SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2014/379678 379678年 研究文章 Nanog和Oct4差别瞬态对这些引起DETA /不暴露在小鼠胚胎干细胞中胚层和内胚层的谱系分化 Mora-Castilla 塞吉奥 1、2 Tejedo 胡安·R。 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 7483 - 1729 Tapia-Limonchi 拉斐尔 1 迪亚兹 艾琳 1 蟾胡子鲇 安娜B。 1 Cahuana 格拉迪斯M。 1 Hmadcha Abdelkrim 3 马丁 弗朗茨 1 的索里亚 Bernat 3 http://orcid.org/0000 - 0003 - 0262 - 7029 Bedoya Francisco J。 1 江 魏 1 安达卢西亚的分子生物学和再生医学中心(CABIMER),大学de Olavide巴勃罗 生物医学研究网络(cib)糖尿病及相关代谢疾病 Red-Tercel,加拉卡斯Americo Vespucio S / N 41092年塞维利亚 西班牙 ciberdem.org 2 再生医学的桑福德财团 加州大学圣地亚哥 2880年Torrey Pines风景开车 拉霍亚,CA 92037 美国 ucsd.edu 3 安达卢西亚的分子生物学和再生医学中心(CABIMER),进步和健康的基础 生物医学研究网络(cib)糖尿病及相关代谢疾病 红色的雄鹰,Americo Vespucio S / N 41092年塞维利亚 西班牙 ciberdem.org 2014年 3 12 2014年 2014年 09年 06 2014年 29日 08年 2014年 09年 09年 2014年 3 12 2014年 2014年 版权©2014年塞吉奥Mora-Castilla et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

分化的多能性基因的功能是一个重要的调查。我们报告,Nanog和Oct4 reexpressed两个老鼠胚胎干细胞(制)行后暴露在区分剂DETA /不。两个细胞系表达一个电池中胚层和内胚层标记后诱导分化DETA / NO-based协议。共焦细胞进行定向分化的分析结果表明,大多数的细胞也表达Nanog表达内胚层基因如Gata4和FoxA2(75.4%和96.2%,resp)。同时,信使rna的中胚层标记Flk1和Mef2c也受到治疗。启动子的乙酰化组蛋白H3入住率Nanog reexpression的过程。此外,Nanog绑定Brachyury导致压抑的启动子的基因,从而扰乱mesendoderm过渡。

 1。介绍

胚胎干细胞(ESCs)不断自我更新和分化成任何类型的细胞。鼠标的ESCs自我更新至少部分由细胞外信号如白血病抑制因子(生活),通过激活保持未分化状态的Stat3通路( 1]。过去几年的研究发现转录因子网络所扮演的角色和表观遗传过程的维护ESC多能性( 2]。目前的证据表明,ESC多能性是由Nanog的表达策划Oct4 Sox2,浪人基因( 2- - - - - - 7]。Nanog在维护中起着重要作用的多功能外胚层和预防对原始内胚层分化的细胞在胚胎发育的内在质量( 4]。另一方面,异构的表达Nanog已经被记载在ESCs和波动Nanog表达细胞被建议为分化(提供一个机会 8- - - - - - 10]。此外,Nanog过度块外胚层和明确的内胚层(DE)在人类的ESCs和鼠标外胚层细胞分化[ 11]。额外角色的这些基因可能被认为因为他们也表示在DE细胞( 12- - - - - - 15]。

染色质结构的变化也扮演了一定的角色在干细胞的生物学 16- - - - - - 18]。通过表观遗传过程,多能表观基因组染色质结构开放,允许快速遗传调节( 19]。一氧化氮(NO)是一种信号分子,在发育过程中发挥作用,但机制仍然是一个研究的问题( 20.- - - - - - 22]。在这方面,ESC分化成细胞来源于三个胚胎胚芽层以下 在体外暴露在没有被报告( 23- - - - - - 26]。此外,全球变化endodermic[诱导过程中组蛋白乙酰化作用 23]和mesodermic [ 27没有被描述)分化。这些发现强调了相关性的联合行动在ESC分化的信号通路和表观遗传重组。具备干细胞在这项研究中,我们报告的差别,对这些基因的转录因子在NO-induced分化是瞬态,入住率Brachyury等分化基因的启动子区域的控制这些因素发挥作用的血统规范。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养,DETA /不治疗,明确内胚层分化、转染和排序

D3制(写明ATCC crl - 1934) ES-D3培养在37°C公司为5%2。细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Gibco,佩斯利,英国),补充heat-inactivated 15%胎牛血清(的边后卫)(美国犹他州洛根Hyclone), 0.5毫米 β巯基乙醇(Gibco)、谷酰胺(Gibco) 2毫米,0.1毫米MEM非必需氨基酸(Gibco), 5000 U /毫升青霉素和链霉素(Gibco),和1000 U /毫升的生活(ESGRO、Chemicon Billerica,妈,美国)。在适当的时候,细胞培养3天在生活的存在与否。治疗1毫米二乙撑三胺/一氧化氮加合物(DETA /不)(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)进行了19 h在培养中含有15%的边后卫和生活要求。immunochip分析,细胞暴露在0.5毫米DETA /不。这个浓度比1毫米引发了低水平的细胞死亡,从而使获得足够数量的核内蛋白执行染色质免疫沉淀反应过程。前化验在我们实验室没有实质性差异区分效应的两个浓度DETA /不使用。在完全培养基培养细胞随后另一段2天在生活的存在与否。诱导分化向明确的内胚层(DE),细胞被事先已经3天没有生活,后来接触到1毫米DETA /不为19小时。细胞被保持在培养基补充15%的边后卫在缺乏生活之后的天。在所有实验条件培养基代替日常。

