SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 926463年 10.1155 / 2012/926463 926463年 研究文章 激光传播人类iPS和胚胎干细胞生成的文化,增强的分化潜能 Hohenstein艾略特 克丽丝蒂。 1 彼得森 科里 1 桑德拉让 阿 2 菅直人 纳塔莉亚 3 纳尔逊 布兰登 3 施皮尔 肖恩 3 Mercola 马克 3 明亮的 加里·R。 2 Vemuri Mohan C。 1 Intrexon公司,细胞工程单位 台面岭路6620号,圣地亚哥 CA 92121 美国 2 Cyntellect公司。 台面岭路6620号 圣地亚哥 CA 92121 美国 3 孚-伯纳姆医药研究所 多利松路10901号 拉霍亚 CA 92037 美国 sanfordburnham.org 2012年 30. 5 2012年 2012年 15 09年 2011年 03 02 2012年 03 02 2012年 2012年 版权©2012克丽丝蒂Hohenstein艾略特et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

适当的维护的干细胞是必不可少的成功利用ESCs /万能工具发展和药物发现研究和再生医学。标准化对未来所有的干细胞的应用至关重要,必须充分了解自己的潜力。本研究报告一种有效的新途径,扩大人类的ESCs一致,则使用激光切片,而不是机械设备或酶,为传播文化划分为定义的块大小。Laser-mediated传播维持多能性、质量和遗传稳定性的ESCs /万能,导致增强的分化潜能。这种方法消除了可变性与ESC / iPSC传播,显著地降低了专业知识,劳动和时间相关的手册使技术和提供可伸缩的基础提供标准化的ESC / iPSC线。采用标准化的协议将允许研究人员理解基因的作用,环境,和/或程序性影响干细胞和干细胞将确保可再生的生产文化用于临床/治疗应用。

 1。介绍

人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞(ESC iPSC)行一直以各种方式派生和维护,建立广泛的可变性和不一致从实验室到实验室。目前,ESC和iPSC线条在不同条件下培养,涉及众多的方法扩张,feeder-dependent和feeder-independent矩阵,和各种各样的培养基配方 1- - - - - - 8]。ESCs大规模实际利用人类和万能药物发现应用程序中,发育和疾病模型,和再生治疗的应用程序,将需要更多的一致的和可伸缩的培养方法。同样,代GMP-quality干细胞系需要标准化,起源于干细胞方法推导和扩张 9]。

人工通道,使用专门的干细胞刀、剃须刀,或吸量管身体部分干细胞殖民地,被广泛接受为最好的方法传播人类ESC和iPSC线。人工繁殖的干细胞系不涉及酶的使用,因此被认为更好的保持遗传稳定性的人类的ESCs和万能在长期的文化 10- - - - - - 14]。手工干细胞的文化扩张的其他好处包括通过类似大小的细胞团,低细胞创伤,和选择性传输特定的未分化的殖民地( 7, 15]。然而,扩大多种干细胞系使用这些方法是没有吸引力,因为劳动力成本高,不一致的输出与不同的专长,污染的风险,无法有效地自动化。由于这些技术要求与人工通道有关,大多数人类的常规传播ESC和iPSC行是经常使用酶通过执行( 5, 6]。酶的方法(例如,使用accutase,胶原酶,dispase,胰蛋白酶,或TrypLE)通常用于大规模扩张和非常适合自动化平台( 16]。然而,这些方法很有问题在大小可变的殖民地酶分解结果导致文化(重大不一致 7]。同时,人类的ESCs /不生存以及单个细胞的细胞则限制酶的效用传播( 17]。而化合物(例如,岩石抑制剂)可以用来促进生存分离干细胞,这些化合物不减轻异质性与酶通过人类ESC和iPSC文化,也不是常规使用的全面影响的已知化合物( 18]。大型异质性群体大小也限制了高密度板的用途,如96 - 384孔板,高吞吐量的应用程序。

这项研究报告的新方法使用基于激光的传播扩大人类干细胞系。Laser-mediated使是由精确的人类干细胞的文化由激光切割成特定大小的细胞部分。这些细胞部分是通过简单的移液转移到新的文化传播菜肴。细胞大小一致的部分是导致更大的一致性产生的殖民地。此外,enzyme-free条件保持在处理发生在无菌,封闭的环境。操作标准格式多井内板为可伸缩的交付启用的自动机器人系统标准化的干细胞的文化。

Laser-mediated传播维护质量和ESC /万能干细胞的多能性,导致增强的分化潜能。这种方法删除相关的可变性使干细胞,这将大大提高基因表达特征的评价,遗传和表观遗传资料、和分化能力/效率的干细胞系。Laser-mediated ESC / iPSC显著地降低了专业知识,通过劳动,与时间相关的手册使技术和可再生的传播提供了依据GMP-quality人类干细胞系。

