SCI 干细胞国际 1687 - 9678 2090 - 966 x Hindawi出版公司 920581年 10.1155 / 2012/920581 920581年 研究文章 多能间充质镀全骨髓基质干细胞扩张的低细胞密度:一个更有利的方法应用于临床 Mareschi 凯蒂 1、2 Rustichelli 黛博拉 1 花茎甘蓝 罗伯特。 2 Gunetti 莫妮卡 1 Sanavio 工作程序 1 Castiglia 莎拉 1 Risso 亚历山德拉 3 费列罗 伊凡娜 1、2 Tarella 柯拉 3 Fagioli 语言 1 Schlenke 彼得 1 干细胞移植和细胞治疗单位 儿科Onco-Hematology部门 Regina玛儿童医院 10126年都灵 意大利 2 儿科 都灵大学 广场波罗尼亚94年 10126年都灵 意大利 unito.it 3 分子生物技术中心 都灵大学 P。咱波罗尼亚94年 10126年都灵 意大利 unito.it 2012年 15 10 2011年 2012年 13 05年 2011年 01 08年 2011年 2012年 版权©2012凯蒂Mareschi et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

间充质干细胞(msc)是一种很有前途的来源细胞疗法因其多能性和immunomodulant礼节。“最优”的识别条件一定要确定一个标准程序供临床使用。镀Percoll,聚蔗糖和全骨髓直接从相同的样品测试分离方法。细胞被播种在以下密度:100 000,000,1000,100,10细胞/厘米2。达到融合后,这些细胞被分离,汇集和re-plated 1000, 500, 100, 10细胞/厘米2。统计分析。累积人口倍增(PD)没有显示显著差异的分离方法和播种密度只有电镀密度。一些少量样品镀在T25烧瓶电镀密度为10和100个细胞/厘米2没有产生任何扩张。然而,直接镀全骨髓导致一个更有利的方法CFU-F数量而言,细胞生长和最小的操作。没有观察到的差异的总形态、分化潜能或immunophenotype。这些数据表明,镀全骨髓细胞低密度扩张可能代表一个好的程序MSC供临床使用。

 1。介绍

近年来,大量的研究表明,间充质干细胞(msc)代表一个有吸引力的选择新的治疗方法,因其可塑性和细胞分化的潜能。msc多功能干细胞能够分化成不同的血统包括中层、外胚层和内胚层的类型细胞( 1- - - - - - 4]。msc可以很容易地孤立的能力遵守塑料生成single-cell-derived殖民地( 5, 6),可以扩展到获得高数量的细胞在细胞和基因治疗临床使用的人类疾病( 1]。

几种方法描述了从骨髓(BM)分离msc,包括使用immuno-magnetic珠子、密度梯度分离,直接镀BM [ 2, 7- - - - - - 11]。密度梯度聚蔗糖或Percoll离心等常用分离msc从人类BM [ 2, 8, 11, 12)而直接电镀是常用的细胞从老鼠 10],老鼠[ 13),和兔子 14可用的BM有限)。造血的污染,由于巨噬细胞,内皮细胞和淋巴细胞也坚持塑料,常出现在早期BM单层( 2, 15]。然而,只有呈纺锤状细胞增殖,形成殖民地称为集落形成unit-fibroblasts (CFU-Fs)代表更高msc增殖细胞( 6, 16]。隔离和扩展协议的基础上,CFU-Fs产生msc与不同的增殖和分化潜能可以是微妙的或重要的 9, 17]。细胞治疗的国际社会提出的三个最小的标准来确定msc(缩写用于指示 多能间充质基质细胞):(1)坚持塑料;(2)特定的表面抗原表达(积极性CD105, CD73, CD90、CD45缺乏表达CD34, CD14、CD11b CD79a CD19和HLA二类;(3)多功能能力分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞在标准 在体外区分条件( 18]。

MSC移植的安全性、可行性和效率为临床使用目前研究的对象,以及几个协议使用数量极高的MSC(直到109),“最佳”条件的识别 在体外细胞培养也应该调查。

隔离方法,包括媒介、塑料、播种密度、生长因子,和化学物质,影响扩大,msc分化,免疫原性的性质。此外,供者年龄和疾病阶段( 19, 20.)也可以影响MSC产量、增殖率和分化潜能。BM msc通常从BM分离单核细胞后得到梯度分离和能力坚持塑料。