D3线表达GFP的Oct4启动子(D3-Oct4线)是通过使用生成的4 μ克质粒pOct-eGFP,根据之前的出版物( 28]。细胞被electroporated (800 V, 50 μ30 ms)和由嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)阻力和GFP的表达。GFP-positive流式细胞仪和消极的细胞分类的优势SE系统(BD流式细胞仪咏叹调细胞分选仪,BD生物科学,Erembodegem,比利时)。D3-Oct4细胞培养。GFP细胞荧光可视化与奥林巴斯IX70倒置显微镜。

 2.2。RNA隔离、逆转录和实时PCR分析

总RNA提取使用试剂盒(表达载体,佩斯利,英国)和氯仿/异丙醇纯化过程。互补脱氧核糖核酸合成了1 μ使用M-MVL g的总RNA逆转录酶(Promega,马德里,西班牙)和随机引物根据制造商的指示。mRNA水平衡量实时PCR分析基于SYBR绿色(应用生物系统公司,佩斯利,英国),检测7500 ABI棱镜(应用生物系统公司)。结果规范化与 β肌动蛋白。实时PCR (F)和反向(R)引物使用如下:

Nanog F: AGCAGATGCAAGAACTCTCCTCCA,

Nanog R: CCGCTTGCACTTCATCCTTTGGTT,

Oct4 F: AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA,

Oct4 R: AACACCTTTCCAAAGAGAACGCCC,

Pdx1 F: AGCTCCCTTTCCCGTGGATGAAAT,

Pdx1 R: TAGGCAGTACGGGTCCTCTTGTTT,

FoxA2 F: TCAACGACTGCTTTCTCAAGGTGC,

FoxA2 R: TTCTCGAACATGTTGCCCGAGTCT,

叫4 F: AGGGTGAGCCTGTATGTAATGCCT,

叫4 R: AGGACCTGCTGGCGTCTTAGATTT,

趋化因子受体Cxcr4 F: TGATGCCATGGCTGACTGGTACTT,

趋化因子受体Cxcr4 R: AACGCTGCTGTAGAGGTTGACAGT,

Hnf1 βF: ACAGGGCAGAATGTTTGCAACGAG,

Hnf1 βR: TATAGGCATCCATGGCCAGCTTCT,

Sox17 F: TTATGGTGTGGGCCAAAGACGAAC,

Sox17 R: TCAACGCCTTCCAAGACTTGCCTA,

β肌动蛋白F: TCCTGTGGCATCCACGAAACTACA,

β肌动蛋白R: ACCAGACAGCACTGTGTTGGCATA。

2.3。蛋白质提取和免疫印迹

蛋白质提取与里帕缓冲区(Sigma-Aldrich)补充鸡尾酒的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)。简单地说,细胞从培养皿中使胰蛋白酶化,离心机,洗一次冷PBS。细胞球然后resuspended孵化为20分钟里帕缓冲区在冰上和用3 10秒脉冲振幅10%(美国布兰森数字声波降解器,丹伯里,CT)。离心后,上清液中变性Laemmli加载缓冲10分钟98°C。总蛋白(20 μg)是由sds - page分离和转移到PVDF膜随后探讨了anti-Nanog(美国蒙哥马利TX Bethyl) anti-Oct4 (BD转导,圣何塞、钙、美国),anti-Pdx1 (Abcam,剑桥,英国),anti-Sox17(美国Billerica的微孔,MA),或anti-Gata4(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),和反 β肌动蛋白(Sigma-Aldrich)加载控制。

 2.4。免疫荧光

共焦研究细胞被播种在盖玻片如下。玻璃盖玻片24毫米直径在盐酸洗,用水浴30分钟。盖玻片是后来用50%的乙醇清洗,用30分钟。洗后用70%和95%乙醇和声波降解法、盖玻片被风干,放置在6-well组织培养板(Nunc,罗切斯特,纽约,美国)。涂层与基底膜基质(美国加州BD生物科学)2小时37°C。接下来,盖玻片洗了淘汰赛杜尔贝科修改鹰的媒介与D3细胞(Gibco)和播种密度75×103细胞/。细胞培养及诱导分化。然后,细胞用4%多聚甲醛固定10分钟,其次是透化作用与甲醇(−20°C)为5分钟。样品被暴露于屏蔽解决方案30分钟(3% BSA在PBS + 0.1%渐变20)和孵化一夜之间在4°C兔子anti-Nanog(美国蒙哥马利Bethyl实验室),鼠标anti-Gata4(圣克鲁斯生物技术),和山羊anti-FoxA2(圣克鲁斯生物技术)。检测主要抗体,anti-mouse Alexa萤石488(英杰公司、加拿大),anti-rabbit Alexa萤石568(表达载体),抗体和Alexa萤石488(表达载体)。细胞复染色与300 nM DAPI (Tocris,英国布里斯托尔)。盖玻片是安装在显微镜载玻片VECTASHIELD安装介质(向量实验室,伯林盖姆,加州)和可视化用共焦显微镜(徕卡TCS SP5)使用HCX PL APOλ蓝色100×1.4油浸物镜。为量化,101个细胞(Nanog或Gata4)或两个(Nanog和Gata4)污渍从9不同领域和116个细胞(Nanog或FoxA2)或两个(Nanog和FoxA2)污渍来自7个不同领域的一项实验中被记录下来。

