SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2014/125683 125683年 研究文章 纤维母细胞生长因子18增加营养骨髓间充质干细胞对软骨细胞的影响独立于晚期骨关节炎的患者 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6816 - 507 x 张 宇 1 王 严 2 李 Mingchao 1 李 Jiaping 1 吴 剑 1 谢霆锋 Hung-Fat 1 整形外科学系 哈尔滨医科大学第一附属医院 23你郑街,150001年哈尔滨南岗区区 中国 hrbmu.edu.cn 2 显微手术手 海南省人民医院 海口570100 中国 2014年 3 12 2014年 2014年 14 08年 2014年 05年 11 2014年 06 11 2014年 3 12 2014年 2014年 版权©2014 (Zhang et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Coculture软骨间充质干细胞与软骨细胞增加生产的矩阵。软骨细胞与后期骨关节炎的患者通常失去了生产软骨基质的表型。纤维母细胞生长因子18被认为redifferentiate OA软骨细胞向软骨细胞功能活跃。本研究的目的是探讨支持msc对OA软骨细胞的影响和测试如果FGF18能提高OA软骨细胞的响应msc在coculture系统的支持。颗粒和transwell培养。GAG量化、羟脯氨酸测定和qPCR进行。软骨形成的异位模型也被应用。我们的数据表明,在球团coculture msc和OA软骨细胞矩阵生产增加FGF18的存在,比较单一的软骨细胞。结果transwell coculture研究表明矩阵产生基因的表达在OA软骨细胞增加cocultured与msc FGF18培养基,而肥厚性基因被coculture没有改变。最后,coimplantation msc与OA软骨细胞产生更多的矩阵只比软骨细胞。 In conclusion, FGF18 can restore the responsiveness of OA chondrocytes to the trophic effects of MSCs. Coimplantation of MSCs and OA chondrocytes treated with FGF18 may be a good alternative cell source for regenerating cartilage tissue that is degraded during OA pathological changes.

 1。介绍

骨关节炎(OA)是最常见的关节退行性疾病。OA的症状包括一组机械异常,这反映了关节软骨的退化和相应的软骨下骨( 1]。OA患者通常经历疼痛、压痛、刚度、锁定和/或关节积液。很多因素包括遗传、发育环境,新陈代谢,和机械损伤是导致软骨开始退化。一旦开始,软骨组织将变得越来越薄;关节骨表面将受到保护和缓冲越来越少。然后软骨下骨可能受损。作为最常见的关节炎,OA减少成千上万的病人的生命体验在美国和全球更多的( 2- - - - - - 4]。目前的治疗主要延迟其进展。大多数OA患者最终将不得不做关节手术。

纤维母细胞生长因子18 (FGF18)被确定为新成员的纤维母细胞生长因子(FGF)家族在1990年代末 5]。基因编码的蛋白质是映射到5号染色体q34 [ 6]。Fgf18,连同 Fgf8和 Fgf17,通常被视为fgf的一个亚科。在开发期间,内生Fgf18已知发挥重要作用在骨骼的生长的畸形caldaria缝合和生长板的老鼠缺乏Fgf18 [ 7, 8]。除了刺激生长板软骨细胞增殖和分化的影响( 9),Fgf18据报道是一个在关节软骨(软骨细胞合成代谢因素 10]。它也被报道,FGF18可能加快II型胶原合成和生物合成细胞外基质沉积的软骨细胞 11]。根据这些报告以及rhFGF18阻止软骨变性的事实,注入大鼠关节炎模型、FGF18认为保护关节软骨关节内的损伤( 12]。此外,有利影响FGF18也被显示在修复受损的老鼠研究创伤性骨关节炎软骨,由摩尔et al。 13]。

营养影响的间充质干细胞(msc)通常被定义为一个观察msc帮助其他细胞生存,繁殖,并产生细胞外基质通过产生分泌到邻近的环境因素( 14]。相信msc在许多组织可能发挥营养作用。msc可以改善神经系统的功能被注入抚摸着老鼠的大脑 15]。没有观察到msc分化成神经元或其他神经细胞的研究。同样,msc可以刺激心肌细胞增殖和血管再生没有分化成组织细胞,两者兼而有之 在体外和 在活的有机体内( 16, 17]。最近,msc,暴露出软骨再生的营养效应在coculture系统( 18, 19]。msc显示增加细胞外基质形成和软骨细胞的增殖。与此同时,msc加班在coculture软骨细胞死亡。此外,营养效果是一般现象观察的msc在不同培养基培养和msc从不同组织分离 20., 21]。替换部分软骨细胞的msc可以显著减少的数量需要构建组织工程软骨细胞结构(TE构造)的软骨。