 2。材料和方法 2.1。人类ESC和iPSC文化

四个人类iPSC行(BIMR 6、P15-40 BIMR 14日P25-40成人成纤维细胞,产生BIMR, P20-50 BIMR L, P30-45胎儿成纤维细胞,产生与逆转录病毒包含所有转导 Oct4, Sox2, Klf4, 原癌基因基因,伯纳姆医学研究所(BIMR))是培养与敲除血清替代20% KODMEM补充,GlutaMax 1%, 1%不重要的氨基酸,0.1毫米2-mercaptoethanol, 8 ng / mL bFGF从英杰公司(所有)。则是扩大PMEF-CFs(微孔)或人工基底膜(使用PMEF-CFs BD生物科学,在介质条件),每天中被改变,细胞通道1:2 - 1:8每隔5 - 7天。ESCs H9人类(p35区域- 65)都使用相同的培养基培养PMEF-CFs,通道1:2 - 1:4每隔5 - 7天。实验涉及人类的ESCs进行H9 BIMR干细胞核心。

则是由几种方法包括通过手动通过使用吸管提示或使用StemPro EZPassage可支配干细胞使工具(表达载体),酶通过使用胶原酶IV(英杰公司)或0.05%胰蛋白酶(表达载体),并使用跳跃laser-mediated通道细胞处理工作站(Intrexon Corp .)。

干细胞群体大小决定通过测量最长的直径的殖民地brightfield图像和人工计数的赫斯特(表达载体)染色细胞核从荧光图像。整个brightfield干细胞文化图像,在飞跃(Intrexon Corp .)和Celigo(布鲁克斯自动化公司)。生成ESC / iPSC增长曲线,0.25%胰蛋白酶(英杰公司)是用于生产单细胞悬浮ESC /万能然后使用血细胞计数器在天0 - 5通道数。

传输效率laser-mediated通道后由人工计数的ESC / iPSC的数量每口井的部分分割后吸量(前部分切除),去除的部分处理好后,后部分转移到新的文化板块使用整个brightfield图像。两天后,通行效率是由手工计数的碱性磷酸酶阳性菌落数的文化包含传输部分。

 2.2。Laser-Mediated通道

最佳激光加工条件建立了评估激光功率、激光光斑大小和密度的激光斑点减少干细胞殖民地分成以最小的损失的细胞。评估进行实证测试一个给定条件的能力持续削减典型干细胞文化在96 - 12 -,6-well盘子。光热光谱分析激光加工处理过程中选择细胞损失减小到最低限度[ 19]。从3 - 10激光脉冲的权力 μJ和激光点大小从汽车销售嗯系统地评估切片通过干细胞文化不同的厚度。这是确定~ 8 μJ激光功率交付10嗯光斑大小足以节文化的厚度。创建一个连续切片,激光脉冲的位置~ 16 μ米在一条线,有效减少干细胞殖民地。处理后,样品被清洗,部分被移液使用正常脱落iPSC / ESC介质,和所有部分被转移到新的文化板块包含PMEF-CFs或基底膜基质。细胞通道1:2 - 1:8每隔5 - 7天。

 2.3。人类ESC / iPSC分化

拟胚体(EBs)生成使用胶原酶静脉治疗的第五天人类iPSC文化0.5 - -1.0小时把殖民地从文化菜肴。殖民地种植在悬浮培养的分化培养基使用超低附件板(康宁)。最长的直径产生的EBs手动测量使用brightfield图像获得飞跃(Intrexon集团)4或5天的悬浮培养。

人类则在介质由自发诱导分化KODMEM补充20%击倒血清替代,GlutaMax 1%, 1%不重要的氨基酸,0.1毫米2-mercaptoethanol(表达载体)。EBs悬浮培养了8天,然后镀到gelatin-coated盘子和能够区分一个额外的8天。每隔一天中被改变。文化是固定在16天采用免疫分析。

人类被诱导形成心肌细胞培养的细胞则EBs 4天在悬浮培养介质组成的KODMEM(表达载体)补充20%胎牛血清(的边后卫,Hyclone), 1% Glutamax不必要的氨基酸1%,0.1 nM 2-mercaptoethanol(表达载体)。第四天,EBs被镀到gelatin-coated盘子和允许区分为额外的18天(22天)。每隔一天中被改变。RNA收集中存在分析16天,承包EBs的数量被指望天16和22,和文化被固定采用免疫分析在22天。

人类细胞则被培养诱导形成神经圆花饰EBs 7天在悬浮培养介质组成的DMEM / F12 50%, 50%与glutamax Neurobasal中补充,0.5 x N2补充,0.5 x B27补充(表达载体),0.5毫米抗坏血酸,0.1%的白蛋白, 4.5 × 10 - - - - - - 4 M MTG(σ),bFGF (20 ng / mL, Peprotech)。第七天,EBs被镀到gelatin-coated板块在上述介质补充EGF (20 ng / mL, Peprotech)和允许区分一个额外的4天。11天,EBs包含的数量≥1神经玫瑰手工计算。