 2.5。染色质免疫沉淀反应试验

批3×106细胞与1% (w / v)甲醛交联10分钟37°C。细胞被resuspended裂解缓冲包含10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(8.0),MgCl氯化钠10毫米,3毫米2、0.5毫米德勤和蛋白酶抑制剂10分钟在冰上。在4°C离心5分钟后,上层清液被丢弃,小球被温柔的洗反演与10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液,pH值8.0包含15毫米氯化钠,氯化钾和离心5分钟和60毫米在4°C。球被resuspended在洗涤缓冲CaCl补充3毫米2德勤,蛋白酶抑制剂,0.5毫米,5 - 10 μL 1: 200微球菌的核酸酶(新英格兰生物学实验室)和孵化为20分钟37°C和轨道摇晃。核酸酶活性被添加20 μL 0.5毫米EDTA和准备然后在3000转离心5分钟。上层清液被丢弃和丸resuspended缓冲区包含150毫米氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(7.5),5毫米EDTA, NP-40 0.5%, 1% Triton,和0.01% SDS和用近3脉冲,10 s振幅在10%。然后用离心10分钟在10000 rpm在4°C,和上层清液含染色质提取平均大小为500 bp与2 - 4免疫沉淀反应 μg的每个特定抗体/样品。Anti-acetyl组蛋白H3 (Abcam) anti-Nanog (Bethyl)。Anti-Rabbit免疫球蛋白(Abcam)被用来模拟芯片控制。然后,30 μL(阻塞Dynabeads(表达载体,Dynal,奥斯陆,挪威)被用来准备antibody-bead复合物和孵化1 h在4°C下旋转稀释缓冲(Triton x - 100年0.01% SDS, 1.1%, 1.2毫米EDTA, 16.7毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(8.1),167毫米氯化钠)。然后,染色质添加并为1小时在相同条件下孵化。复合物与低盐缓冲液洗一次(Triton x - 100年0.1% SDS, 1%, 2毫米EDTA, 20毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值8.1,150毫米氯化钠),一旦与高盐缓冲(0.1% SDS, 1% Triton x - 100, 2毫米EDTA, 20毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值8.1,500毫米氯化钠),一旦与氯化锂缓冲区(脱氧胆酸盐NP40 0.25氯化锂,1%,1%,1毫米EDTA, 10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0),两次与TE缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0,1毫米EDTA)最后筛选了500 μ包含1% SDS和0.1 NaHCO L的解决方案3。DNA纯化了苯酚:氯仿过程。芯片分析是由真正的time-PCR使用SYBR绿色。启动子入住率百分比是由输入法。

引物如下:

Nanog子F: CCCTAAGCTTTCCCTCCCTCC,

Nanog发起人R: CCAAATCAGCCTATCTGAAGG,

Brachyury发起人NngBSu F: CCAGAGGTTGGCTCCTGGAAA,

Brachyury发起人NngBSu R: GGTGTGGGCAGCAGTTGGTTTATT,

BrachP F: TTGCGGGAGTTCAAGTGGAGC,

BrachP R: CTCTCCACCTTCCAGGAGTCTTGA。

2.6。统计分析

数据表示为均值±扫描电镜显示三个独立的生物复制,除非另有指示。学生的 t 以及使用。的值 P < 。 05年 被接受为显著。

 3所示。结果 3.1。Nanog和Oct4 Reexpressed NO-Induced分化

D3制培养3天有或没有的生活然后暴露于1毫米DETA /不为19小时(第四天)。大量减少Nanog Oct4蛋白质水平观察细胞治疗后DETA /不(图 1(一))。探索的稳定性,差别Nanog和Oct4对这些复苏实验进行。DETA /不治疗后,细胞生长在完全培养基,直到一天6存在与否的生活。结果表明,Nanog和Oct4蛋白质reexpressed DETA /不暴露。在Nanog的情况下,这种现象更明显的生活。类似的反应是观察到D3制表达绿色荧光蛋白(GFP) Oct4启动子的控制下。细胞形成的殖民地与均匀荧光D3细胞培养时的生活(+生活/控制)(图 1 (b)GFP Oct4)。接触DETA /不导致损失的GFP荧光在细胞培养生活(治疗)。也观察到类似的结果细胞培养在生活面前(没有显示)。失去均匀菌落形态也明显在DETA(图/不治疗 1 (b)、治疗Ph C)。异质性GFP信号是明显的复苏后2天的文化完全培养基即使没有生活(6天),4天(8天)(见补充图1在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2014/379678)由于集群GFP阳性细胞与GFP -细胞共存(见PhC形象)。此外,菌落形态是没有恢复。

Reexpression DETA /不暴露后多能性基因。(一)Nanog和Oct4蛋白免疫印迹分析。D3制是生长在(+仍存在或没有(−仍制药业为3天。细胞被培养为表示节 21和2天的额外的时间(每天4和5)。C:控制细胞。T:细胞暴露于1毫米DETA /不了19 h 4天。道5和6是指细胞暴露于DETA /不,随后培养1和2天的部分 2。(b) GFP表达D3-Oct4制。控制细胞培养在生活面前为6天(+生活/控制)。治疗细胞培养在1毫米DETA /不为4天19小时,随后培养示部分 2在没有额外的段2天生活。过去:相衬。结果是代表三个独立的实验。(c)免疫印迹分析揭示了Nanog和Oct4 reexpression DETA /不治疗后。+ /−生活表明,细胞培养4天在生活面前,然后生活被细胞随后被暴露于1毫米DETA /不为19小时。天5和6表明,随后细胞培养1和2天没有生活。−/ +生活表明细胞培养4天没有生活;19小时暴露在1毫米DETA /不被执行的生活。天5和6表明,随后细胞培养1和2天的额外的时间,分别在生活。结果是代表三个独立的实验。

