SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2014/423635 423635年 研究文章 导演孤雌生殖的干细胞分化成脂肪细胞工程可注射脂肪组织 刘 魏 1 杨 杏园 2 杨ydF4y2Ba Xingrong 1 崔 Jihong 1 刘 吴文光家 1 太阳 梅 1 饶 杨 1 程ydF4y2Ba “ 1 Quesenberry 彼得·J。 1 Rege说实验室的组织工程 生命科学学院 西北大学 太白路229号,710032年西安 中国 nwu.edu.cn 2 妇产科学系 西安交通大学第一附属医院 西安710061年 中国 xjtu.edu.cn 2014年 23 12 2014年 2014年 02 08年 2014年 01 11 2014年 04 11 2014年 23 12 2014年 2014年 版权©2014刘魏et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

选择合适的种子细胞是脂肪组织工程的关键。这里,我们报道了逐步诱导孤雌生殖的胚胎干细胞分化成脂肪形成的细胞(pESCs)及其在工程中的应用与普朗尼克f - 127注射脂肪组织。pESCs多能分化能力,能形成畸胎瘤,包括三个主要的生殖层。细胞迁移的拟胚体(EBs)选择性分离和扩大获得胚胎间充质干细胞(eMSCs)。eMSCs表现出相似的细胞表面标记表达谱与骨明日间充质干细胞(bmsc)和多功能分化能力。地塞米松诱导下,吲哚美辛和胰岛素,eMSCs可以分化成脂肪形成的细胞增加adipose-specific基因的表达和油滴细胞质内的口供。评估其适用性作为脂肪组织工程的种子细胞,CM-Dil贴上脂肪形成的细胞来源于eMSCs被播种到普朗尼克f - 127水凝胶和皮下注入裸鼠。注射后4周,灿烂和半透明的构造形成于皮下的网站。组织学观察表明,新的脂肪组织成功制作标本的标记细胞。当前研究的结果表明,pESCs有很大的潜力的制造注射脂肪组织。

 1。介绍

在整形外科中,越来越多的业务参与修复深度烧伤造成的软组织缺损,先天性疾病、肿瘤的切除范围从小型切除术为乳腺癌的乳房切除术( 1]。自体皮瓣移植或商业填充物,如粘弹性hylan和透明质酸,通常用于软组织修复( 2, 3]。尽管取得一定程度的成功,这些技术有明显的缺点,包括施主能级发病率和体积损失( 4, 5]。

脂肪组织工程日益在再生医学领域和战略旨在制造功能的脂肪组织脂肪形成的细胞支架材料的组合( 6, 7]。成人骨髓间充质干细胞(msc)和脂肪组织拥有多功能分化能力,通常用作脂肪组织工程的种子细胞。然而,这些细胞可能失去增殖能力和表型 在体外扩张( 8- - - - - - 10]。这些缺点使它很难获得足够制造脂肪组织和功能细胞。胚胎干细胞(ESCs)可以分化成表型的所有三个胚芽层和设想为一个可行的制造所需的组织来源。一直在尽最大努力处理的ESCs分化成特定的表型和作为种子细胞的无限供应。的详细协议诱导分化的ESCs可靠和高效成脂肪形成的细胞已经被描述 11, 12]。然而,最新收获技术的ESCs需要破坏胚胎,这可能会导致重大的政治和伦理问题对于他们的应用程序( 13]。

孤雌生殖是指卵子激活人为没有受精的胚胎发育。孤雌生殖的胚胎干细胞(pESCs)可以获得无精生殖生物的内细胞团 14]。因为遗传缺陷影响正常胎盘形成人类,孤雌生殖的胚胎无法成长为可行的胎儿,而这个特性允许创建pESCs避免ESCs的相关伦理障碍( 15]。pESCs拥有ESCs的典型特征,包括广泛的自我更新和分化 在体外和 在活的有机体内为所有三个生殖细胞层( 16]。人类pESCs可能histocompatible有很大一部分的人口由于纯合子的HLA基因型的存在 17, 18]。通用HLA haplotype-matched pESCs可能减少的风险immunorejection移植后分化的衍生品,提供显著的优势ESCs的同种异体细胞疗法的应用了。

我们假设pESCs分化成功能性脂肪形成的细胞可以用于工程脂肪组织。在目前的实验中,我们采用阶梯式方法,区分pESCs脂肪形成的细胞谱系。获得细胞的表型是由脂肪细胞的特定基因的表达和细胞内甘油三酯的积累。然后,细胞被播种到普朗尼克f - 127,和 在活的有机体内形成脂肪组织通过注射的方式进行调查。

 2。材料和方法 2.1。细胞隔离和文化

鼠标pESCs(来自C57BL / 6小鼠,一种礼物公子华教授,西农大学中国)在一层馈线的小鼠胚胎成纤维细胞培养灭活与丝裂霉素C和扩展ESGRO完成+媒介(Billerica的微孔,MA), 37°C / 5%的股份有限公司2孵化器。在相差显微镜观察细胞形态(TE2000-U,尼康Inc .)。

