1。介绍
CD133在1997年首次分离和克隆。CD133表达最初造血干细胞和祖细胞中观察到使用一种称为AC133的单克隆抗体(
1使用单克隆抗体)和神经上皮的细胞称为prominin [
2]。格尔et al。
3)报道,CD133-positive细胞群由不仅有造血祖细胞和干细胞的潜力,但也有能力分化成内皮细胞。Invernici et al。
4)报道,人类胎儿主动脉包含血管祖细胞诱导的血管生成和血管生成的能力。Barcelos et al。
5)报道,人类CD133祖细胞通过旁分泌刺激促进缺血性溃疡的治疗糖尿病的血管生成和Wnt信号激活。
增长,实体肿瘤需要血液供应。他们招募新的血管主要是通过诱导血管内皮细胞从外部的萌芽。最近的研究在肿瘤生物学表明,除了招聘以外的血管肿瘤,脑瘤产生内皮细胞在肿瘤血管形成(
6]。王等人。
7)报道,胶质母细胞瘤细胞群(CD144和CD133双阳性)分化成内皮细胞在胶原凝胶和细胞内空泡的形成结构。然而,在血管生成CD133的生物学功能在很大程度上仍是个未知数。
体外研究血管生成,一些文化技术已经开发使用矩阵结构,包括纤维蛋白和胶原蛋白凝胶(
8),基底膜基质、胶原蛋白、纤维蛋白和血浆凝块(
9]。胶原蛋白凝胶文化已经广泛应用,有效分析血管生成的生物过程(
10- - - - - -
13]。使用一个三维(3 d)胶原蛋白凝胶文化,我们进行了电子显微镜研究
14,
15)和免疫组织化学的研究纤维母细胞生长因子(FGF) 2和FGF-9 [
16]。此外,我们使用三维胶原凝胶文化测试血管生成和抗血管生成因子(TNF -
α萨力多胺)(
17,
18]研究激光显微解剖后血管损伤
19)和分析DNA微阵列基因表达在血管生成(
20.]。三维胶原凝胶文化系统提供了一个简单的和快速的方法来分析血管生成。
在目前的研究中,我们检测到标签然后在电镜下观察CD133在血管生成三维胶原凝胶文化系统。在这里,我们表明,CD133-positive细胞群有能力形成毛细管。
2。材料和方法
2.1。动物
ICR小鼠(男,1月,
n
=
5
;克丽日本,Inc .)和Wistar鼠(男,2个月大的时候,
n
=
3
;克丽日本,Inc .)被用于实验。小鼠和大鼠的维护按照指南的护理和使用实验动物建立了埼玉县医科大学。这些实验动物研究委员会批准的埼玉县医科大学。
2.2。胶原蛋白凝胶的老鼠和老鼠Aortae文化
本研究中使用的胶原蛋白文化技术修改从我们先前技术
14,
15]。从小鼠和大鼠胸aortae得到。在立体显微镜,fibroadipose组织和血液从aortae被移除。胸aortae然后连续横截面成~ 2毫米戒指。四块被放置在底部的每个组织培养皿(35 mm;
n
=
25
),覆盖一层均匀的重组胶原蛋白溶液(0.3% Cellmatrix IA型,Nitta明胶,东京,日本),并允许凝胶在37°C大约10分钟。凝胶形成后,他们覆盖与火腿F-12介质(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国),含20%胎牛血清的边后卫,不必要的氨基酸1%,100单位/毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国),和培养14天的空气(95% / 5%孵化器有限公司2)。每周中取代了三次从第三天开始。毛细管使用相差显微镜观察形成文化时期。这些实验进行三次。
2.3。相差显微镜检查和成像方法
收集标准相衬显微镜的图像通过使用一个相差倒置显微镜(日本尼康TE2000)和CCD相机(ORCA-ER、滨松光子学、日本)。对延时实验中,主动脉环被培养如上所述。细胞增长从主动脉环可视化使用相差倒置显微镜配备预热至37°C的一个阶段。这些细胞被保持在5%以下有限公司2室文化在图像采集和图像记录每隔5分钟使用一个Aquacosmos成像系统(滨松光子学、日本)。
2.4。透射电子显微镜法
