SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 761843年 10.1155 / 2012/761843 761843年 研究文章 对猪腹侧中脑的前体细胞后长期在3 d文化传播 詹森 Pia年代。 1 Lyck 丽丝 1、2 詹森 Pia 1 齐默 延斯 1 迈耶 Morten 1 Borlongan 切 1 系神经生物学研究 分子医学研究所 南丹麦大学 5000欧登塞C 丹麦 sdu.dk 2 康乐保丹麦 Humlebæk Holtedam 1 - 3 3050 丹麦 2012年 20. 11 2012年 2012年 21 03 2012年 04 09年 2012年 2012年 版权©2012 Pia s . Jensen et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

predifferentiated的潜在使用神经前体细胞治疗神经系统疾病如帕金森病结合干细胞研究与先前的实验和临床移植发展中多巴胺能神经元。然而,目前的障碍之一是缺乏长期后生成多巴胺神经元的能力 在体外细胞的繁殖。国内的猪被认为是一个有用的大型动物模型非灵长类神经科学,因为更好的相似性较大的gyrencephalic猪脑人类大脑比常用的小型啮齿动物的大脑。在目前的研究中,猪胚胎(28 - 30天),腹侧中脑的前体细胞被孤立和传播作为自由神经组织领域中含表皮生长因子和纤维母细胞生长因子2。为使组织切成球体,避免机械或酶分解,以减少细胞损伤和保护细胞间接触。球体是传播长达237天的分析在不同时间点细胞内容和分化。我们的研究提供了第一个证明猪腹侧中脑的前体细胞可以作为神经组织长期传播领域,从而提供一个实验3 d 在体外模型研究的神经前体细胞,他们的利基,分化能力。

 1。介绍

帕金森病(PD)的特点是一个进步的多巴胺能神经元的损失在腹侧中脑黑质(VM)。疾病是临床上表现为严重的运动障碍,包括肌强直、震颤、动作迟缓,有时失去活动能力( 1]。实验动物和临床研究使用人类胎儿VM组织表明,intrastriatal移植多巴胺能神经元可能是一个有效的治疗PD患者( 2- - - - - - 4]。然而,低可用性的人类胎儿组织,其采购和使用相关伦理问题,有限的嫁接多巴胺能神经元的存活和集成,并高度变量捐赠组织的发展阶段已经限制了临床应用 5]。

许多研究在哺乳动物的大脑神经源性两个方面特征,subventricular区(SVZ)衬砌外侧心室( 6和海马齿状回的 7]。前体细胞与神经性潜在的存在也被报道为发展中( 8- - - - - - 10)在某种程度上成人( 11- - - - - - 15腹侧中脑。这样的神经前体细胞扩大 在体外被认为是一个潜在的细胞来源细胞替代PD ( 16]。然而,一代的功能这个细胞来源的多巴胺神经元被证明是困难的( 17),因此有必要开发实验协议和模型研究的先驱细胞增殖和多巴胺能分化。

通常文化的神经前体细胞建立了最初的机械或解离酶以及酶在细胞使离解。酶分离可能导致剥离的蛋白质在细胞表面,以这种方式破坏细胞内的信号转导通路,细胞间通信,和细胞迁移,细胞发展重要,增殖,分化 18]。为了避免机械和酶的分离和保存一个organotypic细胞间微环境中传播的神经前体细胞,培养组织microexplants神经组织的球体(nt)成立于我们的实验室 19, 20.]。与古典cell-aggregate neurospheres [ 21, 22),细胞在nt文化从未被分离,无论是在组织抽样和文化建立在细胞使也。

国内猪( 野猪家在神经科学)被认为是一个有用的非灵长类模型因为更好的相似的gyrencephalic猪脑的人类大脑解剖学,增长和发展相比lissencephalic小型哺乳动物,如啮齿动物的大脑( 23- - - - - - 25]。