骨明日间充质干细胞(bmsc)分离和扩大长C57BL / 6小鼠骨骼。简而言之,长骨头切除成了碎片,在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)含10%胎牛血清(Gibco,宏伟的岛,纽约)3 d。不依从细胞和组织碎片被仔细和新鲜的培养基是补充道。2通道后的细胞用于研究。

pESCs播种在盖玻片(费舍尔科学)和固定在4%多聚甲醛在冰上。三次清洗后用磷酸缓冲盐(PBS)和屏蔽10%正常血清驴,一夜之间,样品被孵化与初级抗体包括OCT4、NANOG, SSEA-1(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)在4°C。与PBS三洗后,细胞的幻灯片是在室温下孵化与二级抗体(表达载体,卡尔斯巴德,CA) 30分钟。图片用激光共焦显微镜拍摄(FV1000,奥林巴斯公司(东京)。消极的控制,主要抗体是省略。

评估如果pESCs具有多能分化能力 在活的有机体内、细胞使胰蛋白酶化 1 × 10 6 细胞悬浮在50 μL DMEM皮下注入裸鼠。4周后,形成畸胎瘤是收获和4%多聚甲醛固定,脱水虽然乙醇分级,嵌入在石蜡切片(7 μ部分),与苏木精和伊红染色())。

 2.2。推导过程和特点,从pESCs胚间充质干细胞(eMSCs) 2.2.1。EB形成

pESCs使胰蛋白酶化和resuspended在细胞生长介质(CGM) (DMEM补充50毫克/毫升L-proline(σ),不必要的氨基酸(微孔)1%,1% 2-mercaptoethanol(σ),和20%胎牛血清(Gibco))。细胞( 1 × 10 5 )转移到超低附件菜(费舍尔科学)和培养形成EBs。每隔一天中被改变。

 2.2.2。体外自发分化<斜体> < /斜体>

pESCs能够形成EBs在悬浮培养4 - 5 d如上所述。然后EBs镀到0.1% gelatin-coated菜来评估他们的发展潜力通过监测特定标记物的表达。CGM用于培养EB扩展,扩展被允许区分10 d。

 2.2.3。通过rt - pcr基因表达分析

监控顺序differentiation-related基因的表达在EBs和扩展,rt - pcr研究进行2,4,6,8,镀后10 d EB。从细胞总RNA提取使用RNA分离试剂(豆类生物公司,日本)根据制造商的协议。提取的RNA是量化使用GeneQuant pro(美国通用电气医疗集团)。RevertAid第一链cDNA合成装备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)被用来RNA模板转换成互补。反应进行的埃普多夫Mastercycler(埃普多夫,德国)以下温度剖面图:65°C 5分钟,5分钟25°C, 50°C 50分钟,70°C,持续15分钟。引物序列和片段大小都列在表中 1。所有的引物都来自豆类。放大产品分离1% (w / v)琼脂糖凝胶和可视化的协助下溴化乙锭和紫外线。 β肌动蛋白基因作为参考。

rt - pcr引物序列。

基因 引物 产品
Snai1 GACCTGTGGAAAGGCCTTCTCTAGG 170个基点
CCTGGCACTGGTATCTCTTCACATC
Snai2 GGGAGCATACAGCCCTATTACTG 146个基点
CCTTGGATGAAGTGTCAGAGGAA
Hand1 GCTACGCACATCATCACCATCATC 125个基点
CAGCAGCCAGCTCTGGAAGTAAG
GATA2 GCCAAAAGAGAGACTGGAGGAAGGG 82个基点
ACACCTCCCACCTTTTAGTCACTCTG
Meox1 CAGTCAAAATGTTCAGCATGGTAG 195个基点
AGAGGAAAATGTTGAATGGAAACTTTA
Myf5 CCTGAAGAAGGTCAACCAAGCTTTC 158个基点
GGCTGTAATAGTTCTCCACCTGTTC
PAX3 CTCTGAACCTGATTTACCGCTGAA 124个基点
CCTGGTGTAAATGTCTGGGTAGTG
Pax7 CCTCAGGTCATGAGCATCCTTAGC 192个基点
GTAGGTGGGTGGGCAGTAAGACTG
Chrd GGTGCAAGTGGTAGGTACAGGTAG 182个基点
GCTCGTTCTGTAGCAGCATATGAG
嘘 CCCAATTACAACCCCGACATCATATTTAAG 196个基点
CCTCATAGTGTAGAGACTCCTCTGAATG
我们 CTGTCCCTAATGGAGACTCCCAGA 162个基点
CCTGTTCTGATTTGATGTGCTCTGATG
OSR1 GCCACTTCACTAAGTCCTATAACCTAC 169个基点
TTCCCACACTCTTGACACTTGAAA
α胎蛋白 CCCTCATCCTCCTGCTACATTTC 145个基点
GGAACAAACTGGGTAAAGGTGATG
β连环蛋白 GCAACCCTGAGGAAGAAG 501个基点
TCCCAGCAGTACAACGAG
趋化因子受体CXCR4 CCACGGAGTCAGAATCCTCCAGTT 572个基点
CCAGCATTTCTACCACCATTTCAGG
NCAM1 CGACTCCTCTACCCTCACCATCT 559个基点
CTCGTCATCTTCCTCCTCGTTCT
巢蛋白 GTTACCAAAGCCTCTTAGAAATGACC 577个基点
CAGATGCAACTCTGCCTTATCCTC
NOTCH1 AATGTGGATGCTGCTGTTGTGCT 569个基点
ATGGATGGAGACTGCTGGAATGG
NANOG GCACTCAAGGACAGGTTTCAG 169个基点
GACCATTGCTAGTCTTCAACCAC
OCT3/4 GTGTGAGGTGGAGTCTGGAG 182个基点
AGCCTCATACTCTTCTCGTTGG
β肌动蛋白 GAGACAACATTGGCATGGCTTTG 190个基点
CCTCAGCCACATTTGTAGAACTTTG
2.2.4。推导和eMSCs扩张