 2.4。免疫细胞化学

细胞被固定在4%多聚甲醛在PBS 15分钟,在0.1% Triton-X100 permeabilized PBS为5分钟,然后在阻断缓冲区阻塞1小时(10%血清的物种和二级抗体相同,0.05% Triton x - 100在PBS)。细胞被洗和孵化主要在1%血清抗体(同一物种二级抗体)在PBS在室温下2小时或隔夜在4°C。人类iPSC / ESCs抗体使用以下特征:Oct4、Sox2,和Nanog (R & D系统),SSEA4(发展研究杂种细胞银行),和TRA1-60 tra1 - 81(圣克鲁斯生物技术)。细胞凋亡分析使用以下抗体:caspase-3和裂解PARP (BD生物科学)staurosporine治疗iPSC文化作为控制(10 μM staurosporine 4小时治疗)。分化细胞则是使用以下抗体特征:巢蛋白,Map2, ANP (NPPA)和肌钙蛋白I(微孔),Brachyury和Sox17 (R & D系统),法新社 α 辅肌动蛋白(σ), α mhc(发展研究杂种细胞银行)。细胞被洗和孵化Alexa Fluor-conjugated二级抗体(表达载体)2小时。所有抗体稀释根据制造商的指示。细胞核染色了赫斯特(表达载体)。所有图片都是使用跳跃系统(Intrexon Corp .)收购。

 2.5。碱性磷酸酶染色

细胞被固定在4%多聚甲醛在PBS 15分钟,快速沾红TR半(氯化锌)盐(σ)和萘酚,磷酸AS-MX碱性溶液(σ)H2O 15 - 30分钟。所有图片都是使用跳跃系统(Intrexon Corp .)收购。

 2.6。定量rt - pcr分析

使用RNeasy RNA制备微/小工具(试剂盒)和互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用ABI高容量cDNA逆转录工具包。每个引物组中存在了一式三份,每个细胞样本使用ABI 7900 ht序列检测系统。放大了使用Taqman Univeral PCR Mastermix (ABI)。特定的引物和探针stem-cell-associated基因,differentiation-associated基因,心肌细胞基因来自ABI。Stem-cell-associated基因包括 Pou5f1(Hs00999632_g1), Sox2(Hs01053049_s1), Nanog(Hs02387400_g1), 叔(Hs99999022_m1), Zfp42(Hs00399279_m1), Dppa2(Hs00414515_m1), Esg1(Hs00988349_g1)。Cardiomyocte-associated基因包括 Nkx2.5(Hs00231763_m1), TnnI3(Hs00165957_m1), Actn1(Hs00998100_m1), Mef2C(Hs01554599_m1), Myh6(Hs00411908_m1), Nppa(Hs00383230_g1)。所有基因的表达水平是规范化真核18 s rRNA (Hs99999901_s1),然后分析使用 2 Δ Δ Ct 方法( 20.]。

 2.7。核型分析

活细胞培养细胞系基因进行了分析。二十G-banded中期细胞进行细胞遗传学分析。

 2.8。aCGH分析

基因组DNA收集和纯化使用Gentra Puregene细胞工具包(试剂盒)。杂交是随着人类StemArray 44 K(橱柜遗传学),决议的~ 24 kb在整个基因组和高分辨率的其实覆盖率stem-cell-associated基因,肿瘤抑制,致癌基因。样本DNA杂交sex-matched汇集正常参考(Promega)。橱柜遗传学分析的数据使用DNA分析(安捷伦)和使用基因组构建HG18报道。

 2.9。统计分析

使用GraphPad棱镜与统计分析 P ≤0.05被认为是重要的价值。单向方差分析(方差分析)与Bartlett平等的差异进行评估的测试生成的菌落大小通过后生成五个技术( n = 20. 殖民地/样本,图 2 (c)),导致EB大小从laser-mediated生成,胶原酶,trypsin-passaged细胞( n = 30. EB /样本,图 5 (b))。存在数据的统计分析( n = 3 ,数据 4 (c)和 5 (d)使用双尾)执行 t 以及。

 3所示。结果 3.1。优化Laser-Mediated通道

Laser-mediated使条件优化使用四个人类iPSC行和人类ESC一行。人类iPSC / ESC文化最初是通过标准方法(即。,collagenase treatment plus manual scraping of cultures) into plates containing mitomycin c-treated murine embryonic fibroblasts and cultured for 5 days in iPSC/ESC medium. Laser-mediated cutting of stem cell colonies into clumps or sections of cells was facilitated by addition of a reagent to increase photothermal absorption of the laser’s energy by the culture medium [ 19]。激光加工条件的优化对激光功率、激光光斑大小,和所需要的激光枪数有效地减少细胞的文化以最小的损失。