Percoll,悬浮胶体二氧化硅粒子,广泛使用在不同密度分离细胞、细胞器、病毒和其他亚细胞粒子,或聚蔗糖聚合物蔗糖,传统上用于分离单核细胞和淋巴细胞,都是使用密度为1.073克/毫升( 2, 21- - - - - - 23)和1.077克/毫升( 24- - - - - - 26),分别分离msc增殖和分化潜力高。

在这项研究中,使用相同的BM样本,我们从健康的捐赠者分离msc使用不同方法分离和扩张。我们使用聚蔗糖、Percoll和直接镀BM的分离方法和测试不同的播种和电镀细胞密度来验证最好的方法获得大量的msc供临床使用。

 2。材料和方法 2.1。收获和msc的准备

骨髓(BM)细胞收获从髂嵴的成人或儿童白种人捐赠者进行了骨髓后收集相关病人知情同意。当可用时,我们也使用了一种过滤骨髓收集袋(美国百特医疗公司,IL)通常被丢弃之前注入大英博物馆。袋子与磷酸盐缓冲盐水洗3次(PBS) 1 x (Lonza, Verviers,比利时),和细胞收集200克10分钟。整个BM数的整除,直接镀在MSC介质(Lonza, Verviers,比利时)含10%胎牛血清(的边后卫)各种密度T25 o T75烧瓶血压得到较好的控制(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。大英博物馆的剩余部分样本分成2部分Percoll和聚蔗糖梯度分离。这些细胞被分层Percoll(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)梯度(1.073 g / mL密度)根据以前报道的方法 20.)和聚蔗糖(Biochrom,弥尔顿路,剑桥,英国)梯度(1.077 g / mL密度)。细胞离心机在30分钟,1100克和400克分别为30分钟。在间期细胞恢复,洗两次与PBS 1 x(10分钟)200克、播种在MSC中含有10%的边后卫和维持在37°C和5%公司的氛围2在以下密度:100 000,000,1000,100,10细胞/厘米2。5天之后,不依从细胞被移除和ref每3 - 4天,当他们到达融合,他们分离,集中,和山肩3 - 5通道1000,500,100,10细胞/厘米2。

 2.2。MSC分析

细胞计数和分析在每个通道细胞增长,可行性和immunophenotype cytofluorimetric分析。

 2.3。MSC单独使用和扩散的潜力

单独使用潜在的分离msc 3种不同BM分数(BM,单核细胞(跨国公司)分数后聚蔗糖和Percoll梯度)被fibroblastic-colony-forming单元测试(CFU-F)测定。细胞在不同播种密度和媒介改变了每3 - 4天。MSC克隆细胞前体(CFU-F)得分2周后,宏观上和集群的50多个细胞被认为是殖民地。所有的实验都是在重复执行。

平均而言,CFU-Fs被两个不同的运营商统计。CFU-Fs被表示为成纤维细胞的克隆获得的起始细胞室整个BM。

msc的细胞膨胀增长速度是评价细胞计数在每个通道和伯克室表示人口翻倍(PD)使用公式 日志 N / 日志 2 ,在那里 N 的手机号是汇合的单层细胞的数量除以初始种子( 20.]。

 2.4。Cytofluorimetric msc的分析

贴壁细胞的识别是由流式细胞术分析。在每个通道,200 000 - 500 000细胞被染了20分钟了。反CD105 PE (Immunostep年代。L,萨拉曼卡,西班牙),CD45 FITC, CD14 PE、CD73 PE、CD44 PE、CD29 FITC(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲),CD105 PE、CD166 FITC, CD90 FITC、CD106 PE(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。标记细胞彻底清洗和PBS 1 x和分析FACScanto II (Becton Dickinson)天后软件程序。阳性细胞的百分比计算使用细胞染色和搞笑FITC /聚乙烯作为一个消极的控制。

 2.5。分化潜力分析

分化实验,从1日到5日段落msc在成骨的培养,脂肪形成的和chondrogenic介质(Lonza)根据制造商的指示。短暂,20 000和50 000细胞被镀在T-25瓶骨生成和脂肪形成的文化条件,分别使细胞坚持文化在MSC介质表面24小时(Lonza)。诱导骨生成和脂肪生成,介质被替换为具体的完整的感应介质(Lonza)。后21天,成骨分化由钙积累证明(由冯Kossa染色羟磷灰石晶体检测)在分离细胞镀室幻灯片在相同的培养条件。