八天之后EB电镀,纺锤状细胞可能观察到的扩展。细胞被选择性地分离细胞刮刀和亚文化MesenCult MSC基础培养基(干细胞,英国)在高密度。培养基是改变了每隔一天。细胞的人口获得14 ~ 21 d后通过文化。4 ~ 5个额外的通道后,细胞表现出统一的纺锤状模式。

 2.2.5。eMSCs的特点

使用细胞增殖细胞增殖分析试剂4 - [3 - (4-iodophenyl) 2 (4-nitrophenyl) 2 h-5-tetrazolio] 1, 3-benzene disulfonate (WST-1,罗氏)测定。对于这个过程,eMSCs (p6)使胰蛋白酶化,100年1000个细胞 μL MSC基础培养基被播种在96 -孔板一式五份。10 μL WST-1被添加到每个好,孵化7 d。吸光度测量每24小时在一个标(BioTek协同HT、Winooski VT)在450海里。bmsc p3作为控制。

eMSCs (p6)使胰蛋白酶化, 1 × 10 5 细胞被resuspended在100年 μPBS的L。这些细胞被称为FITC-conjugated兔子anti-mouse抗原CD13、CD14、CD29、CD44、CD45、CD90.2, CD105, CD133和存在(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)。bmsc p3被用作控制。FITC-conjugated isotype-matching Igs被用来确定非特异性染色。细胞被FACSCalibur检查血细胞计数器,与细胞分析的数据探索软件(BD生物科学)。

eMSCs (p6)使胰蛋白酶化和盖玻片上播种。4 ~ 5 d后,细胞被固定在4%多聚甲醛为30分钟,孵化一夜之间在4°C主要抗体SFA-1,肌酸kinase-M (CKM) Col1a1, Col2a1,整合素 β1、波形蛋白(圣克鲁斯生物技术)和心脏肌凝蛋白重链(Abcam,剑桥,英国)。免疫细胞化学(如前所述)。

 2.3。定向分化eMSCs 2.3.1。成骨和Chondrogenic分化

成骨分化,eMSCs (p6)和BMSC在成骨分化培养基培养(p3) (CGM补充50 nM地塞米松(σ),10毫米beta-glycerophosphate(σ),和50 μ21 d M ascorbate-2-phosphate)。媒介改变了每一个3 d。rt - pcr分析相关基因表达谱进行成骨的血统,14日和21 d后归纳。21 d后,细胞被固定在4%多聚甲醛和冯Kossa和茜素红S染色处理。对于chondrogenic分化 ,eMSCs和综合培养与50 chondrogenic介质(CGM补充 μM ascorbate-2-phosphate 10 ng / mL TGF - β1(研发系统、明尼阿波利斯、MN),和500 ng / mL IGF(研发系统))。媒介改变了每一个3 d。rt - pcr分析基因表达谱进行相关chondrogenic血统7点14和21 d后归纳。21 d后,细胞被加工为Col2a1番红精O和免疫细胞化学染色和aggrecan。eMSCs培养在正常MSC基础培养基作为控制。使用的引物是列在表中 2。

rt - pcr引物序列。

基因 引物 产品
高山 TCACGGCCATCCTATATGGTAAC 98个基点
CTGGTAGTTGTTGTGAGCGTAATC
OPN CACACAGACTTGAGCATTCCAAA 77个基点
GGAACTTGCTTGACTATCGATCAC
RUNX2 CCAGTCTTACCCCTCCTATCTGA 138个基点
GTGGCAGTGTCATCATCTGAAATAC
OCN CCATCTTTCTGCTCACTCTGCTG 136个基点
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTGC
IBSP GAGACGGCGATAGTTCCGAAGAG 132个基点
CCGAGAGTGTGGAAAGTGTGGAG
BGLAP2 CAAGCAGGAGGGCAATAAGGTAG 133个基点
CTGGTCTGATAGCTCGTCACAAG
COL2a1 CCAGAACATCACCTACCACTGTAA 111个基点
GCCCTCATCTCTACATCATTGGA
AGGRECAN CCATGTGTGGGTGACAAAGACAG 92个基点
TCCACGTAGCAGTAGACATCATAGG
2.3.2。脂肪形成的分化