在这项研究中,我们假设FGF18可以提高MSC当cocultured与软骨细胞的营养效应来源于晚期OA患者。颗粒和transwell coculture系统被用来研究msc和软骨细胞之间的相互作用。软骨再生的异位模型应用于测试FGF18的影响 在活的有机体内。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养和扩大

人类使用的材料在这个研究已通过当地的哈尔滨医科大学医学伦理委员会。严重受损的软骨组织从臀部活检获得的结束阶段骨关节炎患者接受全髋关节置换术。软骨细胞分离与以前公布的协议( 22]。短暂、软骨从潜在的骨骼和结缔组织和解剖在胶原酶消化- h II型沃辛顿(0.15%)在DMEM补充青霉素(100 U /毫升)和链霉素(100毫克/毫升)。主要在软骨细胞增殖培养基培养软骨细胞被(DMEM补充10%的边后卫,1×不必要的氨基酸,抗坏血酸2-phosphate 0.2毫米,0.4毫米脯氨酸,100 U /毫升青霉素,和100年 μg / mL链霉素)。骨髓活检获得来自同一病人全髋关节置换术。间充质干细胞(msc)来源于骨髓像前面描述的那样 23]。总骨髓镀在50 000个细胞的密度/厘米2在MSC增殖培养基的培养瓶( αmem,补充10%胎牛血清,1%谷酰胺,0.2毫米抗坏血酸,100 U /毫升青霉素,10 μ1 g / mL链霉素,ng / mL bFGF) + 1%肝素。刷新每3 - 4天直到融合媒介。三对捐赠者被用于这项研究。一对意味着同一捐献者的细胞类型。所有试剂用于细胞培养都从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。常见的化学物质从Sigma-Aldrich购买。

 2.2。Coculture msc和软骨细胞的颗粒或Transwell

颗粒coculture 100 000软骨细胞和100 000 MSC(比1:1)被播种在一个圆底的超低附件96孔板在无血清培养基有或没有FGF18 (10 ng / mL)和离心机在500×g为3分钟。无血清培养基包含DMEM + 1×不必要的氨基酸,抗坏血酸2-phosphate 0.2毫米,0.4毫米脯氨酸,100 U /毫升青霉素,100 μ克/毫升链霉素。媒介是每周更新两次。单一颗粒的软骨细胞与200 000细胞是相同的方式。

对于transwell coculture 100 000软骨细胞被播种在一个Millicell细胞培养插入(0.45 μm PCF, 12毫米直径)由默克密理博(Tullagreen,爱尔兰)。细胞培养然后插入被一个24-well板的100 000 msc被播种。无血清培养基有或没有FGF18使用(10 ng / mL)。为单一transwells 100 000软骨细胞在细胞培养中被播种24-well板插入和一口井,分别。这是见图 2(一个)。

 2.3。组织学

细胞颗粒或TE构造与10%福尔马林固定过夜并使用常规程序嵌入到石蜡。部分4 μ米被削减和彩色硫酸粘多糖(GAG)与甲苯胺蓝或红色染料O。

 2.4。定量呕吐和DNA分析

细胞球洗了PBS和冷冻过夜−20°C。随后,他们在500年被消化 μL消化缓冲区1毫克/毫升蛋白酶K三羟甲基氨基甲烷/ EDTA缓冲液(pH7.6) > 16 h 56°C。粘多糖(GAG)内容spectrophotometrically决定,9-dimethylmethylene蓝色氯(DMMB)染色在PBE缓冲区(14.2 g / L Na2HPO4和3.72 g / L Na2EDTA, pH值6.5)使用ELISA读者(TECAN、Grodig、奥地利)的吸光度与硫酸软骨素作为标准520海里。总DNA的细胞数量是由量化使用CyQuant DNA工具包(分子探针,尤金,或者),根据制造商的指示。