在本文中,我们首次报告数据有效的长期传播nt来自胎儿猪VM。

 2。实验程序 2.1。腹侧中脑的组织的隔离

约克郡猪胚胎(丹麦长白猪××杜洛克猪;南丹麦大学生物医学实验室DK)孕龄E28-30(皇冠尾闾长度= 25日至27日毫米)。胚胎被删除从母猪子宫切除术(5 - 9胚胎/准备;两个独立的实验),晚期与静脉麻醉过量戊巴比妥,放置在无菌直到切除大脑0.9%的盐溶液。动物程序批准,进行符合丹麦动物卫生保健委员会(j .没有。192000/561 - 272)。

大脑被移除的头骨和放置在冷冻相当的平衡盐溶液(GIBCO)与0.5%葡萄糖在无菌条件下。然后,脑膜轻轻删除,和吻侧腹侧mesencephali孤立,尾,削减侧、背侧(图 1)。

解剖猪胚胎(E28-30)腹侧中脑(VM)。(a)横向角度显示前两个的角度解剖的削减,与想象的线(箭头)相交的背表面顶盖(tc)和丘脑(th)(从Dunnett和比约克隆德,1992)。(b) 28-day-old胚胎的大脑解剖台词(a)明显。实线代表VM包围。(c)的腹侧表面孤立VM外植体。酒吧规模:500 μm。

生成参考材料的目的与神经元和神经胶质细胞的免疫组织化学染色和表征类型,VM组织块固定在4%多聚甲醛(PFA) 0.15米磷酸缓冲后立即隔离。

 2.2。设置和VM神经组织的传播领域(nt)

显微镜检查后,VM外植体进一步削减多余的组织和切成小块组织通过组织块手册分为季度使用手术刀在350刀或切片的组织块 μ米使用McIlwain组织直升机。结果组织块培养作为自由nt在塑料水瓶(NUNC)放置在一个湿润孵化器36°C和5%的公司氛围2。

培养,两种不同血清mitogen-containing媒体进行了测试。第一个叫 neurosphere——(NS)扩散介质通常是用于我们的老鼠干细胞文化( 19),是由一个1:1的混合物杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)和螺母组合。F12 Gibco(21331 - 020)上涨0.6% (w / v)葡萄糖(σ),5毫米玫瑰(Gibco), 20毫米NaHCO3(σ),1%牛血清白蛋白(BSA);σ),1%非必需氨基酸(NEAA;σ),1% N2补充(Gibco), 4毫米谷酰胺(Gibco), 1%笔/喉炎,20 ng / mL重组人表皮生长因子(EGF);研发系统、236 -如),和20 ng / mL人类重组碱性纤维母细胞生长因子(bFGF;研发系统,233 - fb)。第二介质,人类神经干细胞 (HNSC)扩散介质,文化通常是用于人类神经干细胞( 26),是由一个1:1的混合物杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)和螺母组合。F12 Glutamax (Gibco 31331 - 028)上涨0.6% (w / v)葡萄糖(σ),5毫米玫瑰(Gibco), 0.5% (v / v) AlbuMAX-1 (Gibco), 1%的非必需氨基酸(NEAA;σ),1% N2补充(Gibco), 1%笔/喉炎的症状(Gibco), 20 ng / mL EGF, 20 ng / mL bFGF。三分之二的介质代替每周两次。

当nt已经达到了一个直径约为600 - 800 μm, nt的通道(通道1 = P1)通过手动切割显微镜的指导下季度使用手术刀刀。基于规模标准(见上图),手动切断nt首次通过每6 - 8天(P0-P3),然后每10 - 14天(P3-P10)和第15 - 22天(P10-P22),在nt削减组织直升机第一通道每20天(P0-P3),然后每隔29天(P3-P5),最后每39天(P5-P6)。