脂肪形成的差异化,eMSCs (p6)和BMSC (p3)暴露在脂肪形成的诱导培养基(CGM补充1 μ地塞米松,0.5毫米isobutylmethylxanthine, 200年 μM吲哚美辛,10 μg / mL胰岛素(σ))为3、6、9和12 d。媒介改变了每一个3 d。中存在的基因表达特征进行关键脂肪形成的标记(c / ebp, ppar - γ、ap2和lpl)。使用Bio-Rad实时PCR系统中存在了。基因表达的相对水平被规范化 β肌动蛋白基因使用比较CT方法根据制造商的指示。使用的引物是列在表中 3。

引物序列中存在。

基因 引物 产品
C / EBP CCGATGAGCAGTCACCTCCAGAG 169个基点
GGTCGATGTAGGCGCTGATGTCTA
PPAR - γ CACCAACTTCGGAATCAGCTCTG 83个基点
CTGTGGTAAAGGGCTTGATGTCAA
AP2 ACAGGAAGGTGAAGAGCATCATAA 143个基点
GGAAGTCACGCCTTTCATAACAC
LPL GCTGTAACAATCTGGGCTATGAGA 78个基点
GAGAGCGAGTCTTCAGGTACATC

这些细胞被使胰蛋白酶化,在盖玻片播种。后3、6、9和12 d的感应,细胞被固定在4%多聚甲醛1 h,并进行了免疫细胞化学(如前所述)。主要的抗体包括AP2、C / EBP, LPL(圣克鲁斯生物技术)。针孔的频道设置、检测器增益放大抵消,增益调整提供一个最佳的平衡荧光强度(通道1:PMT电压294 V;通道2:443 V)。

油红O染色,细胞被固定在10%福尔马林和用60%异丙醇(σ)。2%油红O的细胞培养试剂(σ)在室温下15分钟。多余的染色和60%异丙醇被洗涤。相衬显微术的染色结果。脂肪形成的分化的比例是由计算油红的好心人和油红o型阴性细胞。五个领域的观点计算每个样本。

 2.4。植入 2.4.1。动物

六个裸体小鼠(男性)购自上海实验动物中心,中国科学院。所有的动物研究和协议处理后动物的指导方针控股单位西北大学。

 2.4.2。普朗尼克f - 127的准备

普朗尼克f - 127(σ)是会慢慢溶解在4°C DMEM准备20% (w / v)的解决方案。解决方案是通过0.22 filter-sterilized μ米孔隙大小瓶盖过滤和储存在4°C之前使用。

 2.4.3。注射和观察

确定网站内的脂肪细胞植入 在活的有机体内,adipogenically诱导eMSCs (d6)沾CM-Dil,这在后续实验中是稳定的。然后细胞被播种到冰冷的普朗尼克f - 127细胞的浓度 2 × 10 6 /毫升。解决方案之前一直在冰上,防止过早凝胶注入。凝胶(0.5毫升)仔细从15毫升离心管转移到12-well板(康宁),油红O染色观察,和处理。

裸体小鼠腹腔内注射麻醉10%水合氯醛(300毫克/公斤),和0.5毫升cell-hydrogel复合在裸体小鼠的皮下注射( n = 5 )。在注射后4周,老鼠牺牲10%水合氯醛,和标本移植总检查和组织学分析。

 2.4.4。透射电子显微镜(TEM)

TEM,细胞使胰蛋白酶化、中和、离心机、冲洗,通常固定在1毫升的固定剂溶液(2.5%戊二醛和甲醛2%)在4°C 6 h。从获得的样本 在活的有机体内实验固定在上面的固定剂解决方案24小时在4°C。

细胞和组织样本在2%琼脂糖液包衬下,冷冻在48°C为30分钟,丁为1毫米的立方体和分级乙醇脱水,并嵌入EMbed812环氧树脂(EMS,哈特菲尔德,PA)。超薄部分水沾在3%醋酸双氧铀在佐藤三重铅染色检查之前使用一个范CM12电子显微镜(范有限公司、Hillsboro或)。

 2.4.5。统计分析

数据表示为意味着±S.E.M.统计学意义是使用未配对学生的评估使用SPSS进行比较 t 以及(SPSS软件,版本16.0)。的值 P < 0.05 被认为是重要的。