 3.2。Nanog和Oct4 Reexpression是独立的生活

为了探索生活的角色Nanog和Oct4 reexpression DETA /不挑战后,实验仍在进行添加或删除从细胞预处理/没有或生活的存在,分别为3天。结果表明,添加生活媒体没有治疗后没有完全恢复Nanog Oct4蛋白质水平(图 1 (c)−/ +生活条件)。然而,Nanog动力学和Oct4复苏似乎更快在预先处理细胞在生活面前DETA(图/不治疗 1 (c),+ /−生活条件)。因此,生活似乎可有可无的Nanog和Oct4 reexpression,虽然之前接触因素加速过程。

 3.3。组蛋白H3乙酰化参与Nanog Reexpression NO-Induced后分化

先前的报道表明,没有引起染色质重组酶斯卡灵( 25, 27]。因此,我们研究了乙酰化组蛋白水平的变化入住率Nanog启动子(图 2(一个))。染色质免疫沉淀反应研究表明入住率的乙酰化组蛋白H3 Nanog启动子控制细胞培养的生活。显著减少在细胞培养在缺乏生活同样的时间(图 2(一个))。DETA /不治疗导致一个强大和入住率明显降低,在缺乏或存在的生活。入住率是完全恢复2天后DETA /不。这种现象更明显的生活。入住率在Nanog发起人通过乙酰化组蛋白H3相似Nanog reexpression DETA /不治疗后在mRNA(图 2 (b)(图)和蛋白质 1(一))在细胞培养和生活。这一事实没有实质性复苏Nanog mRNA水平观察细胞生长在缺乏生活表明,生活需要信号这种基因的表达。

Nanog reexpression在细胞命运决定分化作为调节器(a)芯片分析显示的乙酰化组蛋白H3入住率相对水平Nanog启动子后没有治疗。(b)实时PCR分析Nanog和(c) Brachyury表达水平之前和之后没有治疗。(d)芯片分析显示Nanog绑定Brachyury启动子后没有治疗。直方图情节代表细胞控制,没有治疗(第四天),和2天后没有治疗(6天)(左栏)存在与否(右栏)的生活,分别。数据均值±SEM从5独立的生物复制。 * 显著差异(+仍未分化的控制条件。

为了研究Nanog在分化细胞的作用,我们分析Brachyury的表达,一个著名的mesendoderm标记Nanog的控制下。Brachyury的一个强大的和重要的表达在细胞生长在缺乏生活与细胞培养相比存在的生活。接触DETA /不导致显著降低Brachyury LIF-deprived细胞中表达。Brachyury镇压更明显2天后DETA(图/不治疗 2 (c))。一直以其作为阻遏,Nanog入住率在细胞培养Brachyury子明显减少−生活条件下,接触DETA /不降低甚至更多(图 2 (d))。入住率恢复控制水平DETA /不治疗2天后细胞生长在生活的存在,这恰逢Brachyury镇压。DETA /不治疗导致明显降低Nanog绑定Brachyury启动子在细胞生长的生活。无意义的上升Brachyury mRNA在这种情况下表明额外的因素是参与这个基因的镇压。增强约束力的Nanog Brachyury发起人伴随着强势镇压DETA /不治疗后的基因(数字 2 (c)和 2 (d))。进一步观察到乙酰化作用的变化模式在Brachyury发起人参与监管的mRNA的表达。有一种强烈的入住率信号在启动子−生活条件根据mRNA的表达。启动子上没有治疗诱发减少占用符合基因表达的显著下降(补充图2),根据H3乙酰化的激活,入住率+ LIFNO Brachyury子也观察到的情况。这音乐会Nanog入住率较低(图 2 (d))可以解释的规定Brachyury表达式。

 3.4。分化细胞群表达明确的内胚层标记除了Nanog Reexpression

为了评估Nanog的影响和Oct4 reexpression分化过程,明确的表达内胚层(DE)标记分析了在定义协议一代的细胞。图 3(一个)Nanog和增加差别显示了非凡的对这些Pdx1表达式在制DETA /不治疗。此外,分化细胞种群reexpress Nanog和增加表达DE Gata4和Sox17(图等因素 3(一个))1和2天后没有治疗。然而Pdx1表达水平,减少没有治疗后(图 3(一个))。评估的相关性Oct4 reexpression upregulation DE标记,制线表达GFP Oct4启动子的控制下使用。分化后,排序GFP阳性和GFP -细胞Nanog表达式的分析,Oct4、不同的内胚层标记(图 3 (b))。Oct4 Nanog和差别没有治疗诱发对这些upregulation内胚层的标记Gata4 FoxA2,趋化因子受体Cxcr4和Pdx1 GFP -细胞和残余GFP阳性细胞(图 3 (b)上和左下图)。只有两天之后暴露在区分刺激,GFP阳性和阴性细胞移植Gata4, FoxA2 Hnf1 βSox17,明显高于水平GFP -细胞群(图 3 (b),上下右图表)。此外,为了帮助理解分化期,中胚层标记Flk1和Mef2c被定量实时PCR分析。在生活面前暴露后这两个标记的表达减少DETA /不,和移植后2天。另一方面,缺乏生活治疗诱发Flk1表达和维护增加2天;然而,Mef2c后也会增加其表达不但是增加不是持续6天(图 3 (c))。