脂肪形成的差异化,脂肪形成的诱导和维护媒介或者使用每3 - 4天,细胞内脂质囊泡的存在2 - 3周后可见的文化被油红O染色评估。

chondrogenic分化的整除250 000个细胞被洗两次完整chondrogenic介质(Lonza) 15毫升聚丙烯管文化。最后,这些细胞被resuspended完全chondrogenic介质,离心机,没有吸气thesurnatant,管在37°C在湿润的气氛中孵化有限公司5%2。Chondrogenic分化是由于细胞的生长细胞聚集在悬浮培养自由浮动与转化生长因子- beta3 (TGF)。颗粒是包含在石蜡和阿尔新蓝染色鉴定透明质酸和唾液黏蛋白的存在。

 2.6。端粒长度(TL)评估

TL评估是由印迹(某人)分析所描述的其他地方 27]。简单地说,22日 μ 20 g的DNA被混合消化HinfI (U)和RsaI (20 U)(罗氏诊断,曼海姆,德国)和孵化为2 h(图37岁 5)。产生的DNA片段然后在0.8%琼脂糖凝胶电泳分离1 x TAE运行缓冲和5 μ溴化乙锭的L。分离DNA随后被转移到一个带正电的尼龙膜(RocheDiagnostic曼海姆,德国)。一夜之间传输之后,为了修复DNA片段细胞膜被暴露在紫外线10分钟。杂交与TeloTAGG端粒长度进行了分析工具(罗氏诊断,美瀚,德国)。

膜被淹没在prehybridization溶液,然后孵化的杂交方案(2 μL的digoxigenin(挖)标记telomere-specific探测解决方案添加到prehybridization) 3 h 62°C。然后,膜与DNA片段与端粒与digoxigenin-specific抗体共价耦合探针被孵化,碱性磷酸酶(美联社)。

使用美联社代谢CDP-Star结果可视化,高度敏感的化学发光底物。

x射线胶片的光信号被记录(Lumi-Film化学发光检测电影,罗氏诊断,曼海姆,德国)和扫描进行分析。

中位数TR长度计算使用软件数量一Biorad(英国)赫默尔亨普斯特德镇。

 2.7。统计分析

细胞生长数据分析SPSS 15为Windows (SPSS . n:行情)、芝加哥、IL)。结果表示为中位数和范围。配对样本之间的差异被弗里德曼的评估测试( 28, 29日)和事后多重比较分析使用最少的显著差异(LSD)方法。

统计测试都是双边和重大 P 值< 0.05。

 3所示。结果 3.1。MSC收获和准备

十捐赠者的骨髓样本收集:3除以18岁(年龄范围:39-50年)(2男1女)和7(所有男性)年龄小于18岁(年龄范围:-10 - 0.5年)。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。整个BM数和种子实验;其余的部分样本分成相等的分数MSC分离聚蔗糖和Percoll分别。最初的中值梯度分离细胞数量是69×106(范围:21 - 82×106),分离后,分别总回收率与13.5%和15.7%后聚蔗糖和Percoll(中值;聚蔗糖范围:5.0 - -18.9%,Percoll: 1.0 - -28.8%)。这些数据表明,聚蔗糖之间没有差异和Percoll隔离后的细胞计数和恢复。

 3.2。MSC隔离

贴壁细胞中观察到所有的样品后3 - 5天的文化和在接下来的2周一个附着单层。大英博物馆细胞迅速生成一个支流层细胞细长,成纤维细胞的形状。每个通道的可行性一直超过98%。没有形态差异观察msc隔绝整个BM,聚蔗糖和Percoll,但当通道细胞早期与晚期通道细胞相比,msc表现出不同的形态。细胞在大小和显示多边形形态明显增加丝在细胞质中特别是当孤立于成人的捐助者。

 3.3。MSC分析

分析了msc与健康的捐赠者第一3段落中间间隔一段和下一个16天(范围:7-40)。我们观察到异构MSC准备和一个独特的人口纺锤形或平面MSC在烧瓶,虽然没有观察到的形态差异3准备(聚蔗糖、Percoll和整个BM)。图 1显示了不同的克隆方法10天后从不同播种密度。7的文化中我们没有观察到在文化种子10和100个细胞克隆。有趣的是,我们观察到的克隆在较低密度仅在3样本获得的冲刷丢弃BM收集袋和过滤器。此外,这些样本来自儿童患者。

表型不同的克隆Percoll后观察,聚蔗糖梯度分离和BM 10天在不同播种密度。

分离后,细胞山肩1000,500,100,10细胞/厘米2形成克隆达到融合在一个中等的16天(范围:7-40)。细胞池和山肩第二和第三段落也形成克隆的所有准备工作。图 2在第二个通道显示了克隆从电镀后7天。