确定断面尺寸对导致殖民地的影响大小,干细胞文化被切成方形细胞部分从75年到300年不等 μ米大小和转移到新的文化菜温柔的移液(图 1(一)hiPSCs(前中),为(底部))。部分低于75 μm包含很少的细胞(< 8细胞/部分),而300年 μ米的部分太大容易删除板单靠温柔的吸量。干细胞集落细胞的大小和数目每殖民地被brightfield评估核成像和荧光染色法,分别在处理文化到100 - 250 μ米部分(图 1 (b))。人类iPSC文化分为100年、150年、200年和250年 μ25 m大小导致部分包含12日,47岁,和68个细胞(图 1 (b),最高)。三天后通过人类iPSC殖民地306,367,493,693 μ直径62,119,184,和283细胞/殖民地。类似的结果与所有iPSC细胞系(数据未显示)和人类的ESCs(图 1 (b),底部)使用相同的激光加工条件。

干细胞群体大小控制断面尺寸使用laser-mediated通道。(一)Brightfield人类iPSC的图像(前、中)和ESC(底部)文化切成100 - 250 μ米的部分。规模的酒吧,1毫米。(b)蚁群的规模随着时间的推移,传播后100 - 250 μm iPSC部分(上)或ESC部分由laser-mediated通道(底部)。每个殖民地的细胞数量是手动计算使用赫斯特染色文化(左) n = 15 每个数据点的殖民地)。最长的直径每个殖民地都手动测量使用brightfield图像(右, n = 15 每个数据点的殖民地)。数据显示为的意思 +南达科他州。

改善均匀性的干细胞文化laser-mediated通道。(a) Brightfield iPSC的图像文化laser-mediated通道(200后2天 μ米部分,左)或胶原酶(右)。殖民地是红色线所示。规模的酒吧,1毫米。(b)碱性磷酸酶(美联社)染色的iPSC殖民地laser-mediated通道(200后1天 μ米部分,左)或胶原酶(右)。规模的酒吧,1毫米。(c)殖民地的大小iPSC文化在天laser-mediated通道(200后1和3 μ部分),StemPro EZPassage可支配干细胞使工具(EZ通道),手动通过使用吸管,胶原酶治疗,或细胞的胰蛋白酶分解。最长的直径每个殖民地都手动测量使用brightfield图片(上面, n = 20. 每个数据点的殖民地)。每个殖民地的细胞数量是手动计算使用赫斯特染色文化(底部, n = 15 每个数据点的殖民地)。数据显示为散点图红线指示的意思。上面的简历所示红色文本每个样本。星号(*)表示差异显著laser-mediated通道相比,使用方差分析,用 P ≤ 0.05 被认为是重要的。

日常传播的iPSC和ESC文化,截面尺寸为200 μ米被使用,使得每7天一致的分裂。值得注意的是,其他组已经确定了200年 μ米(50 - 100细胞)作为通道的最优丛大小( 1, 5, 15, 21]。人类则使用200的传播 μ米部分是高效的传输效率平均为91±2% 93±5%的转移部分形成可行的殖民地全面通过85±3%的效率。通过人类的ESCs导致类似的数据(~ 82%效率整体通道,数据未显示)。Laser-mediated通道与当前系统所需的~ 50 - 90分钟来处理整个板的干细胞(取决于使用200板式 μ米的部分;随着时间的大多数(> 90%)花在激光加工,只花了几分钟的用户)。万能和ESCs feeder-free条件下培养也使用相同的成功传播laser-mediated通道条件。这些数据表明,多种干细胞可以通过激光传播通道,导致殖民地的大小可以很容易地由不同的输入控制断面尺寸。

 3.2。提高干细胞文化的一致性

Laser-mediated通道是与传统使技术相比,手动和酶。iPSC文化(BIMR 6)是由(1)通过laser-mediated通道使用200年 μ米部分,(2)手动通过使用StemPro EZPassage可支配干细胞使工具(表达载体),(3)手动通过使用吸管提示(由个人经验6),(4)酶通过使用胶原酶,(5)使用胰蛋白酶酶通道。手动方法通过生成统一的殖民地明显多于酶的方法。比较laser-mediated collagenase-based通道,通过图像分析laser-passaged文化显示更均匀集落形成胶原酶(图2 (a)和通过文化 2 (b)。干细胞培养通道,分析了所有方法对菌落直径和细胞/殖民地(图 2 (c))。Laser-mediated通道导致最统一的殖民地测量240±43 μ包含45 m (CV 18%)直径±7 (CV 16%)细胞每一天后殖民地。酶通过胶原酶和胰蛋白酶导致显著的变量大小的殖民地测量365±177 μ(48%的简历)和172±97 μ直径(CV 56%)包含90±42 (47% CV)和25±19每殖民地(CV 76%)细胞,分别。手工技术通过使用吸管提示或EZPassage工具导致更多类似大小的殖民地测量214±9 μm (CV 37%) 34±3 (CV 37%)和226±65细胞/殖民地 μm (CV 29%)直径37±9每个殖民地(CV 25%)细胞,分别。然而,EZPassage工具不允许殖民地日益增长的边缘的每个传播,离开文化unsectioned > 25%(数据没有显示)。统计方差分析表明,干细胞文化传播不到laser-mediated通道的分布存在显著差异( P 值< 0.0001)文化通过手动或通过酶方法,证明laser-mediated结果更一致的干细胞通过文化比其他所有方法。类似的结果也获得使用BIMR iPSC行(数据未显示)。