Nanog在分化细胞中表达。(一)免疫印迹分析显示内胚层标记和Nanog reexpression后没有治疗。墨迹是代表三个独立的实验。C:控制细胞培养4天的生活;T:细胞培养与生活3天然后暴露于1毫米DETA /不了19 h。天5和6指DETA /不治疗细胞培养在缺乏生活的额外时间1 - 2天。(b)两Oct4内胚层标记表达积极的和消极的细胞群 在体外分化。实时PCR分析表达多能(Oct4和Nanog)和内胚层(Gata4 FoxA2,趋化因子受体Cxcr4、Pdx1 Sox17)标记控制(未分化细胞增长了4天的生活),治疗和DE分化GFP阳性和GFP -细胞。D3-Oct4细胞生长、分化和排序GFP表达根据协议中描述的部分 2。控制细胞显示细胞增长了4天的生活;NO-treated细胞显示细胞维持3天没有生活和治疗19 h 1毫米DETA /不。去分化细胞表明细胞在治疗后2天没有生活。 * 从GFP的显著差异+; * * 从控制条件明显不同。(c)定量实时PCR中胚层的谱系标记表示之前和之后DETA /不治疗。

测试的可能性的存在具备干细胞基因分化细胞数量的确可能归因于细胞逃避分化过程,共焦显微镜在细胞诱导分化成免疫荧光分析德。Nanog表达式从0.65%增加(数据未显示)NO-treated细胞分化细胞的54%人口(数据计算图 4(一)比Nanog +和Dapi)。结果表明,Nanog是不同类地表达去分化细胞(图 4(一)),而且大多数Nanog阳性细胞也coexpressed Gata4和FoxA2(75.4%和96.2%,分别地。),与细胞只表达Nanog不超过7%(数据 4(一)和 4 (b))。

Nanog colocalizes Gata4和FoxA2的内胚层细胞。根据协议中描述的部分细胞分化 2和共聚焦免疫荧光分析(一),Nanog Gata4, FoxA2分化的第八天。(b)分析显示细胞的百分比coexpressing Nanog-Gata4和Nanog-FoxA2 D3细胞分化。数据均值±ESM从7号到9号字段。

 4所示。讨论

如Nanog和Oct4基因的作用在编排ESC的多能性状态。在分化状态仍然是其潜在的作用,然而,完全验证 8- - - - - - 10]。之前的研究表明,Nanog在制会使瞬变均匀条件下培养的生活( 8- - - - - - 10]。Nanog的表达水平的波动也描述的胚胎细胞内在质量和在发展中胚胎生殖细胞( 9]。虽然制的多能性状态 在体外由Nanog依赖的方式生活,小的信息可以在瞬时表达的机制参与控制( 1]。我们这里,Nanog是LIF-independent差别reexpression NO-induced后对这些。有趣的是,之前在存在的文化生活为4天允许Nanog实质性复苏和10月4(+ /−生活条件)与细胞培养相比缺乏生活(−/ +生活条件)(图 1 (c));因此reexpression更高效的细胞中预先处理之前的生活。总之,使用生活reexpression实验表明,尽管Nanog和10月4 reexpression后没有挑战不需要生活,以前接触这个因素是仪器的响应,从而表明LIF-dependent因素稳定多能性网络。

否则,没有治疗后Nanog强烈表达下调的蛋白和转录水平的存在和缺乏生活。然而,在生活面前,没有治疗2天后,Nanog转录水平的蛋白质水平比预期的要高得多。这种现象使我们认为Nanog表观遗传背景不同取决于生活存在与否与DETA-NO药理治疗期间。此外,强大的入住率的乙酰化组蛋白H3 Nanog子没有治疗后观察2天的存在和没有生活,从而为多能性基因的激活。全球表观遗传变化也发生在NO-induced分化和维护这些表观遗传修饰后撤军的区分因素 23]。另一方面,瞬态抑制Nanog治疗后制与组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA (Trichostatin)据报道与脱乙酰作用有关的Nanog启动子区域和分化的开始( 29日]。我们报告在这里提高入住率的乙酰化组蛋白H3 Nanog启动子两天后撤军的区分刺激。这种现象更明显在生活面前,重合,并有很强的Nanog复活。这些数据表明,特定的染色质的表观遗传修饰后不做细调节 在体外Nanog复活。

