·K。 Al-Shawi R。 西蒙斯 P。 沈 J。 海雀 F。 Radtke F。 梅耶尔 D。 Feltri m . L。 Wrabetz l 米尔斯基 R。 安杰森 k·R。 切口控制胚胎许旺细胞分化、产后髓鞘形成和成年的可塑性 自然神经科学 2009年 12 7 839年 847年 10.1038 / nn.2323 2 - s2.0 - 67649826154 卡多佐 a·J。 戈麦斯 d E。 Argibay p F。 神经源性人类脂肪中提取干细胞的分化:相关性不同的信号分子,转录因子和关键标记基因 基因 2012年 511年 2 427年 436年 10.1016 / j.gene.2012.09.038 2 - s2.0 - 84868213919 安杰森 k·R。 米尔斯基 R。 在周围神经胶质细胞的起源和发展 神经系统科学自然评论 2005年 6 9 671年 682年 10.1038 / nrn1746 2 - s2.0 - 25144470229 Kuffler d . P。 评估当前的技术诱导轴突再生和神经末梢神经创伤后恢复 神经生物学的进展 2014年 116年 1 12 锅 Y。 蔡 年代。 当前状态发展的间充质干细胞在临床应用许旺细胞移植 分子和细胞生物化学 2012年 368年 1 - 2 127年 135年 2 - s2.0 - 84864352631 10.1007 / s11010 - 012 - 1351 - 6 任 Z。 王 Y。 彭 J。 赵 Q。 陆 年代。 干细胞在周围神经的再生和修复 在神经科学评论 2012年 23 2 135年 143年 10.1515 / revneuro - 2011 - 0069 2 - s2.0 - 84861034032 Schaakxs D。 Kalbermatten d F。 Raffoul W。 Wiberg M。 Kingham p . J。 在去神经的再生细胞注射肌肉萎缩和减少增强复苏后神经修复 肌肉和神经 2013年 47 5 691年 701年 10.1002 / mus.23662 2 - s2.0 - 84876785595 Spejo 答:B。 卡瓦略 j·L。 去 a . M。 奥利维拉 a·l·R。 神经保护间充质干细胞对脊髓运动神经元的影响后脊神经前根轴索显微外科术:突触稳定性和轴突再生 神经科学 2013年 250年 715年 732年 10.1016 / j.neuroscience.2013.07.043 2 - s2.0 - 84884159517 Keilhoff G。 Goihl 一个。 Langnase K。 Fansa H。 狼 G。 间充质干细胞的分化转化成雪旺细胞样的髓鞘细胞 欧洲细胞生物学杂志》上 2006年 85年 1 11 24 10.1016 / j.ejcb.2005.09.021 2 - s2.0 - 30344440721 Keilhoff G。 刺 F。 Goihl 一个。 狼 G。 Fansa H。 Transdifferentiated间充质干细胞支持神经再生和髓鞘形成的另类疗法 细胞和分子神经生物学 2006年 26 7 - 8 1235年 1252年 10.1007 / s10571 - 006 - 9029 - 9 2 - s2.0 - 33845547990 伍德伯里 D。 施瓦兹 e . J。 Prockop d . J。 黑色的 i B。 成年大鼠和人类骨髓基质细胞分化成神经元 神经科学研究杂志 2000年 61年 4 364年 370年 Barnabe g F。 Schwindt T . T。 Calcagnotto m E。 莫塔 f . L。 马丁内斯 G。 de Oliveira a . C。 Keim l . m . N。 D 'Almeida V。 Mendez-Otero R。 梅洛 l E。 化学物质诱导大鼠间充质干细胞采用neuronal-like细胞的分子性质但没有基本的神经功能属性 《公共科学图书馆•综合》 2009年 4 4 e5222 10.1371 / journal.pone.0005222 2 - s2.0 - 65349106547 Bossio C。 Mastrangelo R。 Morini R。 Tonna N。 椰子树 年代。 Verderio C。 Matteoli M。 比安科 F。 一个简单的方法来生成脂肪干细胞的神经元用于筛查 分子神经科学杂志》上 2013年 51 2 274年 281年 10.1007 / s12031 - 013 - 9985 - 8 2 - s2.0 - 84885185248 龚 M。 Bi Y。 江 W。 张 Y。 程ydF4y2Ba l 侯 N。 程ydF4y2Ba J。 李 T。 视黄酸受体β介导all-trans视黄酸促进间充质干细胞的神经元分化 国际生物化学和细胞生物学杂志》上 2013年 45 4 866年 875年 10.1016 / j.biocel.2013.01.002 2 - s2.0 - 84873734691 Wislet-Gendebien 年代。 Leprince P。 穆南 G。 Rogister B。 调节神经标记巢蛋白和GFAP表达的培养骨髓基质细胞 《细胞科学 2003年 116年 16 3295年 3302年 10.1242 / jcs.00639 2 - s2.0 - 0042887242 Munoz-Elias G。 