 3.3。干细胞的多能性、质量和稳定后Laser-Mediated通道

激光对人体的影响iPSC和ESC质量和多能性检查后立即laser-mediated切片干细胞的文化到200年 μ米的部分。如图 3(一个)多能性标记,如Oct4、Sox2 Nanog, SSEA4 TRA1-60, tra1 - 81分段高度表达在iPSC文化。图像分析表明,所有标记都表达了均匀跨部分,甚至在细胞激光切片行旁边。此外,细胞激光切割线旁边没有任何明显的细胞凋亡的增加,以采用免疫分析激活caspase-3和裂解PARP laser-mediated 4小时后切片(图 3 (b))。一夜之间复制文化(即孵化。200年,文化分为 μ米大小,然后给新鲜培养基)导致显著增长的细胞到区域使用激光切割。这些文化形态和采用免疫分析(使用相同的多能性和细胞凋亡标记上图)表明,再生细胞进入激光切片面积确实是人类细胞则无差异。激光被用于更广泛的区域(~ 1000节 μm)为分析文化的增长超过几天。再一次,这些文化没有形态变化,细胞凋亡和多能性标记表达,表明激光处理并不影响干细胞的自我更新和多潜能(补充图1的补充材料网上doi: 10.1155 / 2012/926463)。

iPSC文化laser-mediated通道后的质量。(a)采用免疫分析Oct4、Sox2 Nanog, SSEA4 TRA1-60, tra1 - 81表达后立即laser-mediated切片iPSC的文化(BIMR L)到200年 μ米的部分。赫斯特被用作核复染色。注意所有标记表达均匀在iPSC团。规模的酒吧,1毫米。(b)采用免疫分析细胞凋亡标记,caspase-3,和裂解PARP laser-mediated切片的iPSC文化。赫斯特被用作核复染色。规模的酒吧,1毫米。(c)分析iPSC (BIMR 6(左)和ESC (H9、右)增长后传播使用laser-mediated通道或胶原酶。 P 显示通道数。数据显示为的意思 +南达科他州。 n = 3 )。

laser-mediated通道后干细胞多能性和稳定性。(一)菌落形态(brightfield BF)和采用免疫分析Oct4、Sox2, Nanog,碱性磷酸酶(美联社),SSEA4 TRA1-60, tra1 - 81表达在人类的ESCs (H9)后连续24 laser-mediated段落。赫斯特被用作核复染色。酒吧,250 μm。(b)整个brightfield人类iPSC的图像(BIMR 6)文化后连续10 laser-mediated段落或胶原酶的段落。比例尺,5毫米。(c)中存在的分析stem-cell-associated基因表达在万能(BIMR 6)后连续10 laser-mediated段落或胶原酶的段落。星号(*)表示值显著而万能的人口开始。数据提出了均值±南达科他州。 n = 3 )。使用执行统计分析 t 以及, P 值≤0.05被认为是重要的。(d)的正常核型H9人类ESCs 24 laser-mediated段落之后(6个月)。(e)示意图描述H9 ESCs的基因组异常P35区域(人口)开始在P59, 24 laser-mediated段落(6个月)后,由aCGH决定。未发现新的subkaryotypic异常后24通道。红色条指示删除。绿条指示一个放大。见表 1在这些细胞畸变发现的完整列表。

则由laser-mediated通道传播更有效地分化为心肌细胞。(a) Brightfield第四天EBs的形象产生iPSC文化(BIMR)传播laser-mediated通道,胰蛋白酶分解,或胶原酶治疗。酒吧,250 μm。(b)的大小EBs iPSC laser-mediated文化传播的通道,产生胰蛋白酶离解或胶原酶治疗( n = 35 每个数据点EBs)。数据显示为散点图红线指示均值和简历所示红色文本上面每个样本。星号(*)表示差异显著的激光器相比,使用方差分析 P ≤ 0.05 被认为是重要的。(c)的百分比EBs包含承包领域。数据显示为的意思 +南达科他州。 n = 2 独立实验包含75 EBs /在每个实验样本)。(d)中存在的分析cardiomyocyte-associated基因表达在EBs生成使用iPSC laser-mediated文化传播的通道,胰蛋白酶分解,或胶原酶治疗。星号(*)表示值显著比EBs产生胶原酶通过iPSC文化。数据提出了均值±南达科他州。 n = 3 )。使用执行统计分析 t 以及与 P ≤ 0.05 被认为是重要的。(e)的心肌细胞标记物的表达, α mhc和 α 辅肌动蛋白,在EBs产生iPSC laser-mediated文化传播的通道或胶原酶治疗22天的心脏分化。赫斯特被用作核复染色。酒吧,250 μm。