 3所示。结果 3.1。表征pESCs

pESCs保持一个典型的碟形形态,增厚rim和减少向中心高nuclear-cytoplasmic比和突出的核仁。孤立pESCs MEF馈线可以扩大,形成紧凑的组织细胞(图 1(一))。表达高水平的pESCs SSEA-1, NANOG OCT4,发挥了关键作用在维持细胞的未分化状态(图 1 (b))。透射电子显微镜证实nuclear-cytoplasmic率高,密度和细胞质中含有的糖原池和一些球形或椭圆形线粒体(数字 1 (c)(一)和 1 (c)(B))。以确定pESCs拥有 在活的有机体内多能分化能力,pESCs注入裸鼠实验来测试他们的能力形成畸胎瘤。肿瘤块可以观察到动物的背部注射后4周。组织学观察表明,pESCs能够形成畸胎瘤包含三个胚芽层胃肠组织(内胚层),软骨,中胚层和神经细胞(外胚层)(图 1 (d))。

(一)形态的观察pESCs相衬显微镜下。(b)胚胎干细胞标记物的免疫细胞化学染色pESCs(酒吧= 100 μ米)。(c)透射电子显微镜显示pESCs的组织(p35区域),(A)、(B): pESCs“N”:细胞核的细胞;“M”:线粒体;酒吧= 2 μm, 1 μm。(d))染色pESCs畸胎瘤部分。染色显示pESCs拥有的能力来生成软骨、神经细胞,胃肠道组织 在活的有机体内。

 3.2。体外<斜体> < /斜体>分化

pESCs可能形成EBs在超低文化5 d后附件菜肴。EBs可以附着在糊化表面在2 h和2 d内完全被夷为平地。结果细胞特异性的不规则形状(数字显示 2(一个)(一)- 2(一个)(C))电镀后第一个4天内。6 d,几个形态不同的细胞已经出现人口,形成纺锤体和砖型细胞(数字的发展结果 2(一个)(D)和 2(一个)(E)),一个典型的未分化的密集的菌落形态观察。

(一)形态pESC-derived EBs和EBs的发展结果。(一)pESC-derived EBs的显微照片。((B) ~ (E))的显微图扩展从5 d EB镀gelatin-coated板2、4、6、8、10 d。(F)的显微照片eMSCs通道3展示纺锤状形态(酒吧= 100 μ米)。(b)示意图的轮廓pESCs分化和脂肪组织工程流程图。(c)转录的特定标记为中胚层,内胚层和外胚层分化。RNA样本未分化的pESCs, EBs(悬浮培养5天)和(+):后续粘附文化天被rt - pcr分析。ESCs Nanog和OCT4标记。 β肌动蛋白rt - pcr作为内部标准。m . DL2000 DNA标记。

从pESCs-EB细胞基因表达分析的结果揭示了编程相关表达式模式向外胚层的分化,中胚层和内胚层的血统。活动,Ncam1和切口转录因子参与外胚层的分化开始表达2天,但巢蛋白不表达。趋化因子受体cxcr4 endoderm-specific标志,开始表达EB的形成; β连环蛋白表达开始4天,分别是持续的。法新社并不表示。逐步upregulation epithelial-mesenchymal基因的转变,snai1 snai2,被观察到。其他的中胚层的子集,包括侧板/胚外中胚层(hand1 gata2),轴向中胚层(chrd嘘),近轴/肌原性的中胚层(meox1, myf5、pax3和pax7),和中间(处于pax2 osr1)中胚层基因,调节。多能标记未分化的细胞中表达,而表达降低了研究中不断分化开始后(图 2 (b))。的集体,这些数据表明,扩展,EBs包含三胚的分化细胞层,和上面的中胚层的标记,snai2, hand1, pax3, pax7,嘘,我们和osr1分化转录因子8 d达到顶峰。

 3.3。代eMSCs EBs

根据基因表达水平中胚层的承诺,纺锤状细胞选择性地孤立的发展,一个细胞刮刀8 d EB电镀后,和细胞随后在MSC基础培养基获得eMSCs扩大。4到5通道后,细胞的人口获得表明纺锤状形态(图 2(一个)(F))。

WST-1试验表明,eMSCs显著比bmsc更快增殖率(图 3(一个))。流式细胞仪分析表面eMSCs的标志。eMSCs负了CD45(白细胞共同抗原),CD14(脂多糖)和CD133 (aminopeptidase-N),表明他们不是起源于造血。粘附分子存在(激活白细胞细胞粘附分子)没有找到表达。细胞表达CD29 ( β1-integrin)、CD13(丙氨酰氨肽酶),CD44(透明质酸盐受体),CD90.2(胸腺细胞分化antigen-1b)和CD105 (endoglin SH2)。细胞表面标记表达谱表明,eMSCs是中胚层细胞。表面标记物的表达模式eMSCs bmsc相似(图 3 (b))。免疫细胞化学染色法进一步证实,扩大eMSCs展出中胚层的表型(图 3 (c))。具体来说,大多数eMSCs表示SFA-1 CKM, Col1a1, Col2a1, ITGB1,肌凝蛋白和波形蛋白。Nanog的表达、Oct4、SSEA-1 eMSCs显著下降,而pESCs。细胞超微结构的调查显示,包含旺盛的核浆。丰富的粗面内质网,线粒体的eMSCs包含不同的嵴。丝状纤维可以观察到原子核周围(数字 3 (d)(一)和 3 (d)(B))。