三球的每一对捐赠用于呕吐和DNA分析技术的变化。

 2.5。羟脯氨酸测定

胶原蛋白聚合内容评估羟脯氨酸测定,使用先前描述的方法( 24]。短暂,细胞聚集在木瓜蛋白酶消化缓冲区(0.5毫克/毫升的木瓜蛋白酶溶解在0.1 Na2HPO4盐酸提取l -半胱氨酸,EDTA 5毫米,5毫米)。盐酸水解消化溶质在6 N一夜之间在110°C。羟脯氨酸是化验spectrophotometrically在560 nm和0.05反应后的chloramine-T和10% (w / v 2-methoxyethanol) ρ-dimethylaminobenzaldehyde。一个标准曲线生成L-hydroxyproline计算羟脯氨酸浓度。

 2.6。坳二酶联免疫吸附试验(ELISA)

细胞颗粒和TE构造在混合酶消化含0.5毫克/毫升的透明质酸酶和0.25毫克/毫升的胃蛋白酶超过16个小时。定量分析坳二世沉积在细胞颗粒以及TE构造当时进行了使用酶联免疫试剂盒购自Chondrex Inc . (Redmond,佤邦)制造商的协议。

 2.7。RNA分离和定量PCR

软骨细胞总RNA样本播种与QIAamp DNA在细胞培养中插入被孤立的迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。一微克的总RNA reverse-transcribed进cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad大力神,CA)。qPCR进行互补脱氧核糖核酸样品用智商SYBR绿色Supermix (Bio-Rad大力神,CA)。进行PCR反应是MyiQ2双色实时PCR检测系统(Bio-Rad大力神,CA)在下列条件:互补脱氧核糖核酸是预热15分钟在96°C,变性5分钟在95°C,和紧随其后的是45周期,由15 s在95°C, 15 s 60°C, 30年代在一个周期72°C。为每个反应生成融化曲线测试形成引物二聚体和非特异性启动。实时PCR引物的补充表1中列出网上(见补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2014/125683)。执行计算的相对表达与Bio-Rad iQ5光学系统软件(版本2.0)使用双三角洲Ct方法( 25]。GAPDH是用于规范化。

 2.8。异位形成软骨藻酸盐凝胶植入裸小鼠

msc和软骨细胞混合比例为1:1然后resuspended 2%海藻酸在PBS 1×10的密度7细胞/毫升。结构是由转移100人 μL 100毫米CaCl海藻酸细胞悬液2解决方案和gelifying 5分钟37°C。构造与PBS然后DMEM洗。构造与软骨细胞只担任控制。结构是无血清培养系统在有或没有FGF18 (10 ng / mL)被植入裸鼠皮下注射前2周。为每个条件4构造是由代表技术变化。在手术之前,十二6雄性BALB / C裸小鼠(哈尔滨医科大学动物中心)进行麻醉。然后,四个皮下口袋里的一只老鼠。构建在一个口袋里。构造的位置是随机的,记录下来。移植8周后,小鼠牺牲和植入结构然后仔细分开周围纤维囊和清洗在PBS组织学分析和定量GAG分析。

 2.9。统计分析

所有统计分析是由使用学生的 t 以及对配对样本。 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。Coculture msc和OA软骨细胞增加矩阵生产FGF18的存在

4周后聚合,细胞颗粒单作和coculture收获的组织学检查,呕吐化验,胶原蛋白量化。如图 1(一),没有呕吐存入细胞外基质颗粒没有FGF18采用无血清培养技术。这并不奇怪,因为软骨细胞分离结束阶段OA患者已经失去了产生软骨基质的能力。有或没有msc的支持,他们无法放下矩阵富含呕吐和胶原蛋白。FGF18刺激后,这些OA软骨细胞迅速恢复机械矩阵合成和沉积丰富的插科打诨的颗粒(图 1 (b))。在再分化过程的基础上,msc可以进一步促进呕吐合成软骨细胞由于其营养效果。定量测量的插科打诨和总胶原蛋白组织学染色(数据证实了我们的印象 1 (c)和 1 (d))。没有FGF18在中1 μg的DNA是大致相当于2 μ克呕吐和1 μg羟脯氨酸。和单作和coculture颗粒之间没有区别。一旦FGF18添加到媒体,增加三到四倍是呕吐和胶原蛋白量化。更重要的是,插科打诨coculture球团矿生产的显著超过单一颗粒。同样的趋势在胶原蛋白量化。由于羟脯氨酸测定不能区分具体软骨胶原蛋白II型(COL II)从其他胶原蛋白,ELISA进行量化坳二世在细胞颗粒的数量。FGF18刺激后,单作和coculture颗粒沉积坳二世的3 - 4倍的矩阵。正如所料,coculture颗粒包含更多坳比单作丸(图二 1 (e))。这表明营养msc的影响可能会增加矩阵OA软骨细胞的再分化形成软骨细胞由FGF1刺激。