表型不同的克隆Percoll后观察7天,聚蔗糖梯度分离和整个BM电镀。

为了比较三种不同的分离方法和不同密度的影响在msc的增殖能力,3 BM镀样本确定CFU-F频率。CFU-F数量计算相对于最初的细胞数量在大英博物馆的示例,通过比较3分离方法。结果如下:整个BM显示中值104.4 CFU-F(范围:7.2 - -179.7)/ 106细胞;聚蔗糖和Percoll分离后,BM显示值为3.8(范围:2.7 - -49.8)和0.1(范围:0 - 16.4)CFU-F每106。我们观察到细胞的数量没有直接相关性镀和CFU-Fs清点的数量分析密度的影响。特别是,种植的100,1000,000,100 000细胞/厘米2,我们观察到一个值为0(范围:0 - 0),0(范围:0.0 - -44.4);6.2(范围:0.7 - -104.0);62.5(7.4 - -111.7)和11.3(3.1 - -13.8),分别。显著差异被发现在种植10点10 000年和100年000细胞/厘米2100与000细胞/厘米之间2与000和000。三种不同的分析分离方法和不同播种密度,考虑到所有值的总和获得整个BM,聚蔗糖和Percoll ( N = 10 ),如表所示 1(一个),每个密度的所有值的总和,如表所示 1(b),并没有显示出显著不同的增长速度值在第一段( P = 0.49 和 P = 0.51 、职责)。

的分析分离方法和不同播种密度的影响。

分析不同密度对播种(第一段)的影响。

N = 10 整个BM 聚蔗糖 Percoll
中位数 8.56 1.76 i =
极小的东西 点 16 〇〇
格言 419.23 111.18 433.26

分析不同密度对播种(第一段)的影响。

N = 10 10细胞/厘米2 100细胞/厘米2 1000细胞/厘米2 10 000个细胞/厘米2 100 000个细胞/厘米2
中位数 〇〇 2.33 2.66 1.64 .41点
极小的东西 〇〇 〇〇 〇〇 .20 .14点
格言 531.34 205.20 29.12 5.96 5.52

的分析分离方法对播种的累积PD的影响。

1号通道
N = 4 ( P = 0.653 ) 整个BM 聚蔗糖 Percoll
中位数 3.11 3.12 2.62
极小的东西 1.99 56 1.92
格言 5.53 3.89 3.84
2号通道
N = 4 ( P = 0.931 ) 整个BM 聚蔗糖 Percoll
中位数 4.55 2.68 5.88
极小的东西 11.41 7.62 8.00
格言 6.67 7.16 6.47
第三段
N = 4 ( P = 0.528 ) 整个BM 聚蔗糖 Percoll
中位数 10.13 10.50 8.81
极小的东西 8.60 5.07 8.03
格言 15.66 11.11 12.14

4日样本,可以执行一个完整的分析的累积PD从1日到3日的段落,和结果表明,BM总是显示一个更有利的经济增长相比,聚蔗糖和Percoll分离即使统计分析显示无显著差异( P = 0.653 ; P = 0.931 和 P = 0.528 在第一,第二和第三的段落,职责)。

我们没有观察MSC克隆在超过一半的主要文化播种10和100个细胞/厘米2最后分析,这些密度被排除在外。在第一段,我们观察到的一个重要统计种植在1000和000之间的区别( P = 0.028 ),而不是000年和100年之间的000细胞/厘米2。

分析电镀10点密度的影响,100年、500年和1000年细胞/厘米2在第一,第二,第三段是总结表 3。特别是,我们观察到显著统计学差异在第二段电镀10 500年和1000年相比,细胞间/厘米2第二和第三段( P = 0.001 和 P = 0.017 )。

分析累积PD的播种密度的影响。

1号通道
N = 4 ( P = 0 。 068年 ) 10细胞/厘米2 100细胞/厘米2 500细胞/厘米2 1000细胞/厘米2
中位数 5.28 3.27 2.08 2.28
极小的东西 2.49 .68点 算下来 1.39
格言 5.57 4.65 3.07 2.63
2号通道
N = 4 ( P = 0 。 001年 ) * 10细胞/厘米2 100细胞/厘米2 500细胞/厘米2 1000细胞/厘米2
中位数 10.45 6.82 4.48 4.48
极小的东西 8.33 4.76 2.90 2.88
格言 12.06 10.15 6.99 5.94
第三段
N = 4 ( P = 0 。 017年 ) * 10细胞/厘米2 100细胞/厘米2 500细胞/厘米2 1000细胞/厘米2
中位数 14.85 9.89 8.14 6.37
极小的东西 13.41 6.78 3.82 4.92
格言 18.78 13.69 9.84 8.52
3.4。可行性评估