在随后的繁殖和分化实验,我们没有区分nt手工切割和nt处理McIlwain组织直升机。

NS-proliferation介质被发现不支持长期扩散猪VM nt。因此,早期生长在这个媒介文化试图排除在这项研究。

 2.3。在nt传播监测细胞增殖

增殖细胞的核标签扩展nt, 100 μM溴脱氧尿苷(BrdU;σ)添加到mitogen-containing扩散介质24 h后固定的文化PFA 4% 0.15磷酸盐缓冲剂。

 2.4。诱导分化后的VM nt 51 - 232天的传播

酸性成纤维细胞生长因子的因素(aFGF) forskolin,佛波醇12-myristate 13-acetate (TPA)和N62′-O-dibutyryladenosine 3′, 5′环一磷酸钠(db-cAMP)刺激多巴胺能神经大鼠的分化(我们实验室;未发表的)或人类 27)前脑文化( 在体外前脑酪氨酸羟化酶(TH)诱导因素),而纤维母细胞生长因子8 b (FGF-8b)和声波刺猬(嘘)胚胎发育的重要信号分子nigral多巴胺神经元( 在活的有机体内中脑TH-inducing因素)[ 28]。

诱导多巴胺能细胞分化为51 - 232元传播DIV, nt是镀在层粘连蛋白(20 μg / mL;σ)和fibronectin-precoated (20 μg / mL;英杰公司)6-well塑料盘子和迄今为止使用扩散介质所取代(1)纯mitogen-free HNSC介质,(2)mitogen-free HNSC中辅以100 ng / mL人类重组aFGF(σ,F5542), 25岁 μM forskolin(σ,F6886), 100 nM TPA(σ,P8139),和100年 μM db-cAMP(σD0627) (TH-inducing因素),或(3)mitogen-free HNSC中辅以100 ng / mL鼠标重组FGF-8b(研发系统,423 - f8)和25 ng / mL鼠标重组嘘(研发系统,461 - sh)。一系列VM nt被种植的10到25天完成媒体每4天的变化。

作为阳性对照实验进行验证的生物活性aFGF、forskolin, TPA, db-cAMP,一系列的猪前脑nt文化,来源于胚胎的SVZ E28-30天的年龄(基本上被安徒生et al。 19]),包括在分化一步并行VM nt的文化。这些SVZ nt是传播和选择相同的标准和方法作为VM nt的描述。

 2.5。组织学处理

猪胚胎VM组织(E28-30)和传播VM nt固定在4% PFA在0.15 M磷酸盐缓冲剂在室温下(RT) 30分钟和cryoprotected 0.15磷酸盐缓冲剂中含20%蔗糖在4°C。组织是嵌入在Tissue-Tek (AX-LAB a / s),冻结在有限公司2,储存在−20°C到低温恒温器在20分节 μm。部分是安装在涂胶或Superfrost + (BrdU标记nt)玻璃幻灯片和储存在−20°C到采用免疫染色。分化nt ( n = 6 -18 /组/ PFA疣状)固定在4% 0.15磷酸盐缓冲剂为20分钟,冲洗在0.15 M磷酸盐缓冲剂,保持在4°C在同一个缓冲区,直到进一步的处理。