此外,laser-mediated通过人类和ESCs的细胞则没有改变细胞生长的细胞表现出相同的增长率与胶原酶通过细胞经过多轮的扩张(图 3 (c))。

进一步评估潜在的激光影响人类iPSC, ESC稳定和多能性,干细胞文化传播使用laser-mediated通道在长期文化(两个iPSC线路维护> 5段落(5周),一个iPSC线维护> 10章节(2.5个月),和BIMR 6万能和H9 ESCs维持> 24通道(> 6个月))和与复制相比,文化通过使用胶原酶。文化传播的图像分析laser-mediated通道显示没有变化与所有细胞形态学表现出高核胞质比典型的多能干细胞(图 4(一))。采用免疫分析这些文化展示和ESCs继续表达特征多能性的细胞则标记包括碱性磷酸酶(美联社),Oct4、Sox2, Nanog, SSEA4 TRA1-60, tra1 - 81(图 4(一))。

视觉比较表明,人类使用laser-mediated BIMR 6 iPSC文化传播通道的高质量随着时间的推移,比传播使用胶原酶。文化传播通过laser-mediated通道包含更多的未分化的,紧凑的干细胞殖民地与清晰可辨的殖民地的边界用胶原酶相比,文化传播。胶原酶通过文化更倾向于自发分化(图 4 (b))。量化这些表型观察,存在分析使用已知的标记为未分化的干细胞。如图 4 (c),使用laser-mediated传播通道的细胞则继续表达高水平的茎细胞相关基因,包括 Oct4( Pou5f1), Sox2, Nanog, 叔, Zfp42( Rex1), Dppa2, Esg1( Dppa5),类似于万能的人口开始(无统计学差异, P 值≥0.1)。相比之下,则使用胶原酶导致传播的表达显著下降 Sox2, Nanog, 叔, Zfp42, Esg1万能的人口开始(相比 P 值< 0.05,图 4 (c))。人类ESC文化通过比较这两种方法没有任何明显的形态学变化或差异基因表达(补充图2),虽然人类ESC文化更成熟,后来通过文化比人类iPSC文化用于这些实验。

来自多个组织的数据表明,人类的ESCs H9维持一个稳定的核型在长期文化( 1, 17, 22]。这些细胞被用于检查后干细胞的遗传稳定性长期使用laser-mediated通道传播。核型分析H9 ESCs连续24 laser-mediated段落显示没有变化与所有细胞核型正常二倍体核型(图。6个月 4 (d))。探测subkaryotypic改变阵列比较基因组杂交(aCGH)也使用Stemarray(图执行 4 (e)、表 1)。未发现subkaryotypic改变人类的ESCs传播连续24通道(P59)激光使相对于人口(H9 P35区域)开始,暗示的基因组laser-mediated通道细胞是正常和稳定的。重要的是要注意,subkaryotypic和核型改变后被观察到H9 ESCs连续使胶原酶4和6个月,分别(数据没有显示)。此外,人类细胞则未发现subkaryotypic变化(BIMR 6)传播连续10通道由laser-mediated通道相对于起始人口(数据未显示)。虽然遗传稳定性则只有2.5个月后分析,结合6个月人类ESC的结果,这些数据表明,基因组的laser-mediated通过干细胞和稳定。

ESCs地区H9人类与基因组abberations由aCGH(相应的示意图如图 4 (e))。未发现subkaryotypic改变在为其传播连续24通道(H9 P59)相对于起始hESC人口(H9 P35区域),暗示的基因组laser-mediated通道细胞是正常和稳定的。数据报告使用基因组HG18建造。 日志 2 比率是放大(amp)或≤≥0.6−1.0删除(del)发现在所有细胞。 日志 2 比< 0.6或>−1.0代表内镶嵌性文化。

染色体:地区 Cytoband 大小(Mb) #探针 Amp /德尔 H9 P35区域 日志 2 比 H9 P59 日志 2 比 注释
Chr1: 224141493 - 224195678 q42.12 0.054 14 Amp 0.528 0.632 LEFTY1、PYCR2 LEFTY2
Chr6: 31663619 - 31691605 p21.33 0.028 3 Amp 0.686 1.220 LST1、NCR3 AIF1
Chr12: 21580165 - 22105263 q12.1 0.282 12 ▽ −0.495 −0.480 GYS2、LDHB KCNJ8 ABCC9,服务
Chr14: 62486603 - 62852257 q23.2 0.366 7 Amp 0.560 0.432 KCNH5、RHOJ GPHB5
Chr17: 35097815 - 35153082 12个 0.055 15 Amp 0.469 0.485 PERLD1、ERBB2 C17orf37 GRB7
3.4。改进的微分EBs Laser-Mediated通道后生成的潜力