Coculture msc和OA软骨细胞增加呕吐形成和胶原蛋白的生物合成与FGF18的存在。(a)甲苯胺蓝染色进行4周后聚合在培养基培养没有FGF18检测笑料。比例尺= 100 μm。(b)甲苯胺蓝染色进行4周后聚合中培养介质包含FGF18检测笑料。比例尺= 100 μm。(c)呕吐试验进行了量化GAG沉积在细胞颗粒( n = 3 )在4周后聚合。总笑话( μ总DNA (g)被归一化 μg),误差棒反映了标准偏差。 P 与学生的计算值 t 以及。(d)羟脯氨酸测定进行了测量总胶原蛋白含量( n = 3 )。总胶原蛋白( μ总DNA (g)是归一化 μg),误差棒反映了标准偏差。 P 与学生的计算值 t 以及。(e)坳二世的沉积颗粒由ELISA测定( n = 3 )。坳二内容被归一化总DNA。 P 与学生的计算值 t 以及。

GAG化验

胶原蛋白测定

坳二世ELISA

chondrogenic基因的表达是衡量qPCR transwells OA软骨细胞培养。(一)图显示了如何执行单一或coculture transwell系统。(b) chondrogenic基因的表达没有FGF18在transwells软骨细胞培养介质。Beta-actin用于规范化。单一文化被选为参考。数量在coculture代表相应基因的相对表达水平比较单一。三对供体进行了分析。NS: nonsignificance。(c) chondrogenic基因的表达在transwells软骨细胞培养介质包含FGF18 (10 ng / mL)。Beta-actin用于规范化。 Monoculture was chosen as reference. Number in coculture represents the relative expression level of corresponding gene comparing to monoculture. Three donor pairs were analyzed. P 与学生的计算值 t 以及。

 3.2。Transwell Coculture增加矩阵产生基因的表达在OA软骨细胞FGF18的存在

指定msc对软骨细胞的影响与FGF18的存在,一个transwell coculture系统使用(图 2(一个))。实时PCR进行量化chondrogenic基因在软骨细胞的表达。没有FGF18介质,与MSC coculturing不能增加chondrogenic基因在软骨细胞(图的表达式 2 (b))。然而,msc在软骨细胞基因表达显著增加FGF18的存在(图 2 (c))。特别是,软骨细胞表达5倍比单作COL2a1 coculture在MSC。

 3.3。Coimplantation msc与OA软骨细胞产生更多的矩阵只比软骨细胞

评估以前的结果 在活的有机体内软骨细胞和msc(比1:1)coimplanted进皮下拥有与海藻酸老鼠携带车辆。在移植之前,TE构造无血清培养系统在有或没有FGF18。然后,植入后8周,组织学检查以及呕吐和胶原蛋白进行量化。图 1(一)立体显微镜下显示了TE的gross-looking构造。一般来说,TE所有组类似的结构。那些不是培养FGF18似乎有更多的血管生成。如图 3 (b),有一些积累的ECM组件pericellular地区所有实验群体。然而,TE构造培养FGF18显然沉积比构造培养没有FG18笑料。量化的插科打诨和胶原蛋白后证实coimplantation FGF18文化集团生产的大多数的笑料和胶原蛋白与其他实验组(数据比较 3 (c)和 3 (d))。然后,ELISA用于量化软骨特定坳二世在TE结构。比较组培养有或没有FGF18,至少三倍增加观察坳二两组(图之间的生产 3 (e))。再次,coimplantation TE构造包含坳二世明显多于软骨细胞TE结构。