培养主动脉环固定在0.1米磷酸盐缓冲剂(pH值7.2)包含2.5%戊二醛1小时,然后固定在0.1 M磷酸盐缓冲剂(pH值7.2)包含OsO的1%41小时。五环在分级乙醇脱水,嵌入在环氧树脂,切成超薄部分,沾染了醋酸双氧铀及柠檬酸铅。彩色超薄部分透射电子显微镜下观察(jem - 1010,东京,日本)。
2.5。Rhodamine-Phalloidin和凝集素组织化学
在4%多聚甲醛固定后/ PBS,培养主动脉环沾rhodamine-phalloidin(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)确定f -肌动蛋白的存在,和FITC-conjugated endothelial-cell-specific番茄植物血凝素(
Lycopersicon esculentum哦,是吧非饱和、钙、美国),选择性地结合海藻糖存在内皮细胞表面的残留物,用于标签内皮细胞(
21]。
2.6。免疫组织化学检测CD133
培养主动脉环固定在4%多聚甲醛/ PBS。CD133的检测在细胞表面,一夜之间,戒指被孵化的CD133抗体(兔多克隆,Abcam、东京、日本)治疗后1%的脱脂牛奶/ PBS为30分钟,然后用Alexa萤石488 -他们孵化和Nanogold(1.4海里)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(Yaphank Nanoprobes, Inc .,纽约)1小时。Nanogold信号增强使用GoldEnhance EM (Nanoprobes)在室温下为3 - 5分钟电子显微镜和光学显微镜的20 - 25分钟。
2.7。洛伐他汀(Mevinolin)对血管生成的影响
管形成之前和之后,洛伐他汀(mevinolin的效果
曲霉属真菌sp)进行了测试。洛伐他汀(mevinolin M2147)由σC的一个经验公式24H36O52-methyl-1, 2、3、7、8、8 a-hexahydro-3 7-dimethyl-8 - [2 - (tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl)乙基]1-naphthalenyl酯丁酸。它是一种白色结晶粉末,不溶于水。股票的解决方案是由溶解在100%的乙醇浓度的12.3毫米(
22]。两组不同的实验设计如下。
管形成之前。大鼠主动脉环被培养在35毫米盘子如上所述。24小时后,主动脉瓣环与12.3毫米培养洛伐他汀或没有洛伐他汀。文化是维持在37°C下5%的股份有限公司2在湿润孵化器。
管后形成。大鼠主动脉环被培养在35毫米盘子如上所述。10天之后,洛伐他汀被添加到培养基中。文化是维持在37°C下5%的股份有限公司2在湿润孵化器。
2.8。内皮细胞刮
在另一组实验中,削减了胸主动脉是培养如下。胸主动脉内膜的表面直接的可视化,翻转了一个过程,隔离的外膜细胞和微血管可能残留periaortic软组织主动脉内管(
23]。主动脉内皮细胞从翻转刮用无菌棉拭子。翻转主动脉有/无内皮是切成小块,培养以同样的方式如前所述,其次是10%福尔马林固定和染色染色。
3所示。结果
3.1。毛细管的形成
3.1.1。相差显微镜检查
显微镜检查后只要2天文化显示迁移细胞的存在近端主动脉环的胶原蛋白凝胶。这些细胞纺锤状,其纵向轴线径向导向向主动脉环的树桩(数字
1(一)和
1 (b))。后7天文化时期,毛细芽被识别(图
1 (c)),尽管腔形成没有观察到这些早期的毛细结构。
相差显微镜检查。(一)培养2天后,相差显微镜检查显示成纤维细胞的细胞(箭头所指)长大从小鼠主动脉外植体(
*
)三维胶原凝胶。(b) 5天培养后,相差显微镜检查显示大量的成纤维细胞的细胞不再从主动脉外植体(
*
)。(c)经过7天的培养、相差显微镜检查显示一个管状结构突出(箭头)从主动脉外植体(
*
)三维胶原凝胶。(a)、(b)和(c):规模酒吧= 20
μm。
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3.2。延时成像毛细管的形成