 2.6。免疫细胞化学

使用的三步Biotin-avidin辣根过氧化物酶过程。简而言之,所有VM cryosections, nt cryosections,分化和nt调整RT,冲洗3×15分钟在0.05三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐水(TBS;pH值7.4)包含1% Triton x - 100 (TBS-T),阻止了10%胎牛血清(的边后卫)在RT 0.05 TBS 30分钟,和孵化一夜之间在4°C以下主要抗体在10%的边后卫之一在0.05 M TBS: anti-Ki67, anti-neuroepithelial干细胞蛋白(巢蛋白),anti-Pax6, anti-MASH1,反 β微管蛋白三世,anti-neuroepithelial相关蛋白2 (MAP2) anti-neuronal核(NeuN) anti-tyrosine羟化酶(TH), anti-Glial原纤维酸性蛋白(GFAP)、anti-Vimentin,或anti-2′, 3′循环3′核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)(见补充表1在网上补充材料doi: 10.1155 / 2012/761843)。标本随后被转移到RT,冲洗3×0.05 TBS-T 15分钟,和孵化1 h RT与适当的二次抗体,生物素化的羊anti-mouse (Amersham RPN1001),或生物素化的驴anti-rabbit (Amersham RPN1004)稀释1:200年10%的0.05 TBS的边后卫。接下来,标本冲洗3×15分钟在0.05 TBS-T和孵化与辣根过氧化物酶- 1 h RT(合)共轭链霉亲和素(DAKO P0397)稀释1:200年10%的0.05 TBS的边后卫。进一步冲洗3×15分钟后在0.05 M TBS,合是可视化暴露于0.05% diaminobenzidine (DAB)和0.033% H2O2溶解在0.05 TBS。样本然后冲洗3×15分钟在0.05 TBS, VM和nt cryosections在乙醇脱水(70、96、99%,每2×5分钟),清除在二甲苯(3×5分钟),和cover-slipped DePex (BDH)。分化nt在Aquatex cover-slipped (VWR)后立即最后的冲洗。

对于BrdU免疫细胞化学,nt cryosections调整RT,冲洗在2×3×15分钟盐水柠檬酸钠(SSC);默克公司),孵化2×2 h的SSC / 49%甲酰胺(Bie & Berntsen) 60°C,冲洗为2×2×SSC 5分钟60°C,孵化2 N盐酸/ 0.05 TBS的30分钟37°C,硼酸和冲洗10分钟0.1缓冲区(默克,pH值8.5)15分钟0.05 TBS紧随其后。之后的部分受到标准三步Biotin-avidin辣根过氧化物酶过程如上所述,使用鼠标anti-BrdU抗体(DAKO;M0744)稀释1:200(补充表1)。

特异性的控制,主要抗体是省略或替换的当量浓度与isotype-specific老鼠免疫球蛋白1(DAKO X0931),鼠标 免疫球蛋白 2 一个 (DAKO X0943)或兔免疫球蛋白比例(DAKO X0903)。徕卡直流相机安装在蔡司Axiophot显微镜获取显微照片用于文档。

 2.7。细胞计数和统计分析

量化Ki67-positive和nt BrdU-positive细胞进行20 μ低温恒温器部分。在100 x放大图像得到。nt划分网格,季度,覆盖,Ki67-positive或BrdU-positive细胞数在一个广场(代表部分面积的25%)使用的细胞计数工具FluoroView 2.1 b(奥林巴斯)。每个nt部分的面积是衡量描述nt使用网格系统软件(奥林巴斯)。数据提出了平均每毫米的细胞数量2±SEM。

统计比较了通过商用软件(InStat GraphPad软件)。Ki67-positive或BrdU-positive细胞的密度参数比较的单向方差分析(方差分析)其次是Student-Newman-Keuls多重比较检验。被认为具有统计显著性差异 P < 0.05 *表示, P < 0.01 通过* *表示, P < 0.001 * * *所示。

 3所示。结果 3.1。神经组织的制备和传播领域(nt)来源于胚胎猪腹侧中脑的(VM)组织

两个不同的组织准备设置nt从胚胎猪VM进行测试,即微观指导手册主要分工孤立VM组织块到季度或切片报350 μm×McIlwain组织直升机。

而85 - 90%的手工切VM组织块围捕并形成球形结构在24小时内文化、组织的组织样本分组直升机较低存活率(40 - 50%)后立即建立和更长和更长期的复苏时期。8天后 在体外(8 DIV),把很大一部分将VM组织样本没有围捕或显示龋齿的球形结构。Nonspherical组织被丢弃,只包括在研究球形组织碎片。切片在350 μ米也影响了整体增长率所记录的长期增长时期达到使直径600 - 800 μ米,比手动切nt。然而,切片没有影响的能力长期传播或分化细胞在传播的构成和nt(数据没有显示)。出于这个原因,我们做了手动或组织之间种植,除非特别mentioned-distinguish直升机分段nt在以下分化实验。