为了测试这些细胞的分化潜能,在体外分化化验的人类则使用laser-mediated通道(160后进行传播 μ米部分)或酶。通道的细胞则通过方法有效地形成悬浮培养良好定义的拟胚体,进而分化成内皮细胞衍生品的所有三个主要胚芽层包括(Sox17,法新社),中胚层细胞/心肌细胞(brachyury, α mhc)和外胚层的细胞/神经元(Map2巢蛋白,补充图3),形态分析结果EB人群表明,EBs laser-passaged产生更均匀的细胞则产生大小比酶通过万能(图 5(一个))。量化这些观察,结果EB的直径人口使用图像获得的手动测量悬浮培养的第4天。如图 5 (b),laser-mediated通道导致更均匀EBs (374±56 μm;CV 15%)比酶通过通过胶原酶(336±145 μm;简历)或43%胰蛋白酶(158±85 μm;54%的简历)。统计方差分析表明,使用干细胞生成EBs laser-mediated文化传播的通道均匀得多( P 值< 0.0001)比EBs使用酶生成通过文化,证明laser-mediated通道的结果比其他方法更一致的EB文化。

多项研究表明,异质性在人类ESC殖民地产生大小和EB骨料粒度变化在分化实验结果和分化显著降低收益率( 23- - - - - - 26]。EB同质性分化潜力的人类的影响到心肌细胞的细胞则是检查。EBs生成使用iPSC殖民地形成laser-mediated通道(160后5天 μ米部分)或酶。EBs都使用标准的多级协议分化,越来越多的EBs在悬浮培养贴壁细胞培养4天之后的一个额外的18天( 27]。心肌细胞分化潜能分析了22天的区别承包EBs的手工计算。EBs使用酶产生通道则产生了一小部分打EBs(~ 7%),而laser-mediated通道则导致(~ 60%)的比例明显高于承包EBs(图 5 (c))。存在分析证实这些结果与EBs产生laser-mediated通过文化展示3 - 51-fold更高的心肌细胞基因的表达, Nkx2.5, Actn1( α 辅肌动蛋白), Mef2C, Myh6( α mhc), TnnI3, NppA( Anp),比EBs产生胶原酶通过文化(图 5 (d))。同样,采用免疫分析表明,EBs产生laser-mediated通道包含更多的心肌细胞的细胞则在每个EB(即。,EBs包含更多的细胞染色阳性心肌细胞标记)比EBs产生胶原酶通过细胞( α mhc和 α 辅肌动蛋白如图 5 (e))。EBs来自包括所有人口呈阳性标记测试 α mhc, α 辅肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和NPPA(数据没有显示)。

进一步分析EB同质性对分化的影响潜力,EBs产生iPSC殖民地形成laser-mediated通道(160后5天 μ部分)或酶通过分化成神经圆花饰使用修改后的多步协议。能够分化成神经花结分析了11天的分化手动计数EBs包含≥1神经玫瑰。EBs用laser-mediated通道则导致95%的EBs包含神经圆花饰,而胰蛋白酶、胶原酶生成的EBs通道产生的细胞则只有29%和32%的EBs包含神经圆花饰,分别(数据没有显示)。这些数据显示增加的同质性在人类iPSC殖民地和合成EBs则导致分化显著增加产量。

探讨EB的影响大小分化潜力的人类细胞则被检查。则被laser-mediated传播通道变截面尺寸(80、160和240 μ米的部分)。五天后,EBs是生成和分化成心肌细胞如上所述。齐次EB种群大小不同的CVs(≤15%), 278年,418年和528年 μ米直径,产于80年,160年和240年 μ米节大小,分别(补充图4)。心肌细胞分化潜力的分析表明,EBs生成的从160年的55% μ米部分收缩,而只有38%和21%的EBs来自240年 μ米和80 μ米部分收缩。综上所述,这些数据表明,增加人类iPSC殖民地和合成EBs,同质性以及EB大小,显著提高万能干细胞的分化产生。可再生产地生成统一的能力,size-specific殖民地后来导致更均匀,size-specific EB人口减少变化实验,提高差异化收益率ESC和万能到专门的细胞类型。

 4所示。讨论

缺乏标准化通过干细胞的技术来源和传播是一个主要限制在干细胞领域。因为人类干细胞文化普遍协议没有被采用,目前很难比较和解释科学数据在不同条件下细胞培养。通过方法大大蒙羞的理解内部差异和铁路联运的差异基因表达数据,表达干细胞lineage-associated标记,microrna的签名,和表观遗传资料 28- - - - - - 31日]。尽管人类ESC行不同的基因型,不太可能报道不同的细胞系(例如,65%基因表达数据跨两个ESC)的变化可以归因于遗传变异,< 2%基因表达的变化被发现在成人组织中不同个体的 28, 32, 33]。同样,差异与分化相关协议和报道干细胞的分化能力和效率为专门的细胞可能是由于缺乏标准化( 34]。采用标准化的协议应该大大提高测定固有的遗传变异的作用,环境,和/或程序性影响干细胞质量、自我更新,多能性和分化潜能。

Laser-mediated通道提供了一个新颖的方法来扩大人类的ESCs /万能干细胞可用于创建标准化的、可追溯的生产过程没有要求酶GMP-quality干细胞系。该方法结合了手动的好处和酶技术,通过允许高效、自动化的未分化的干细胞使文化为统一尺度干细胞部分在一个无菌封闭的环境。Laser-mediated通道兼容多种文化的方法包括动物任意feeder-free-based条件,和无血清媒体定义的条件。值得注意的是,这种方法并不是容易inter-individual变异减少熟练技术人员需要创建高质量的干细胞的文化。