延时成像用于可视化动态过程的毛细管主动脉环的形成。额外的芽出现以顺序的方式和扩展的前缘新形成的毛细管(图
2)。
延时成像额外的豆芽新兴和扩展以顺序的方式从前缘的新形成的毛细管鼠标主动脉外植体。选择的顺序从一个延时电影聚焦于一个发芽。注意突出板状伪足和持续迁移的主要细胞。比例尺= 50
μm。
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3.3。Rhodamine-Phalloidin和凝集素组织化学
在文化10到14天之后,细长的毛细管枝子被观察到。在胶原凝胶毛细管被rhodamine-phalloidin染色(图观察
3(一个))。毛细管中形成胶原蛋白凝胶也强烈积极的番茄植物血凝素(图
3 (b))。
Rhodamine-phalloidin和凝集素组织化学。(一)11天培养后,荧光显微镜显示毛细管,沾染了rhodamine-phalloidin f -肌动蛋白(紫红色)和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)核酸染色(蓝色)。星号(
*
)显示鼠标主动脉外植体。比例尺= 20
μm。(b) 11天培养后,毛细管是强阳性FITC-conjugated endothelial-cell-specific番茄外源凝集素染色(黄绿色的)中,DAPI核酸染色(蓝色)。星号(
*
)显示主动脉外植体。比例尺= 20
μm。
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3.4。透射电子显微镜法
浆纱切片的经验显示,内皮细胞形成的毛细管相互紧密接触,和pericyte-like细胞在内皮细胞(图
4(一))。内皮细胞并没有显示任何毛孔或缺口。典型的缝隙连接和紧密连接并没有观察到。细胞细胞器大量存在,特别是在厚的内皮细胞。纵向切片显示,内皮细胞和pericyte-like细胞密切接触(图
4 (b))。
透射电子显微镜。(a)电子显微照片的新形成的毛细管鼠标主动脉胶原凝胶的外植体。横截面显示一个毛细管腔,其中包含细胞碎片。Pericyte-like细胞(
*
)围绕管。边缘的细胞相互接触。比例尺= 2
μm。(b)电子显微照片的毛细管的纵切面。Pericyte-like细胞(
*
)围绕管。比例尺= 2
μm。
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3.5。免疫组织化学检测CD133
在文化的早期阶段,CD133-positive细胞中检测到细胞从主动脉环(迁移数据
5(一个)和
5 (b))。CD133表达还发现在主动脉壁(数字
5 (c)和
5 (d))。后期的文化、毛细管形成。CD133-positive细胞存在于腹腔模式(数据
6(一)和
6 (b)),发现CD133的表达技巧和茎的地区。毛细管的前缘强烈CD133阳性(图
6 (c))。电子显微镜观察发现CD133表达在细胞位于底部的胶原蛋白凝胶(图
7)。
CD133免疫组织化学。(一)文化的早期阶段(为期4天的文化),CD133-positive细胞(箭头)检测细胞迁移的大鼠主动脉外植体。(b) CD133-positive迁移细胞的放大图像。比例尺= 20
μm。(c) CD133表达(箭头)被发现在附近的平滑肌层和外膜。比例尺= 20
μm。(d) CD133表达还发现内皮、平滑肌层。比例尺= 20
μm。
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在毛细管CD133免疫反应性。(一)文化的后期(为期九天的文化),毛细管形成。相差显微镜检查显示,许多管形成的大鼠主动脉外植体。箭头表示CD133-positive CD133-negative管中管。大鼠主动脉外植体(
*
)。(b) CD133-positive细胞存在于管状模式。照片显示CD133-positive管由箭头表示在(a)。鼠主动脉外植体(
*
)。比例尺= 20