两个不同的血清和媒体mitogen-containing扩散,最初的开发培养的神经干细胞和祖细胞,比较刺激经济增长的能力,因此我们猪nt的传播。NS-proliferation介质和HNSC-proliferation介质通常用于小鼠和人类文化,分别。NS-proliferation介质未能支持的长期扩散猪VM nt。33天后,在NS-proliferation培养基培养nt的增殖能力明显降低而HNSC-proliferation nt的培养介质。也在NS-proliferation培养基培养nt无法形成适当的球形结构(图 2(一个))。因此,使用NS-proliferation介质停止和文化排除在分化研究。

长期传播猪腹侧中脑的(VM)神经组织球(nt)。nt传播在(a) neurosphere - (NS)扩散介质或(b)人类神经干细胞——(HNSC)扩散介质。酒吧规模:200 μm。

相比之下,nt HNSC-proliferation媒介传播是可行的传播后显示显著的增殖能力超过237天(图 2 (b))。

显著的有丝分裂活动,由Ki67可视化表达和BrdU合并,观察在两个年轻(P6 = 63 DIV)和长期传播文化(P18 = 237 DIV)(图 3)。Ki67表达细胞主要显示周边分布与细胞形成一个nt外缘(数字 3(一个)- - - - - - 3 (c))。BrdU-positive细胞多,均匀分布在nt,然而保持略高细胞密度在外围区域(数据 3 (d)- - - - - - 3 (f))。BrdU标记细胞的分布格局表明一些postmitotic / postlabelling移植nt从外围向中心。量化Ki67-positive细胞显示略有增加细胞密度较高的通道,这是重要的在P18 P6相比(图 3 (g))。量化BrdU-positive细胞显示,有更多BrdU-positive细胞在P6和P12 P18相比(图 3 (h))。

扩散在长期传播猪腹侧中脑的(VM)神经组织球(nt)可视化Ki67和BrdU免疫染色的组织部分。nt的显微照片显示Ki67的表达式(a) 63天 在体外(DIV)(通道(P) 6), (b) 141年DIV (P12), (c) 237年DIV (P18)和BrdU DIV标签(d) 63, (e) 141 DIV, (f) 237 DIV。酒吧规模:100 μ和20米(概述) μ(插入)。Ki67的量化(g)和BrdU (h)表达细胞显示更Ki67-positive细胞在P18 P6相比,而有更多BrdU-positive细胞在P6和P12 P18相比。数据表示为均值±SEM ( n = 15 -19;* P < 0.05 ,* * * P < 0.001 )。

 3.2。胎儿猪VM Noncultured组织的特征

调查的存在和构成神经细胞类型 原位培养之前,新孤立(noncultured)胚胎(E28-E30)猪VM组织应用了几个核扩散和程控标记(图 4)。

表达干细胞的标记和标记的胶质和神经元细胞在初级(noncultured)猪腹侧中脑(VM)获得在一天的胚胎。显微照片显示一个完整的VM (a), immunoexpression增殖标记Ki67的(b),颈板标记Pax6 (c)和MASH1 (d),神经干细胞巢蛋白标志(e)、胶质标记波形蛋白(f)和GFAP (g),少突细胞标记CNPase (h),神经元标记 β微管蛋白三世(i), MAP2 (j)和NeuN (k)和多巴胺能标记(l)。酒吧规模:100 μ和20米(概述) μ(插入)。

在VM的主要组织,细胞增殖标记Ki67是稀疏目前密度最高的细胞边缘(图 4 (b))。Pax6,转录因子存在于颈板细胞类型,表示在圆形细胞核位于腹外侧向发展中黑质致密部和腹侧被盖区(图 4 (c))。发现的转录因子MASH1只有稀疏和椭圆形/梭状细胞核中发现分布在VM的趋势越来越频繁地发生横向发展中黑质致密部和腹侧被盖区(图 4 (d))。