基因调控的场景在这里提出公司的差异化不治疗会通过破坏mesendoderm过渡的沉默Brachyury和不断上升的表达中胚层和内胚层标记。据报道,Brachyury监管是由组蛋白乙酰化作用在其启动子( 30.),支持我们的数据没有治疗诱发的变化H3乙酰化的入住率,增加生活的存在和减少在缺乏生活;这一行动建议是互补的减少Nanog的镇压行动。这种效应的基因调控Brachyury表明没有治疗的选择性活动分化转向中胚层和内胚层血统。血统的规范承诺后Nanog是差别和Oct4对这些有争议的问题。先前的报道表明对原始内胚层分化( 8, 31日和中胚层 27]。此外,Nanog空细胞完全不区分为原始内胚层,显示multilineage分化能力( 9]。评估分化细胞的分化能力和承诺在我们的实验设计,在内胚层的基因的表达,我们分析了Brachyury和中胚层的基因的表达Flk1 Mef2c。没有治疗导致大量和持续减少Brachyury和增强表达的内胚层标记Pdx1 Gata4, Sox17,反映出这样一个内胚层选择性的过程,虽然upregulation Flk1和Mef2c也明显的暗示中胚层谱系的一代。事实上,全球表观遗传背景不同的之前和之后没有治疗,创建一个区分场景后,没有刺激的差别与瞬态对这些Nanog和中断mesendodermal过渡。这个概念已经得到研究与人类的ESCs的支持和与不同的协议。事实上,从谎言et al。(以前的研究 32)观察到Nanog ESCs抑制人类造成upregulation DE基因和有效的胰腺癌内胚层分化,确认我们的观察。然而,Nanog [ 15]和Oct4 [ 12, 13)表达在德祖细胞分化与激活素A,加强我们的观察使用不作为区分代理。此外,据报道,药理的封锁苯丙酸诺龙/节点信号通路在DE分化阻止人类的ESCs的适当的承诺内胚层的血统( 14]。Jaremko Marikawa显示,减少Oct4和Nanog表达水平后2天的节点/激活素信号抑制。然而,Nanog成绩单后被重新激活激活素之外。事实上,Oct4和Nanog记录的水平没有下降在DE分化的前6天在文化 14),像我们这里描述相似的结果。DE分化在我们的模型中,我们选择Oct4 reexpressing细胞(GFP阳性)和分析他们的表达内胚层标记。两GFP阳性和阴性细胞数量增加Gata4的表达,FoxA2, Sox17在分化。GFP-negative DE标记的细胞群有较高水平的表达,根据其分化形态。没有治疗后在生活饥饿条件下,一些细胞(约占总数的3%)仍在蛋白质水平表达绿色荧光蛋白,但这不是重要的转录水平的变化有关Nanog GFP阳性和阴性细胞之间。然而,两天后没有治疗Nanog成绩单略低GFP -人口与GFP阳性细胞在DE-cell人口。这种现象可以归因于不同的GFP-protein和Nanog-transcript半衰期比率。Nanog和Oct4没有治疗后reexpressed不均匀,Nanog coexpresses Gata4和FoxA2细胞提供支持的概念,这里所使用的协议生成终末分化细胞。

总之,这里的数据报告表明,多能性因素扮演更多的角色控制多能性的机械。事实上,Oct4双重角色的工作与Sox2维持多能性和Sox17促进内胚层的谱系分化( 30.]。在我们的例子中,环境扰动引起的高水平的染色质和表观遗传差别没有激起Nanog和Oct4对这些修改,构成一个后续分化(参见图的机会 5)。然而,异构reexpression Nanog或Oct4 DE分化并不是一个障碍,但公司的固有财产。这种机制可能是一个进化选择策略应对和适应的显著变化的外部环境和一代的新祖细胞分化。事实上,在胚泡植入,诱导没有合酶(间接宾语)水平显著增加啮齿动物的子宫组织( 33]。这一现象与瞬态Nanog在新胚泡植入的下降 4, 34]。随后,Nanog是reexpressed外胚层细胞( 35),模拟方案中描述这个工作。因此,一个期望的相关性没有信号作为一种新的生物系统调节胚胎干细胞的多能性,为再生医学的发展新战略。

干细胞分化的模型。在ES细胞分化,Nanog Oct4表达下调和新生的表观遗传修饰发生。在这一点上,一氧化氮多能性的差别可以参与瞬态对这些网络和染色质重塑事件。然而,Nanog可以在瞬态reexpressed分化的体细胞。,波动水平Nanog Oct4构成一个“机会”,承诺通过特定的谱系分化。一氧化氮参与这个扰动,但需要进一步的内在或环境刺激决定正确的承诺。

 5。结论

一氧化氮已被用来作为区别在两个老鼠和人类的ESCs的代理。这个过程包括主基因的差别瞬态对这些Nanog和Oct4等多能性。本文表明,Nanog reexpression NO-induced分化后涉及到表观遗传变化对Nanog启动子。招聘的Nanog Brachyury启动子块的复活mesendodermal标记。明确的内胚层分化细胞coexpress内胚层标记和Nanog和中胚层的基因的表达也明显。因此建议reexpression Nanog和Oct4扮演了一个角色在对特定的细胞谱系分化。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

这项工作是由Consejeria de Igualdad祝您健康y政治优势种,军政府的安达卢西亚(PI0022/2008、PI105/2010 PI10/00964), Consejeria de隐藏Innovacion Ciencia y Empleo,军政府的安达卢西亚(CTS-7127/2011 P10.CTS。6505年,和PAI BIO-311), Instituto de Salud Carlos III/FEDER (Red TerCel, RD06/0010/0025, RD12/0019/0028), Ministerio de Economía y Competitividad (IPT-2011-1615-900000), Ministerio de Salud y Consumo (TRA-120), and Servicio Andaluz de Salud (SAS 11245).