台盼蓝染色分析显示98% - -100%之间的可行性的分析样本与这两组之间没有差异。同样的结果被证实在cytofluorimetric 7 aad染色后分析。

 3.5。Immunophenotype通过流式细胞术分析

在1日3通道,分析了细胞在每个通道CD45的表达和CD14造血的表面抗原;CD90;CD29、CD44;CD105;存在、CD106 CD73。在第一段,msc隔绝整个BM CD45, CD14 -与抗原表达不到5%(中位数为3.0%的0.0 -6.5%和3.5% 0.0 - -7.0%的范围,职责),当他们表现出的高表达CD90(中位数为90.0%,范围:65.0 - -93.5%),CD29(中位数为78%,范围:61.0 - -97.0%),CD44(中位数为83.0%,范围:65.0 - -99.0%)和CD105(中位数为90.0%,范围:65.0 - -95.0%)和较低的表达、CD106 CD166粘附分子(中值的63%范围为2.4 -88.0%和54% 53.0 - -96.0%的范围,职责)。MSC聚蔗糖和Percoll隔绝,在第一段immunophenotype显示弱造血污染因为CD45表达式的中位数为7.5%(范围:0.0 - -48.0%)和6.0%(范围:1.0 - -44%),分别因为CD14的表达式是5.0%(范围:0.0 - -35%)和4.0%(范围:0.0 - -24%),分别为聚蔗糖和Percoll分离方法。高水平的CD90、CD29、CD44和CD105 CD106比例值超过80%,变量的观察和存在没有显著差异即使在细胞聚蔗糖和Percoll隔开。在图 3抗原中值表达式,分析了在第一通道细胞隔离通过3种不同的方法(一个池的不同播种密度)作为柱状图表示。在扩张期间,msc造血抗原是阴性,而在每个通道他们表达CD90百分比高,CD73, CD29、CD44、CD105阳性细胞与抗原表达中值被超过80%。

Immunophenotype msc Percoll后隔离,分析聚蔗糖梯度分离和整个BM在第一通道。

 3.6。分化潜力分析

所有样品诱导分化与特定介质显示multi-potential能力因为所有的msc、独立的分离方法和播种和电镀密度,分化为成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞,如图 4。2文化中msc隔绝整个BM在第一段,我们观察到一些克隆的自发存在的脂肪形成的成骨细胞的细胞,分别(数据没有显示)。

分化的msc孤立Percoll后聚蔗糖梯度分离和整个BM在第三段。

端粒限制片段(基金会)测量通过印迹分析在一个有代表性的实验细胞分离后Percoll和聚蔗糖梯度分离和整个BM在第三段。

 3.7。端粒长度分析

我们分析了9个样品从小儿健康的捐赠者的BM(男性和女性);msc用于分析都是在3日播种通道和通过聚蔗糖( N = 3 ),Percoll ( N = 3 ),直接整个BM电镀( N = 3 )。

我们观察到平均11543 pb(范围:12181 - 11504 pb), 12906(范围:13406 - 12016年),和10725 pb(范围:12060 - 10578 pb),分别percoll,整个BM,聚蔗糖。

 4所示。讨论

近年来,许多见解MSC生物学,以及他们的免疫调控礼节和再生潜能,提供了支持考虑MSC适合细胞再生医学治疗,癌症基因治疗和免疫疾病的治疗。

尽管msc的文化研究在过去的30年里,标准标准隔离并描述这些多功能干细胞尚未被开发。

描述了几种方法为临床应用丰富BM msc。在这项研究中,我们测试了,从相同的样本,3种不同的隔离方法和几种不同的播种和电镀的细胞密度。我们分析了细胞增长,CFU-Fs, immunophenotype和细胞分化潜能孤立文化确定最优文化条件隔离并扩大临床应用的msc。

msc孤立的坚持塑料文化表面特征属性定义良好的许多调查人员( 6, 30.]。因此很难比较不同实验室的数据从不同的隔离和扩张方法和细胞内的高可变性的文化。通常可以注意,在文化存在两个形态不同的细胞( 6, 30., 31日]:I型细胞纺锤体形状和生长迅速,广泛和II型细胞和生长缓慢。此外,在我们的实验中,我们观察到通道的数量越大,越高II型细胞数量的增加。我们还观察到细胞中间形态。其他作者也表明人类msc的样本取自髂骨吸入等文化差异很大的可扩展性( 32]。变化并不是解释为捐赠者的性别或年龄,也不是解释为有核细胞样本的数量,但显然反映了抽样的变化从髂骨骨髓吸入物,因为两个样本之间的差异被认为在同一时间从同一志愿( 32]。msc出现复杂的建筑结构的血管周的细胞不完全分离骨髓从毛细血管 30.],msc的收益率明显随吸入这种建筑结构的存在的网站。