细胞的细胞骨架蛋白的表达巢蛋白和波形蛋白,通常用于识别神经上皮的前体细胞,GFAP,既存在于成熟的星形胶质细胞和神经干细胞/祖细胞,被发现在VM广泛组织(数字 4 (e)- - - - - - 4 (g))。

少突细胞标记CNPase贴上很少细胞胚胎猪VM。细胞呈现“浓密的“未成熟少突神经胶质(图的外观特征 4 (h))。

β微管蛋白三世,这是不成熟的神经元和神经上皮的细胞表达致力于神经的命运,表达了在大量的细胞在胚胎猪VM(图 4(我))。细胞,积极的细胞骨架蛋白MAP2ab和核蛋白质NeuN(数字 4 (j)- - - - - - 4 (k)),这两个标记特定的神经元在一定的发展阶段或完全成熟的神经元,分布在整个虚拟机的显示MAP2ab染色神经元形态学特征。TH,病原反应合成多巴胺的酶,是表达的细胞显示神经元形态学本地化发展中黑质致密部和VM的腹侧被盖区(图 4(左))。

 3.3。对猪VM nt在长期的传播

处理时间的变化长期培养的nt程控组成和分布,细胞被固定在40天,63年,141年和237年相应段落4、6、12、18分别和应用同样的颈板,胶质,神经元标记如上所述noncultured VM组织从胚胎猪脑。

而Pax6和MASH1表达细胞中观察到noncultured VM(数字 4 (c)- - - - - - 4 (d)),没有Pax6——MASH1-positive细胞被确定在任何阶段传播nt。相比之下,细胞巢蛋白阳性,波形蛋白和GFAP出席高密度整个nt检查阶段的传播(数据 5(一)- 5(c))。

神经干细胞、神经胶质和神经元标记在长期传播胚胎猪腹侧中脑的神经tissue-spheres (nt),染色后40,63,141,237天 在体外(DIV)。显微照片显示immunoexpression巢蛋白(a)、波形蛋白(b), GFAP (c), CNPase (d) β微管蛋白三世在nt (e)。多巴胺的神经元标记MAP2和标记TH并不表示在长期nt传播,但年轻的nt文化显示MAP2表达式(f)在nt 20 41 DIV和TH表达式(g)后6 - 21 DIV。在插入箭头标记神经元细胞soma放大。DIV =天 在体外。比例尺条= 100 μ和20米(概述) μ(插入)。

CNPase-positive细胞中确定集群在nt的核心(图 5(d))。CNPase-positive细胞密度最高的是最古老的文化(图中观察到 5(d);237 DIV),但CNPase-positive细胞的分布和数量个体元之间的相差很大。

几 β微管蛋白III-positive细胞被认为在nt文化(图 5(e))。在40天的培养 β微管蛋白III-positive细胞显示保存完好的神经元形态学特征是一个独特的soma树突和轴突分支(图 5(e);40 DIV)。在旧文化,形态不定义,为主 β微管蛋白III-positive细胞过程可以被识别(图 5(e);141年和237年DIV)。

没有NeuN-positive、MAP2ab-positive或TH-positive细胞中观察到长期传播在63 - 237元DIV。相比之下,两个MAP2ab-positive(图 5(f)和TH-positive(图) 5(g))细胞出现在新成立的nt (6-41 DIV),而NeuN-positive细胞并不确定在新成立的nt。数据表明,完全分化的神经元细胞在nt消除nt的传播时间增加。可能是怀疑这是由于HNSC-proliferation媒介的使用,“赞成”未分化的细胞,使技术,可能会扰乱神经细胞过程和连接。

 3.4。分化的VM球体

nt的分化是由改变HNSC介质没有分裂素和添加已知因素诱导多巴胺能分化 在体外在大鼠(我们实验室;(未发表)或人类前脑文化 27]或 在活的有机体内在nigral多巴胺能神经元的正常发展 28, 29日]。VM nt文化51岁至232天在镀后分化为10 - 25天到层粘连蛋白/纤连蛋白涂层塑料盘子(表 1)。