μm。(c) CD133表达显然是发现提示地区(箭头)的管而不是茎地区附近的大鼠主动脉外植体(
*
)。比例尺= 20
μm。
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Immunoelectron CD133的显微镜。(a)在底部一侧的胶原蛋白凝胶,CD133-positive细胞相互取得联系(箭头)。细胞细胞器在细胞稀疏。比例尺= 5
μm。(b) CD133-negative细胞相互联系的中间层胶原凝胶(
*
)。比例尺= 5
μm。(c)增大(b) (
*
)。这些细胞细胞间形成空泡的结构(箭头所指)。细胞的细胞器,如粗面内质网,在这些细胞丰富。比例尺= 1
μm。
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3.6。洛伐他汀(Mevinolin)对血管生成的影响
管形成之前。主动脉瓣环与洛伐他汀培养时,细胞迁移强烈抑制相对于控制数据
8(一个)和
8 (b))。
洛伐他汀的效果(mevinolin)之前管形成。(一)——(b)大鼠主动脉环与洛伐他汀培养时,细胞迁移(箭头)强烈抑制相对于控制。(一)=控制,(b) =洛伐他汀,主动脉外植体(
*
)。比例尺= 100
μm。
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管后形成。洛伐他汀治疗诱导新形成的毛细管的退化(数字
9(一个),
9 (b),
9 (c))。信息附着力降低,许多CD133-positive细胞的形态学改变一个椭圆形(图
10 ()),尽管一些多边形细胞与细胞过程保持他们的形态(图
10 (b))。
洛伐他汀的效果(mevinolin)管后形成。(一)——(c)管形成后,洛伐他汀治疗诱导新形成的毛细管的退化(箭头)。(一)洛伐他汀治疗前;(b) 24小时后;48小时后(c);大鼠主动脉外植体(
*
)。比例尺= 200
μm。
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(a)和信息附着力降低,许多CD133-positive细胞采用了圆的形态。箭头表示毛细管的退化。比例尺= 20
μm。(b)一些多边形细胞与细胞过程保持形态(箭头所指)。比例尺= 20
μm。
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3.7。内皮细胞刮的效果
与完整的上皮,翻转主动脉纺锤状细胞迁移到胶原蛋白凝胶,毛细管形成发生在类似的方式(图
(11日))。内皮细胞刮后,纺锤状细胞迁移到翻转主动脉胶原凝胶,即使没有上皮细胞的存在。然而,形成毛细管没有发生(图
11 (b))。
(一)大鼠主动脉外植体的控制文化。许多毛细管(箭头)。(b) deendothelialized鼠主动脉外植体,纺锤状细胞迁移到胶原蛋白凝胶。然而,毛细管的形成并没有发生。大鼠主动脉外植体(
*
),吉姆沙染色剂。比例尺= 200
μm。
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4所示。讨论
最近,LS-7(氨基酸序列:LQNAPRS),这是一个特定的绑定目标鼠标CD133肽,筛选和确定第一次使用phage-displayed肽库技术(
24]。然而,CD133的生物学功能尚不清楚。CD133表达并不局限于神经上皮的造血干细胞和祖细胞在它最初的观察;它还延伸到几个上皮和nonepithelial细胞类型。CD133也被广泛用作癌症干细胞标记(二者)在许多不同类型的实体肿瘤包括结肠(
25,
26),大脑
27,
28)、皮肤(
29日),胰腺(
30.),肝脏(
31日- - - - - -
33),和前列腺癌
34)肿瘤。王等人。
7)和Ricci-Vitiani et al。
35]提出的证据表明,tumor-derived内皮细胞来自于肿瘤干细胞样细胞。王等人。