我们观察到分离方法无显著差异,因为msc Percoll隔绝,聚蔗糖,或整个BM显示形态学方面的显著差异,增长率在第一通道,累积PD, immunophenotype和细胞分化的潜能。描述性分析,然而,显示主要的细胞增长的绝对值和未成年人造血污染在第一段整体BM而不是Percoll或聚蔗糖。

的可扩展性MSC文化可能是可预测的,而不是从最初的增长率在第一或第二通道,但cfu的分析的基础上 6, 25, 33),我们执行CFU-F分析比较三种不同分离方法的效果在不同细胞播种密度。考虑初始细胞数量在大英博物馆样例中,我们获得了更高的CFU-F整个BM条件而不是梯度分离后。

此外,有趣的是,msc隔绝整个BM的端粒长度超过msc隔绝Percoll和聚蔗糖方法。因此,通过培养整个细胞BM我们可能孤立更加不成熟的msc。后一个方面值得进一步研究。

尽管MSC隔离和扩张的GMP生产梯度媒体最近报道( 34),本研究证实,直接镀BM方面提供了更有利的方法CFU-F数,最小的操纵,造血污染,和细胞增长(描述性分析)。我们的结果(如最近也被描述由卡佩里et al。 35和卢基尼等。 36)表明,整个BM分离方法代表了一个好的程序MSC扩张相比,临床使用MSC通过梯度分离。标准化的方法隔离和扩张,最合适的细胞条件应该用于所有样本。因此我们排除播种10和100个细胞/厘米2克隆,因为我们观察MSC在不到一半的主文化,然而,在第一段,我们观察到显著统计学差异种植在1000和000,而不是000年和100年之间的000细胞/厘米2。CFU-F计数明显高于10 000细胞/厘米2,因此使用这种播种密度可能是最有利的条件。在这播种密度、10毫升BM示例,它包含大约1亿个白细胞,需要10 000厘米2或16 T630厘米2细胞工厂(烧瓶用于大规模细胞培养)。这些文化的融合时间是2到6周仅需要媒体的变化和可能提供,在第一段,蜂窝产品的可用性(约1.6亿个细胞)供临床使用。提出的过程将提供大量的细胞从少量的BM。病人会因此只接受BM切片和非侵入性手术如大英博物馆收藏。

结果细胞增长的累积PD其他作者的数据证实,电镀密度低导致更高的收益率和msc的速度扩张 6, 19, 24, 33, 37]。我们观察到小纺锤状细胞在某些文化中变得更加快速镀低密度。但是,如果msc孤立在第一通道主要是广泛和不均匀,扩张缓慢,细胞衰老镀低密度。MSC的其他方面 在体外老化时观察到的细胞被镀在较低密度(10100)后4 - 5个段落(数据没有显示)。

此外,我们观察到的克隆在较低密度仅在3样本获得的冲刷丢弃骨髓收集袋和过滤器。这些结果证实了这些解释为卡佩里et al .,也就是说,过滤器的过滤结果优先捕获hMSC前体具有良好的增殖潜能,与这些细胞的顺向浓缩的冲刷而BM。

总之,我们观察到,在协议与其他组织在这个领域拥有广泛的经验,( 33, 38- - - - - - 40),MSC人口具有不同曲目的不同的亚种群,其增殖、免疫和生物礼仪仍然是不确定的。Phinney [ 40]证明了这些潜在的生物化学异质性,而不是他们的茎状的品格,更重要的是有助于治疗msc的潜力。

据我们所知,这是第一个比较研究不同的隔离和扩张有或没有梯度分离方法。因此,整个BM的镀低细胞密度可能代表一个更有利的过程为临床使用MSC扩张相比,梯度分离获得的MSC。

 利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。

 确认

作者感谢安德鲁·马丁•加维(荣誉)文学士学位,LTCL (TESOL), PGCPolSci,社论援助。这项工作是支持由网Oncologica德尔皮埃蒙特e德拉瓦莱达奥斯塔,MIUR 2005 f . Fagioli。

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