分化的长期传播神经tissue-spheres (nt)来源于胚胎猪腹侧中脑(VM)。

年龄(DIV) 通道(P) 协议(年代) 时间(天)
51 (1)Mitogen-free
P2 (2)a-FGF forskolin, TPA, db-cAMP 25
170年 (1)Mitogen-free
好 (2)a-FGF forskolin, TPA, db-cAMP 10
232年 (1)Mitogen-free
P18 (2)FGF8 +声波刺猬 10

电镀后,细胞迁移到远离nt,形成单层细胞排列的光环中央细胞群。

β微管蛋白类型III和TH被用作标记为未成熟神经元和多巴胺能神经元,分别。没有一个VM nt的协议并刺激多巴胺能细胞的分化,缺乏TH-positive表示的细胞。而不是紧张 β微管蛋白类型III观察免疫反应性在中央细胞镀nt(图的质量 6(一))。大多数的细胞分化VM nt,然而,astroglial标记GFAP表达,并表现出astroglial形态学特征(图 6(一))。

胚胎猪神经组织分化的长期传播领域(nt)。分化的VM nt(51和170天的年龄)引起分裂撤军并诱发大量的25天 β第三微管蛋白阳性细胞在分化的核心nt (a),但没有TH-positive细胞识别。相反,分化的细胞主要astroglial标记GFAP表达并显示astroglial形态学特征。验证所使用的协议的分化潜能,51-day-old nt文化来源于胚胎猪subventricular区(SVZ)包含在分化研究是一个积极的控制。分化的SVZ nt 25天的有丝分裂原撤军(b)或添加a-FGF TH-inducing因素,forskolin, TPA,和db-cAMP (c),刺激哺乳动物前脑TH表达文化,导致 β微管蛋白三世,TH-positive细胞。的 β微管蛋白III-positive细胞神经元形态学特征,位于集群/区域的克隆细胞迁移和分化的核心SVZ nt。TH-positive细胞多,出现更多的形态不成熟通过短流程(c)相比,文化分化mitogen-free条件下(b)。箭头的马克soma TH-positive细胞。比例尺条= 200 μ米和100 μ米的故事 β第三微管蛋白表达在低和高放大,分别。100年 μ在故事GFAP的表达。

 3.5。分化的猪Subventricular区(SVZ)领域

培养的猪nt源自28-30-day-old SVZ的胚胎,mitogen-free介质或mitogen-free中辅以aFGF forskolin, TPA, db-cAMP刺激 β微管蛋白类型III和TH表达式,验证这些因素对猪文化的区分行动(数字 6 (b)- - - - - - 6 (c))。 β微管蛋白类型III-positive细胞显示神经元形态学特征是坐落在迁移细胞的光环和中央细胞团分化SVZ nt(数字 6 (b)- - - - - - 6 (c))。TH-positive细胞分化中还发现了SVZ nt(数字 6 (b)- - - - - - 6 (c))。mitogen-free TH细胞表达的文化越来越显得更成熟,有更多和更长的过程(图 6 (b)文化)比TH-positive细胞暴露在TH-inducing因素(图 6 (c))。

 4所示。讨论

在体外腹侧中脑的扩张(VM)前体细胞组成一个有趣的替代主要胎儿VM组织intrastriatal移植在帕金森病(PD) ( 8, 30.]。促进多巴胺能细胞的分化,然而,证明困难,呼吁提高扩张和差异化协议。

国内猪( 野猪家大型动物模型)是一个很好的非灵长类神经科学由于许多生理和生物相似性人类和猪生物学( 31日, 32]。猪脑是大到足以提供优秀的可视化,例如,在正电子发射断层扫描和磁共振成像。猪体细胞核转移(SCNT)技术使生产转基因猪模型成为可能( 33- - - - - - 35]。最近,阿尔茨海默病了的猪模型使用“手工克隆(HMC)方法,”SCNT的替代技术,简化了克隆程序,提高效率( 36, 37]。其他猪模型的人类大脑疾病,例如,MPTP-induced PD模型,也被开发( 38]。