7]发现,胶质母细胞瘤细胞群可以分化成内皮细胞在胶原凝胶和细胞内空泡的形式结构丰富表达CD133细胞中。虽然内皮分化的肿瘤细胞的可能性,建议在淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、乳腺癌和神经母细胞瘤(
36- - - - - -
40),二者的血管生成活动没有进行其他类型的肿瘤。因为胶质母细胞瘤是一种最vascular-rich肿瘤,需要进一步调查来评估二者的分化成内皮细胞。
在目前的研究中,我们表明,CD133-positive细胞出现在新形成的毛细管。王等人。
7)表明,二者的分化成内皮细胞可能是介导的信号通路包括两种蛋白质:血管内皮生长因子(VEGF)和档次。王等人。
7)提出,切口调节初始内皮祖细胞分化的肿瘤干细胞,而VEGF选择性影响内皮祖细胞的分化tumor-derived内皮细胞。我们表明,毛细管的前缘强烈CD133阳性,这表明CD133-positive细胞参与毛细管的伸长和/或分支。成熟的内皮细胞不表达CD133。CD133表达内皮前体细胞和迅速失去了在分化为成熟内皮细胞(
41]。因此可能新形成的毛细管,由CD133-positive细胞不成熟。苏打水等。
42)报道,低氧诱导因子- 1 (HIF-1)是一种重要的增强剂EC肿瘤细胞的分化,形成tumor-derived内皮细胞VEGF无关。缺氧条件下可能因此导致的形成毛细管CD133-positive底部的胶原蛋白凝胶。
目前的研究表明,CD133-positive细胞也出现在主动脉外植体。Zengin et al。
43]报道的存在内皮干细胞前体和不同区域的血管壁能够分化成成熟的内皮细胞,造血细胞和局部免疫细胞如巨噬细胞。该区域已被确认是眼窝内壁平滑肌和外膜层之间的成人血管壁。祖细胞与小鼠和人的动脉外膜血管内皮细胞有可能形式,壁画细胞,成骨细胞和脂肪细胞。这些祖细胞似乎集群达到或接近外媒体和内动脉外膜之间的边界区(
44]。刮后上皮,纺锤状细胞迁移到胶原蛋白凝胶的两端翻转主动脉。然而,毛细管的形成并没有发生。在这个主文化,很可能新形成的毛细管的主要来源是内层的内皮细胞。尼科西亚(
12)还指出,大鼠颈动脉移植组织未能产生血管生成反应完全deendothelialized气囊导管时,而用一个完整的控制动脉内膜的微血管内皮细胞产生的切除。目前,目前尚不清楚新形成的毛细管的主要来源是来自不同的区域之间的平滑肌和外膜层或内膜的内皮细胞层。还需要进一步的研究来澄清这些问题。
目前的研究还表明,洛伐他汀强烈抑制主动脉外植体的细胞迁移。抑制细胞迁移的机制被认为是如下。洛伐他汀是一种强有力的抑制剂hydroxymethylglutaryl-coenzyme(β)还原酶。抑制β-还原酶,参与脂类代谢,导致正常所必需的脂质膜功能缺陷,并进一步损伤被认为在他们的粘附特性。脂质是通过整合蛋白介导的粘附,细胞所需的能动性和迁移通过细胞外基质在入侵过程中(
22]。临床数据表明,剩病人减少intraplaque血管生成(
45),这表明他汀类药物体内有angiostatic影响。它也是有趣的,他汀类药物已报告减少许多癌症的生长和传播(
46,
47),这可能与抑制血管生成(
48]。目前的研究还表明,洛伐他汀下套管的废除和信息毛细管的附着力和退化。Khaidakov et al。
48)表明,他汀类药物通过VE-cadherin刺激调节信息粘附和减少细胞增殖和迁移的能力。最近,Koyama-Nasu et al。
49)报道,CD133与plakoglobin(也称为c-catenin),一个desmosomal链接器的蛋白质。他们进一步证明击倒CD133的核糖核酸干扰(RNAi)的差别导致了对这些desmoglein-2,一个desmosomal钙粘蛋白,和废除信息粘附和致瘤性卵巢透明细胞癌干细胞。此外,我们报道,胆固醇螯合剂,甲基-
β环糊精,减少细胞粘附减少细胞桥粒和细胞间指状。降低胆固醇水平可能扰乱CD133膜定位(
50]。调制信息的附着力可能有助于解释毛细管的退化。本研究因此提供了洞察CD133在血管生成的作用和对他汀类药物的抗血管生成效应提供了一个解释。