 史密斯 a·G。 希斯 j·K。 唐纳森 D D。 黄 G·G。 男人 J。 斯特尔 M。 罗杰斯 D。 多能胚胎干细胞分化的抑制纯化多肽 自然 1988年 336年 6200年 688年 690年 10.1038 / 336688 a0 2 - s2.0 - 0024245022 羽 H。 多能性是如何确定和维护? 发展 2007年 134年 4 635年 646年 10.1242 / dev.02787 2 - s2.0 - 33947308285 三井 K。 Tokuzawa Y。 伊藤 H。 Segawa K。 村上 M。 高桥 K。 Maruyama M。 Maeda M。 实验: 年代。 维护所需的homeoprotein nanog是鼠标外胚层和胚胎干细胞的多能性 细胞 2003年 113年 5 631年 642年 10.1016 / s0092 - 8674 (03) 00393 - 3 2 - s2.0 - 0037806031 钱伯斯 我。 科尔比 D。 罗伯逊 M。 尼克尔斯 J。 李 年代。 Tweedie 年代。 史密斯 一个。 Nanog功能性表达克隆,胚胎干细胞的多能性维持因素 细胞 2003年 113年 5 643年 655年 10.1016 / s0092 - 8674 (03) 00392 - 1 2 - s2.0 - 0038143611 羽 H。 宫崎骏 j . I。 史密斯 a·G。 定量的表达Oct-3/4定义分化,ES细胞的去分化和自我更新 自然遗传学 2000年 24 4 372年 376年 10.1038/74199 2 - s2.0 - 0034028901 Dejosez M。 Krumenacker j·S。 Zitur l . J。 Passeri M。 楚 L.-F。 Songyang Z。 汤姆森 j . A。 Zwaka t P。 浪人是至关重要的胚胎发生和小鼠胚胎干细胞的多能性 细胞 2008年 133年 7 1162年 1174年 10.1016 / j.cell.2008.05.047 2 - s2.0 - 45449093213 Masui 年代。 Nakatake Y。 这个 Y。 Shimosato D。 八木天线 R。 高桥 K。 Okochi H。 奥田硕 一个。 Matoba R。 Sharov 答:一个。 Ko m . s . H。 羽 H。 多能性由 Sox2通过调节 Oct3/ 4表达式在小鼠胚胎干细胞 自然细胞生物学 2007年 9 6 625年 635年 10.1038 / ncb1589 2 - s2.0 - 34249876564 辛格 a . M。 Hamazaki T。 Hankowski k . E。 田农 N。 异构Nanog在胚胎干细胞的表达模式 干细胞 2007年 25 10 2534年 2542年 10.1634 / stemcells.2007 - 0126 2 - s2.0 - 35348816062 钱伯斯 我。 席尔瓦 J。 科尔比 D。 尼克尔斯 J。 Nijmeijer B。 罗伯逊 M。 Vrana J。 琼斯 K。 Grotewold l 史密斯 一个。 Nanog保障多能性和调节生殖系的发展 自然 2007年 450年 7173年 1230年 1234年 10.1038 / nature06403 2 - s2.0 - 37549002155 卡马尔 T。 Lim C。 海沃德 P。 Munoz-Descalzo 年代。 尼克尔斯 J。 Garcia-Ojalvo J。 阿里亚斯 a . M。 调节波动Nanog在胚胎干细胞表达调节细胞命运决定 公共科学图书馆生物学 2009年 7 7 e1000149 10.1371 / journal.pbio.1000149 2 - s2.0 - 68049139696 谷 l Mendjan 年代。 布朗 年代。 京 Z。 张志贤 一个。 史密瑟斯 l E。 快步走的人 m . w . B。 赵 C.-H.-H。 马丁内斯 一个。 Rugg-Gunn P。 Brons G。 需要好好 r。 苯丙酸诺龙/节点信号维持多能性通过控制Nanog表达式 发展 2009年 136年 8 1339年 1349年 10.1242 / dev.033951 2 - s2.0 - 67650096520 似幻 k。 爆炸 a·G。 Eliazer 年代。 凯利 o . G。 Agulnick 答:D。 聪明的 n G。 摩尔人 m·A。 克朗 E。 卡彭特 m·K。 Baetge E·E。 胰腺内分泌细胞hormone-expressing生产人类胚胎干细胞 自然生物技术 2006年 24 11 1392年 1401年 10.1038 / nbt1259 2 - s2.0 - 33750846133 持斧罗摩 N。 纳米亚斯 Y。 赵 c . H。 凡调查 D。 直到 答:W。 Berthiaume F。 Yarmush m . L。 苯丙酸诺龙改变内胚层的动力学诱导胚胎干细胞培养上胶原蛋白凝胶 干细胞 2008年 26 2 474年 484年 10.1634 / stemcells.2007 - 0303 2 - s2.0 - 41049100546 Jaremko k . L。 Marikawa Y。 监管的发展能力和承诺对内胚层血统的人类胚胎干细胞 干细胞研究 2013年 10 3 489年 502年 10.1016 / j.scr.2012.04.002 2 - s2.0 - 84875820898 Hashemi-Tabar M。 Orazizadeh M。 Ghanbari 一个。 Dehbashi f . N。 基因表达在接触动力学老鼠干细胞激活素a 巴基斯坦生物科学杂志》上 2009年 12 4 324年 331年 10.3923 / pjbs.2009.324.331 2 - s2.0 - 67049087874 Azuara V。 佩里 P。 萨奥尔 年代。 Spivakov M。 Jørgensen h·F。 约翰 r·M。 Gouti M。 卡萨诺瓦 M。 警告 G。 Merkenschlager M。 费雪 a·G。 多能细胞的染色质特征线 自然细胞生物学 2006年 8 5 532年 538年 10.1038 / ncb1403 2 - s2.0 - 33646872978 Bilodeau 年代。 Kagey m . H。 弗兰普顿 g . M。 Rahl p . B。 年轻的 r。 SetDB1有助于抑制基因编码的发展,监管者和维护ES细胞的状态 基因和发展 2009年 23 21 2484年 2489年 10.1101 / gad.1837309 2 - s2.0 - 70350686180 Golob j·L。 佩奇 s . L。 Muskheli V。 Pabon l 聪聪 c, E。 