Coimplantation msc和软骨细胞的海藻酸水凝胶在裸小鼠皮下注射。(一)概述只含有软骨细胞的组织工程结构或MSC和软骨细胞的混合物。水凝胶是装载有或没有FGF18 (10 ng / mL)。酒吧= 5毫米。(b)组织工程构建低分段和沾染了红色染料o .面板的放大图片插入上面板。酒吧= 50 μm。(c)石斑鱼在组织工程结构量化GAG试验( n = 3 )。总笑话( μg)被归一化湿重(毫克)。数据平均值±标准偏差。 P 与学生的计算值 t 以及。NS: nonsignificance。(d)胶原蛋白在组织工程结构由羟脯氨酸测定含量测定( n = 3 )。总胶原蛋白( μg)是归一化湿重(毫克)。数据平均值±标准偏差。 P 与学生的计算值 t 以及。NS: nonsignificance。(e)胶原蛋白II型沉积在组织工程结构检测ELISA ( n = 3 )。总坳二世( μg)是归一化湿重(毫克)。数据平均值±标准偏差。 P 与学生的计算值 t 以及。NS: nonsignificance。

GAG化验

胶原蛋白测定

坳二世ELISA

 4所示。讨论

在这项研究中,FGF18对MSC的营养效应的影响,研究了在系统coculture MSC和软骨细胞来源于晚期OA患者。颗粒coculture系统表明,msc呕吐形成和软骨细胞的胶原蛋白合成增加FGF18培养基。数据从transwell coculture系统表明,msc提升chondrogenic基因的表达在软骨细胞FGF18的存在。异位形成证实FGF18 msc治疗恢复OA软骨细胞的响应性 在活的有机体内。

在先前的研究,所示的软骨细胞和骨髓msc颗粒coculture coculture的有利影响软骨基质的形成主要是由于msc对软骨细胞增殖和基质分泌的支持( 18, 19]。在这些颗粒cocultures,软骨基质主要是由软骨细胞;然而,msc没有积极接受chondrogenic分化。另一份报告就显示,营养msc对软骨细胞的影响是独立的文化条件和被发现在cocultures软骨细胞msc的各种来源( 17]。此外,Meretoja等人报道,msc还可以通过营养影响软骨细胞的支持矩阵生产coculture系统设置在水凝胶( 26]。这些研究表明,软骨工程是cocultures最有前途的细胞来源,因为他们有一个潜在的减少主要软骨细胞收获和扩张的必要性,而获得一个稳定的高度chondrogenic表型。

软骨细胞与后期OA患者通常失去存款软骨基质的能力。显示在这项研究中,msc的coculture丸和OA软骨细胞没有存款足够的笑料和胶原蛋白。据报道,转化生长因子- β3 (TGF - β3)可以诱导软骨基质形成cocultures OA软骨细胞和MSC在颗粒和生物可降解支架( 20., 27]。TGF - β3也可以redifferentiate期间失去了表型的软骨细胞 在体外多孔支架扩张coculture系统( 28]。使用TGF - βredifferentiate OA软骨细胞可能引发骨关节炎( 29日]。据报道,高浓度的活性TGF - β1在膝关节骨关节炎软骨下骨可能发起,并抑制TGF - β信号会减弱骨关节炎的病理过程 30.]。而不是TGF - β在这项研究中,我们使用FGF18恢复OA软骨细胞的表型。我们的数据表明,FGF18可能增加的响应性OA软骨细胞的营养影响msc。除了改进GAG coculture生产已在先前的研究报告,该研究提供了更详细的结果合成胶原蛋白沉积特别是坳二世。这是第一次证明了msc刺激软骨细胞产生更多坳二合成细胞外基质在coculture或coimplantation系统。

综上所述,本研究的结果表明,在培养基FGF18 OA软骨细胞应对msc的支持作用。颗粒coculture系统以及异位coimplantation msc促进石斑鱼和坳二生产OA软骨细胞与FGF18的存在。Coimplantation msc和OA软骨细胞可能是一个有用的来源从OA软骨细胞再生软骨组织。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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