描述eMSCs和综合。(一)eMSCs和bmsc生长曲线。(b)代表直方图的细胞表面标志表情eMSCs (p6)和bmsc (p3)通过流式细胞仪分析,绿线代表的标记细胞数量(M1),及相关isotype-matched细胞由蓝线(M2)描述。(c) Immunofluorescent染色中胚层和具备干细胞标记。抗体与DAPI染色(绿色或红色)核染色(蓝色)(酒吧= 50 μ米)。(d)透射电子显微镜的eMSCs (p6)。(A)、(B): eMSCs酒吧= 0.5 μ米,“N”:细胞核的细胞;“M”:线粒体;“F”:丝纤维;“G”:高尔基体;“R”:粗面内质网。

 3.4。成骨分化分析

确认multilineage eMSCs分化能力,成骨分化是评估 在体外通过使用一个标准的协议和与bmsc相比。后诱导成骨的血统,我们比较osteogenic-specific标记的信使rna表达水平每隔7 d。rt - pcr结果表明,的表达碱性磷酸酶(alp)、骨gamma-carboxyglutamate蛋白2 (bglap2),骨涎蛋白(ibsp)、骨钙素(ocn),磷蛋白质分泌1 (opn),小牛相关转录因子2 (runx2)是调节明显成骨诱导后(图 4(一))。在这些基因、ocn runx2, bglap2 bmsc相比在eMSCs(图中高度表达 4 (b))。强劲的冯Kossa染色茜素红S 21 d后归纳证明两细胞成骨潜力,矿化和bmsc大于eMSCs(图 4 (c))。

成骨分化eMSCs和bmsc的潜力。(一)rt - pcr分析成骨分化相关基因表达谱。RNA样本uninduced细胞(联合国)和诱导细胞(+)的日子。(b)基因表达水平的rt - pcr半定量的分析。RNA样本uninduced细胞(联合国)和诱导细胞(+)的日子。每个基因的相对表达的表达 β肌动蛋白在同一个样本。值的±SD从3独立实验。 P < 0.05 * , P < 0.001 * * 。(c)·冯·Kossa和茜素红S染色21 d后成骨诱导或uninduced细胞(联合国)。

 3.5。Chondrogenic分化分析

rt - pcr、免疫细胞化学和红色染料染色证实阿chondrogenic谱系分化的细胞类型。rt - pcr分析表明,col2a1和aggrecan表达诱导和uninduced eMSCs,和chondrogenic诱导后表达增加(图 5(一个))。Chondrogenic differentiation-related基因,包括col2a1和aggrecan高度表达的bmsc与eMSCs相比(图 5 (b))。番红精O染色表明,细胞产生嗜碱性ECM沉积。细胞在诱导后21 d,都显示了一个典型的球形(图 5 (c))和定义良好的COL2a1和aggrecan细胞质染色和外围的细胞(图 5 (d))。

Chondrogenic分化eMSCs和bmsc的潜力。(一)rt - pcr分析chondrogenic分化相关基因表达谱。RNA样本uninduced细胞(联合国)和诱导细胞(+)的日子。(b)基因表达水平的rt - pcr半定量的分析。RNA样本uninduced细胞(联合国)和诱导细胞(+)的日子。每个基因的相对表达的表达 β肌动蛋白在同一个样本。值的±SD从3独立实验。 P < 0.05 * , P < 0.001 * * 。(c)细胞显微图21 d后chondrogenic归纳。番红精O染色(红色)带负电的蛋白聚糖21 d后chondrogenic感应或uninduced细胞(联合国)。酒吧= 100 μ米,(d) immunofluorescent染色aggrecan和Col2a1抗体染色(绿色),DAPI核染色(蓝色)。

 3.6。脂肪形成的差异化分析

评估eMSCs的脂肪形成的分化能力,这两种细胞受到标准脂肪形成的诱导文化。油红O染色显示,小脂滴形成细胞质6 d后归纳。12天,脂滴的大小显著增加并占领了大部分的细胞质。没有石油红色细胞中观察到的好心人uninduced标本(图 6(一))。细胞计数结果显示 51 % ± 6 。 8 % 和 39 % ± 5。3 % 油红体内细胞中观察到bmsc, eMSCs 12 d的脂肪形成的诱导后( P < 0.05 )。

脂肪形成的差异化eMSCs和bmsc的潜力。(a) Lipid-containing脂肪细胞后,油红O染色法检测12 d脂肪形成的文化的媒介。样本uninduced细胞(联合国)和诱导细胞(+)的日子。(b)基因表达谱与脂肪形成的诱导分化,uninduced(联合国)细胞。uninduced细胞和诱导细胞的RNA样本(+)的日子。值的±SD从3独立实验。 P < 0.05 * , P < 0.001 * * 。(c) Immunofluorescent AP2染色,c / EBP, LPL、抗体染色(绿色),DAPI核染色(蓝色)。样本uninduced细胞(联合国)和诱导细胞(+)的日子。酒吧= 50 μm。