伍德伯里 D。 黑色的 i B。 骨髓基质细胞有丝分裂,神经元分化:干细胞和前体功能 干细胞 2003年 21 4 437年 448年 10.1634 / stemcells.21 - 4 - 437 2 - s2.0 - 0038787488 Himeno T。 Kamiya H。 Naruse K。 程 Z。 伊藤 年代。 近藤 M。 小川 T。 Fujiya 一个。 加藤 J。 铃木 H。 陈宏伟 T。 石漠 Y。 同时 Y。 Isobe K。 中村 J。 间充质干细胞的细胞来源于小鼠诱导多能干细胞改善糖尿病小鼠多神经病 生物医学研究的国际 2013年 2013年 12 259187年 10.1155 / 2013/259187 2 - s2.0 - 84890096899 Nishida H。 中山 M。 田中 H。 Kitamura M。 Hatoya 年代。 Sugiura K。 铃木 Y。 Ide C。 稻叶型 T。 评价自体骨髓基质细胞移植到脑脊液治疗慢性脊髓损伤的狗 美国兽医研究杂志》上 2011年 72年 8 1118年 1123年 10.2460 / ajvr.72.8.1118 2 - s2.0 - 80052692036 Voulgari-Kokota 一个。 沙 R。 Karamita M。 Kyrargyri V。 Tseveleki V。 Evangelidou M。 Delorme B。 Charbord P。 吴廷琰 R。 不分伯仲 l 间充质干细胞保护中枢神经系统神经元对谷氨酸会通过抑制谷氨酸受体表达和功能 实验神经学 2012年 236年 1 161年 170年 10.1016 / j.expneurol.2012.04.011 2 - s2.0 - 84861672249 Hameed A.-T。 易卜拉欣 R。 卡里姆 a.j。 Zuki 一个。 阿 T。 Ramasamy R。 神经生物学的观察骨骼间充质干细胞在体外和体内的兔坐骨神经受伤 动物和兽医杂志》上的进步 2011年 10 6 686年 691年 10.3923 / javaa.2011.686.691 2 - s2.0 - 79952011850 Tremp M。 Schwabedissen M . M。 卡珀斯 大肠。 恩格斯 p E。 Fischmann 一个。 Scherberich 一个。 Schaefer d . J。 Kalbermatten d F。 再生潜力的人类和自体干细胞移植后大鼠坐骨神经损伤模型可以通过MRI监控 细胞移植 2013年 10.3727 / 096368913 x676934 Stassart r·M。 Fledrich R。 Velanac V。 雪旺细胞衍生的作用在remyelination neuregulin 1 自然神经科学 2013年 16 1 48 54 10.1038 / nn.3281 2 - s2.0 - 84871712382 Carter-Arnold j·L。 Neilsen n . L。 Amelse L . L。 Odoi 一个。 达哈 m . S。 体外分析马,骨骨髓来源间充质干细胞显示年龄差异——马的准确性 马兽医杂志》 2014年 46 5 589年 595年 10.1111 / evj.12142 2 - s2.0 - 84890290174 Kasashima Y。 上野 T。 获利, 一个。 Goodship 答:E。 史密斯 r·k·W。 优化从马胸骨骨髓愿望的间充质干细胞安全复苏 马兽医杂志》 2011年 43 3 288年 294年 10.1111 / j.2042-3306.2010.00215.x 2 - s2.0 - 79954499572 这些后 美国J。 Goletz 我。 克莱因 H。 Stumpf G。 Beluche l。 罗德 C。 查尔顿队 K。 Litzke l F。 隔离和马骨骨髓来源间充质干细胞的特性 美国兽医研究杂志》上 2007年 68年 10 1095年 1105年 10.2460 / ajvr.68.10.1095 2 - s2.0 - 35448984992 Kopen g . C。 Prockop d . J。 Phinney d·G。 骨髓基质细胞迁移在前脑和小脑,后分化为星形胶质细胞注入新生小鼠的大脑 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 1999年 96年 19 10711年 10716年 10.1073 / pnas.96.19.10711 2 - s2.0 - 0032874061 Bossolasco P。 一家名为 l Calzarossa C。 Rimoldi s G。 Borsotti C。 Lambertenghi Deliliers G。 Silani V。 Soligo D。 Polli E。 Neuro-glial人类骨髓干细胞体外分化 实验神经学 2005年 193年 2 312年 325年 10.1016 / j.expneurol.2004.12.013 2 - s2.0 - 18144382616 赫尔曼 一个。 Liebau 年代。 Gastl R。 