Laser-mediated通道不涉及酶的使用,因此最好保持人类的ESCs的遗传稳定性,则在长期文化(3 - 12个月, 10- - - - - - 14])。ESCs的结果表明,H9保持一个稳定的核型在六个月内(> 24通道)。更重要的是,laser-mediated通道没有诱导subkaryotypic改变随着时间的推移在H9 ESCs(6个月,则(2.5个月))由aCGH监控。aCGH更敏感的数据表明laser-mediated通道保持人类的ESCs /万能的遗传完整性。重要的是,遗传异常检测H9 ESCs后连续使胶原酶在同一时期。结果还表明,人类则和ESCs传播使用laser-mediated通道保持正常干细胞形态和继续stem-cell-associated高水平表达的基因和蛋白质。尽管畸胎瘤分析没有进行这些细胞,体外分化分析laser-mediated通道则展示了细胞自发分化成衍生品的所有三个主要胚芽层,可能分化成心肌细胞和神经圆花饰。此外,则由laser-mediated传播通道已经分化成运动神经元,RPE细胞,内胚层祖细胞,和hepatocytes-like细胞(数据未显示);综合这些数据表明laser-mediated通道不影响干细胞多能性。同样,laser-mediated通道没有改变干细胞的增长率或增加表达凋亡标记,所有支持激光切片并不影响干细胞质量、自我更新,或多能性。

Laser-mediated通道提供干细胞群体大小的控制。定期通过时间表可以建立断面尺寸的选择。~ 200的断面尺寸 μm使得常规分割所有ESC / iPSC线每7天,允许更有效的计划的实验。整体通行效率85%的结合更加统一的部分尺寸(20%的简历),使更大比例的ESC / iPSC殖民地为文化扩张减少板所需的维护。兼容传统的机器人系统使文化需求的可伸缩性。此外,控制输入部分大小的能力,尤其是较小的尺寸,允许更有效的创造干细胞殖民地多井板块大规模试验和筛选的目的。干细胞断面尺寸也可能影响低温贮藏和转基因效率的ESCs和万能 35- - - - - - 38]。

Laser-mediated通道包括解剖整个系统没有尊重殖民地的边界。的未分化的干细胞文化很容易传播使用这种技术。新派生ESC / iPSC文化,早期通过ESC / iPSC行,或不稳定行,往往有更多的自发分化,手动选择的组合或激光净化殖民地laser-mediated通道将推荐紧随其后。这种方法的一个比较重要的结果表明,随着时间的推移,干细胞文化(特别是早期通过这往往更容易分化的细胞则比后来通道,更成熟的ESCs)的高质量比由胶原酶治疗。很可能通过齐次部分很重要,保持未分化的干细胞的分化和限制殖民地。因此,潜在的早期通过ESCs /万能将需要更少的使用laser-mediated通道隔离前殖民地扩张。

之一,更重要的是这项研究的结果表明,统一的人类iPSC殖民地laser-mediated通道后导致产生更均匀的EBs,大小和形状,以更大的分化效率比典型的EB文化源于酶通过文化。EBs产生laser-mediated通道则导致显著增加心肌细胞产生,高达8.5倍击败发病率比EBs产生胶原酶通过万能。的能力可重复使用laser-mediated生成统一的殖民地通道导致EBs更加统一的大小和形状会减少变化实验,提高差异化收益率ESC和万能到专门的细胞类型。这些收益增强可以显著降低成本的干细胞实验的劳动力和材料。潜在的,统一的集落形成也会增加干细胞分化的产量在执行(即直接分化过程。,没有一个EB中间)。

 5。结论

总之,适当的维护人类干细胞是必不可少的成功利用ESCs和万能工具在发展和药物发现研究和再生医学。标准化对未来所有的干细胞的应用至关重要和必要的,为了充分理解这些细胞的潜力和观察到的差异在不同的干细胞系之间的ESCs和万能。Laser-mediated通道是一个创新的方法来维护和扩张的干细胞系,不引入遗传不稳定,一般适用于所有的细胞系和所有技术人员无论技能。这种方法提供了一个高效、标准化的协议为人类的ESCs的传播和万能,这将显著减少干细胞领域内的矛盾和可变性。Laser-mediated通道可溯性并确保可再生的干细胞系的生产根据标准操作程序,所有这些都需要制造干细胞在临床/治疗应用程序使用。

 作者的贡献

c . Peterson和a .桑德拉让同样的贡献。

 确认

作者要感谢a .艾略特与aCGH实验寻求帮助,和m·科勒,f . Kamme和a·派尔的建议和评论。的 α mhc(由费奇曼,当时求职中介D.A.)和SSEA4(由你开发,D /诺尔斯、博)抗体从发育研究杂种细胞获得银行的赞助下研究所开发和维护由爱荷华大学生物学系,爱荷华州的城市,美国。

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