执行中存在评估特定基因的表达谱的标记脂肪形成的细胞,包括lpl(脂蛋白脂肪酶),c / ebp α(CCAAT /增强子结合蛋白),ppar - γ(过氧物酶体扩散者激活受体 γ),ap2(脂肪细胞脂肪酸结合蛋白)。表达水平的bmsc被用作参考价值(设置为1)的计算 n 倍变化在感应的步骤。脂肪形成的诱导后,eMSCs显示显著增加表达式模式四种基因检查。显著的山峰c / ebp的表达 α( 33.91 ± 3.34 天9倍)发现,ppar - γ一天9 ( 315.55 ± 36.47 倍),lpl在12天( 4.93 ± 0.57 的ap2倍),12天( 6.14 ± 0.99 倍(图) 6 (b))。adipogenic-related基因的表达,包括c / ebp αlpl、ap2感应后bmsc高于在eMSCs(图 6 (b))。

免疫细胞化学研究进行进一步证明如果mRNA表达的变化导致蛋白水平升高。如图 6 (c)C / EBP α蛋白质被检测到在两个细胞早在3 d诱导后,然后诱导后表达稳步增长到12 d。LPL抗体检测在两个细胞在诱导后6 d。aP2抗体检测在3 d在bmsc感应后,虽然eMSCs延时信号,可以观察到6 d后归纳。

 3.7。体内脂肪组织工程的评价<斜体> < /斜体>

相差显微镜观察表明,adipogenically诱导eMSCs均匀分布在水凝胶并显示一个圆形的形态(图 7(一))。后细胞内脂滴可以注意到油红O染色(图 7 (b))。

(一)均匀的细胞封装和高生存能力的嵌入式普朗尼克f - 127细胞。(b)油红O染色显示脂质在普朗尼克f - 127。(c)皮下注射的adipogenically诱导eMSCs-hydrogels裸小鼠移植后4周。总值(d)的新形成的脂肪组织。(e)、(f)) ((e)(一),(e) (B))和马森的三色的((f) (A) (f) (B))染色显示成熟的脂肪细胞和脂肪组织部分功能血管标本中观察到,酒吧= 100 μm。(g)的CM-Dil标记细胞在组织部分新成立的组织。酒吧= 100 μm。(h)透射电子显微镜显示了植入物(A)和细胞外基质(B),“N”:细胞核的细胞;“L”:脂滴,酒吧= 2 μ米,200海里。

注射后4周,所有的动物都活了下来,没有发生炎症或挤压整个实验。新成立的组织移植是可见的动物(图 7 (c))。有轻微的体积减少移植实验。总检查表明,新成立的组织是灿烂,半透明(图 7 (d))。组织学观察显示,脂肪组织工程重现了正常脂肪组织的主要结构和组件。一个典型的环量由成熟的脂肪细胞和血管功能可以观察的标本。大部分的水凝胶吸收,无炎性细胞浸润或畸胎瘤的形成可以注意到(数字 7 (e)和 7 (f))。的红色荧光信号CM-Dil标记脂肪细胞分布在新成立的组织(图 7 (g))。

TEM的结果显示,新成立的组织中的脂肪细胞成熟和发达的核仁,胞浆丰富的核糖体和多核糖体,糖原星团,密度小脂滴,总的来说,大量的嵴线粒体与变量。ECM胶原纤维可以观察的标本(图 7 (h))。

 4所示。讨论

发展临床工程师脂肪组织可翻译方法为软组织重建需要协调的几个关键方面,包括细胞来源的选择、支架材料,和移植的方式交付( 8, 19, 20.]。选择一个合适的细胞来源对组织工程的策略是至关重要的。一个关键特征为脂肪组织工程理想的细胞类型是可用的来源是通过直接的收获或足够的数量 在体外扩张而不失去脂肪形成的表型( 21]。ESCs多能和能产生大范围的特定表型和被认为是潜在的候选人为无限的细胞来源组织工程( 22- - - - - - 25]。然而,收获的ESCs摧毁可行的胚胎,可能导致重大的政治和伦理问题对他们的应用程序。ESCs pESCs克服政治和伦理障碍与因为pESCs源自未孕卵母细胞。重要的是,ESCs pESCs有相似的特征,包括广泛的自我更新能力和分化成三个生殖细胞层( 26]。作为当前的实验证明,pESCs ESCs的形态特征,表现出典型的具备干细胞标记,包括Nanog OCT4 SSEA-1,并能形成畸胎瘤,包括三个胚芽层(图 1)。