比较分析neuroectodermal分化能力的人类骨髓基质细胞使用各种转换协议 神经科学研究杂志 2006年 83年 8 1502年 1514年 10.1002 / jnr.20840 2 - s2.0 - 33744914853 人物个性 N。 Korkko J。 Ibberson D。 Kopen g . C。 DiGirolamo C。 Phinney d·G。 MicroSAGE 2353表达基因分析单个细胞衍生的殖民地无差别的人类间充质干细胞显示mrna的多个细胞谱系 干细胞 2001年 19 5 408年 418年 10.1634 / stemcells.19 - 5 - 408 2 - s2.0 - 0034805960 伍德伯里 D。 雷诺兹 K。 黑色的 i B。 成人骨髓间质干细胞表达生殖系,外胚层的内胚层、中胚层的基因在神经发生 神经科学研究杂志 2002年 69年 6 908年 917年 10.1002 / jnr.10365 2 - s2.0 - 0037106144 Sanchez-Ramos j . R。 神经细胞来自成人骨髓和脐带血 神经科学研究杂志 2002年 69年 6 880年 893年 10.1002 / jnr.10337 2 - s2.0 - 0037106213 赫尔曼 一个。 Gastl R。 Liebau 年代。 Popa m . O。 菲德勒 J。 波姆 b . O。 梅塞尔 M。 莱赫奇 H。 施瓦兹 J。 布伦纳 R。 斯托奇 一个。 高效的一代的神经干细胞的细胞从成人骨髓基质细胞 《细胞科学 2004年 117年 19 4411年 4422年 10.1242 / jcs.01307 2 - s2.0 - 5444246148 Pittenger m F。 麦凯 a . M。 贝克 s . C。 贾斯瓦尔 r·K。 道格拉斯 R。 莫斯卡 j . D。 摩尔人 m·A。 Simonetti d . W。 克雷格 年代。 Marshak d·R。 Multilineage成年人类间充质干细胞的潜力 科学 1999年 284年 5411年 143年 147年 10.1126 / science.284.5411.143 2 - s2.0 - 0033515827 雷诺兹 b。 Tetzlaff W。 维斯 年代。 多能干细胞EGF-responsive纹状体胚胎祖细胞产生神经元和星形胶质细胞 神经科学杂志》上 1992年 12 11 4565年 4574年 2 - s2.0 - 0026526516 Sanchez-Ramos J。 首歌 年代。 Cardozo-Pelaez F。 成人骨髓基质细胞在体外分化成神经细胞 实验神经学 2000年 164年 2 247年 256年 10.1006 / exnr.2000.7389 2 - s2.0 - 0034537437 更为重要 P.-F。 Mok p.l.。 畅 研究。 梁 张炳扬。 然后 K.-Y。 从BM-derived生成neuron-like细胞间充质基质细胞体外 Cytotherapy 2007年 9 2 170年 183年 10.1080 / 14653240701196829 2 - s2.0 - 34047118680 Tondreau T。 Lagneaux l Dejenefle M。 厚重的 M。 这部 C。 Delforge 一个。 布朗的 D。 骨骨髓来源间充质干细胞已经表达特定的神经分化之前的蛋白质 分化 2004年 72年 7 319年 326年 10.1111 / j.1432-0436.2004.07207003.x 2 - s2.0 - 18144380142 Foudah D。 Monfrini M。 Donzelli E。 Niada 年代。 Brini a . T。 Orciani M。 Tredici G。 Miloso M。 由未分化神经标记的表达mesenchymal-like来自不同来源的干细胞 免疫学研究期刊》的研究 2014年 2014年 16 987678年 10.1155 / 2014/987678 2 - s2.0 - 84896977763 Boulland J.-L。 Mastrangelopoulou M。 Boquest a . C。 雅各布森 R。 诺尔 一个。 格洛弗 j . C。 阿胶 P。 表观遗传调控的巢蛋白表达在神经源性分化的脂肪组织干细胞 干细胞与发展 2013年 22 7 1042年 1052年 2 - s2.0 - 84875933153 10.1089 / scd.2012.0560 海德 c . L。 Isoniemi k . O。 Torvaldson 大肠。 埃里克森 j·E。 洞察中间丝状体监管从开发到老化 《细胞科学 2011年 124年 9 1363年 1372年 10.1242 / jcs.041244 2 - s2.0 - 79955534465 金 X。 荣格 戈尔。 贝克 年代。 金 H。 细胞表面巢蛋白是神经胶质瘤干细胞的生物标志物 生物化学和生物物理研究通信 2013年 433年 4 496年 501年 10.1016 / j.bbrc.2013.03.021 2 - s2.0 - 84876472575 Michalczyk K。 齐曼 M。 巢蛋白在细胞细胞骨架组织结构和预测功能 组织学和组织病理学 2005年 20. 2 665年 671年 2 - s2.0 - 16344396507