染色质重塑在老鼠和人类胚胎干细胞分化 发展动态 2008年 237年 5 1389年 1398年 10.1002 / dvdy.21545 2 - s2.0 - 43449091572 Zipori D。 干细胞的性质:国家而不是实体 自然遗传学评论 2004年 5 11 873年 878年 10.1038 / nrg1475 2 - s2.0 - 7644243641 仙谷由人 K。 佐藤 N。 Horikawa M。 土屋 K。 小森 H。 Sharifa D。 Tamate K。 石川 M。 要求一氧化氮对小鼠卵母细胞成熟、胚胎发育 分子繁殖和发展 2001年 58 3 262年 268年 郭 r . C。 巴克斯特 g . T。 汤普森 s . H。 斯特里克 美国一个。 巴顿 C。 兰西 J。 Epel D。 没有必要和足够在受精卵子激活 自然 2000年 406年 6796年 633年 636年 10.1038 / 35020577 2 - s2.0 - 0034632895 圆凿 r . C。 ·马什本 P。 戈登 b E。 Nunley W。 Huet-Hudson y . M。 一氧化氮作为管理者的胚胎发育 生物的繁殖 1998年 58 4 875年 879年 10.1095 / biolreprod58.4.875 2 - s2.0 - 0031943733 Mora-Castilla 年代。 Tejedo j . R。 Hmadcha 一个。 Cahuana g . M。 马丁 F。 的索里亚 B。 Bedoya f·J。 一氧化氮镇压Nanog促进小鼠胚胎干细胞分化 细胞死亡和分化 2010年 17 6 1025年 1033年 10.1038 / cdd.2009.204 2 - s2.0 - 77952238024 菅野 年代。 金 p . k . M。 Sallam K。 Lei J。 Billiar t·R。 剪切机 L . L。 二世 一氧化氮促进cardiomyogenesis在老鼠胚胎干细胞 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2004年 101年 33 12277年 12281年 10.1073 / pnas.0401557101 2 - s2.0 - 4344647981 Mujoo K。 Sharin 诉G。 布莱恩 n S。 Krumenacker j·S。 斯隆管理学院 C。 Parveen 年代。 Nikonoff l E。 科特 a . Y。 Murad F。 一氧化氮信号组件在胚胎干细胞向心肌细胞的分化 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 2008年 105年 48 18924年 18929年 10.1073 / pnas.0810230105 2 - s2.0 - 57749107735 尚 E。 Severi 年代。 Contestabile 一个。 Bartesaghi R。 一氧化氮负调节增殖,促进神经元分化。差别通过N-Myc对这些 《细胞科学 2004年 117年,部分20 4727年 4737年 10.1242 / jcs.01348 2 - s2.0 - 7244261880 Spallotta F。 Rosati J。 Straino 年代。 Nanni 年代。 Grasselli 一个。 Ambrosino V。 Rotili D。 瓦伦特 年代。 Farsetti 一个。 梅 一个。 Capogrossi m . C。 盖太诺 C。 Illi B。 一氧化氮决定mesodermic小鼠胚胎干细胞的分化激活类活动花絮组蛋白去乙酰酶抑制剂:潜在治疗下肢缺血的小鼠模型的影响 干细胞 2010年 28 3 431年 442年 10.1002 / stem.300 2 - s2.0 - 77950581254 Ensenat-Waser R。 桑塔纳 一个。 Vicente-Salar N。 Cigudosa j . C。 罗氏公司 E。 的索里亚 B。 Reig j . A。 隔离和表征残余的未分化的老鼠胚胎干细胞来自胚状体的身体文化通过荧光跟踪 体外细胞和发育Biology-Animal 2006年 42 5 - 6 115年 123年 10.1290/0509063.1 2 - s2.0 - 33750628012 Karantzali E。 舒尔茨 H。 无角的 O。 大 N。 Hatzopoulos 答:K。 Kretsovali 一个。 组蛋白脱乙酰酶抑制加速干细胞分化的早期事件:转录组和表观遗传分析 基因组生物学 2008年 9 4、文章R65 10.1186 / gb - 2008 - 9 - 4 - r65 2 - s2.0 - 47149108349 假摔 年代。 Abboud N。 Desilets 年代。 Nury D。 考恩 C。 Puceat M。 相互作用的Oct4 Sox2 Sox17:从干细胞多能性分子开关指定一个心脏的命运 细胞生物学杂志 2009年 186年 5 665年 673年 10.1083 / jcb.200901040 2 - s2.0 - 69949118280 Hamazaki T。 奥卡河 M。 实验: 年代。 田农 N。 聚合胚胎干细胞的诱导Nanog压迫和原始内胚层分化 《细胞科学 2004年 117年,部分23 5681年 5686年 10.1242 / jcs.01489 2 - s2.0 - 10944241060 谎言 k . H。 第一个 b E。 Sidhu k . S。 抑制NANOG诱发有效的胰腺癌内胚层分化人类胚胎干细胞 胰腺 2012年 41 1 54 64年 10.1097 / MPA.0b013e31822362e4 2 - s2.0 - 84655170030 珀塞尔 t . L。 鉴于 R。 Chwalisz K。 加菲尔德 r·E。 一氧化氮合酶分布在植入老鼠 人类生殖的分子 1999年 5 5 467年 475年 10.1093 / molehr / 5.5.467 2 - s2.0 - 0032928934 席尔瓦 J。 尼克尔斯 J。 图尼森 t·W。 郭 G。 范Oosten a . L。 Barrandon O。 雷 J。 实验: 年代。 钱伯斯 我。 史密斯 一个。 Nanog是通往多能基态 细胞 2009年 138年 4 722年 737年 10.1016 / j.cell.2009.07.039 2 - s2.0 - 68749110887 哈特 a . H。 哈特利 l 易卜拉欣 M。 罗伯 l 多能性鉴定、克隆和表达分析促进Nanog在老鼠和人类的基因 发展动态 2004年 230年 1 187年 198年 10.1002 / dvdy.20034 2 - s2.0 - 2142821474