在目前的研究中,我们采用分段策略指导pESCs分化成脂肪形成的细胞。我们从pESCs悬浮培养,获得EBs和调查监测细胞分化的基因表达模式。符合 在活的有机体内畸胎瘤形成能力,EB的细胞可以分化成三个生殖细胞系 在体外,可以由外胚层的表达(ncam1和切口),中胚层(snai1和snai2)和内胚层( β连环蛋白和趋化因子受体cxcr4基因(图) 2)。有趣的是,没有实质性的afp基因的表达也在实验中观察到的,这是与之前的研究一致 27]。这个特征是否依赖于物种变异或孤雌生殖需要进一步调查与其他孤雌生殖的ESC线。

EBs镀在细胞培养皿中让细胞增长。从海尔哥哥表现出不同的形态(图发展 2(一个)(E))和纺锤状细胞可以有选择地收集和获取eMSCs扩大。流式细胞术和免疫细胞化学染色证实eMSCs MSC标记(图表示 3 (b)),可以被进一步分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞(数字 4, 5, 6)。

已经表明,脂肪形成的分化可以感应IBMX组成的鸡尾酒,地塞米松,吲哚美辛和胰岛素。暴露在鸡尾酒后,转录因子CCATT增强器结合蛋白 β(C / EBP β)被激活。C / EBP“激活” β触发过氧物酶体扩散国的转录激活受体 γ(PPAR γ)和C / EBP α,进而协调激活基因编码脂肪形成的表型( 28, 29日]。我们发现,lpl ppar - γ和c / ebp αeMSCs几乎检测不到,但他们的表达逐渐增加到每天3感应和达到最大水平9。其次是成熟脂肪细胞标记物的表达ap2(脂肪细胞脂肪酸结合蛋白)和信号强烈表达了12天(图 6 (b))。免疫细胞化学和油红O染色结果进一步证实了上述结果(数据 6(一)- - - - - - 6 (c))和演示的功能获得脂肪形成的细胞。

我们的研究结果表明,eMSCs显示成骨的相对较低,相比bmsc chondrogenic,脂肪形成的分化能力。12 d的脂肪形成的感应,油红eMSCs细胞和bmsc的好心人 39.8 % ± 5。3 % 和 51.2 % ± 6.8 % ,分别。然而,脂肪组织工程中一个基本的挑战是提供足够大以适当的脂肪形成的表型细胞群。eMSCs拥有增殖率高于bmsc(图 3(一个))。此外,它已经表明,伴着可能失去multipotentiality期间 在体外扩张( 30.]。

综上所述,eMSCs可能更适合大量的脂肪组织工程。筛查和寻找pESCs与高脂肪形成的优化脂肪形成的诱导分化能力和发展协议应该鼓励与pESCs脂肪组织工程。

脚手架和交货方式是两个其他脂肪组织工程的关键方面。脚手架的生化和生物力学属性最近被证明在刺激干细胞分化中发挥作用对几位血统 31日]。目前,天然或合成材料与多孔结构常用的开放,和制造移植被开放手术植入( 32, 33]。干细胞培养脂肪形成的凝胶,模仿本机刚度的脂肪组织(2 kPa)显著调节脂肪形成的标记在缺乏外源脂肪形成的生长因子和小分子。随着基体刚度的增加,细胞变得更加分散,失去了圆形态,未能上调脂肪形成的标记( 34]。普朗尼克的f - 127是一个合成的水凝胶,无毒、生物相容性,bioabsorbable, FDA批准用于人类和已广泛应用于药物输送和控释应用程序( 35]。区分bmsc与脂质小滴观察即使没有脂肪形成的刺激在第14天普朗尼克f - 127 ( 36]。这表明3 d环境有一些脂肪形成的独立于激素诱导分化信号潜能,这强调了可容许性脂肪形成的普朗尼克f - 127。此外,注射材料允许微创交付,降低植入的手术并发症,防止过度的疤痕。

建议脂肪组织工程方法应该协调neovascularisation[和脂肪形成的过程 5, 37- - - - - - 39]。的 在活的有机体内注射实验表明,成熟和vascularised在皮下脂肪组织成功的网站4周后注射,和标签CM-Dil进一步证实,新成立的组织来源于植入细胞(图 7)。最终,当前研究的结果支持我们的假设,pESCs可以定向分化成功能性脂肪形成的细胞和脂肪组织工程应用。

 5。结论

本研究成功地导演pESCs分化成脂肪形成的细胞对脂肪生成表示主基因,包括LPL、PPAR γAP2 C / EBP α和细胞脂质在细胞质中积累。诱导脂肪形成的细胞可以用来制造注射脂肪组织与普朗尼克f - 127水凝胶相结合,所展示的总检查和组织学观察。这部小说的方法可能产生的优势功能和备用的同种异体软组织重建和整容手术。下一期我们将地址是系统地评估长期的组织工程化脂肪组织相容性免疫活性的动物模型。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 作者的贡献

杨魏刘和杏园同样对本文亦有贡献。

 承认

这项工作得到了国家自然科学基金(31271026)。

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