由于人类胎儿VM的有限的可用性组织,猪被建议作为一种非灵长类捐赠者的VM组织含有多巴胺神经元和porcine-to-human异种移植的VM组织一直在进行临床试验( 39]。虽然免疫排斥反应过程是诱发人类不和谐的猪异种移植接受者的大脑,这可以减少或抑制免疫抑制 40]。一个非常有前途的新的转基因技术的应用,可以发展的转基因猪异种移植减少移植排斥。

在目前的研究中,猪VM组织小块组织来自28-30-day-old胚胎长期传播和分化是所谓的神经tissue-spheres (nt) [ 19]。在nt系统,一个 在活的有机体内例如,organotypic微环境保存的目的是避免机械和酶分解从而维护细胞完整性,细胞间接触,,和交互。

Twenty-eight-day-old胚胎猪VM显示了人类的某些相似之处VM postcoitus[6 - 6.5周 41]。TH-positive细胞已确定在发展中人类中脑最早3.5周的胎龄,和人类胎儿VM组织6.5 9周的年龄被认为是最佳的移植在PD ( 42, 43]。在年龄28天,胚胎猪VM包含TH-differentiated, dopamine-synthesizing,否则形态与未分化未成熟的细胞,短流程、生存和发展的能力 在体外异种移植的最佳PD患者( 41]。

孤立的胚胎猪VM组织,手动切成小块围捕并形成nt在24小时内,可以维护和传播文化超过230天,使用对人类神经干细胞增殖培养基含有促分裂原EGF和bFGF 26]。这些结果是在良好的协议与其他研究我们实验室的长期培养的大鼠和人类SVZ和VM nt ( 19, 20., 44]。我们观察到媒体用于传播小鼠神经干细胞无法支持长期传播猪VM nt。

nt方法修改neurosphere技术最初由雷诺和韦斯(开发 22和斯文森主持等。 21]。neurosphere文化方法,使组织切成功地用于大规模扩张的是非人类大脑皮层的神经前体细胞孤立。然而,我们的研究结果显示,受损的nt形成时应用McIlwain组织直升机代替手动切割猪VM在使组织。nt未能正常围捕。我们的观察从而表明更高的猪脑组织对机械应力敏感性与人体组织和/或中脑组织与前脑组织。

4.1。细胞的内容传播nt

利用细胞增殖和程控标记,nt的增殖活性和程控成分进行评估在猪的传播定义阶段VM nt。

与稀疏发生增殖细胞的主要VM Ki67确认的组织,一个重要的增殖活动被Ki67可视化疣状和BrdU标记(P6 = 63 DIV),老少VM nt文化(P18 = 237 DIV)。Ki67-positive分裂细胞的发生主要是局限于外围nt的一部分,而BrdU-positive核更均匀地分布在nt,甚至周边地发现的细胞密度最高。

Ki67-expression反映了有丝分裂活动的固定,而BrdU公司涵盖了广泛的时间跨度的24小时的曝光时间。几个BrdU-positive细胞因此将postmitotic时固定。nt的表面部分,营养条件和氧气水平可能支持细胞增殖,而BrdU-positive细胞位于中部的nt可能postmitotic细胞迁移到nt的更深的部分,但也可能是细胞进行DNA修复( 45]。

我们实验室以前的数据显示从外设Ki67的分布变化,BrdU-positive核年轻(P2 = 35 DIV) nt,来源于胎儿鼠VM更均匀地分布在旧nt ( 20.]。河鼠VM nt在媒体传播包含白血病抑制因子(生活)和bFGF,而EGF和bFGF,这可能解释增殖细胞的空间分布之间的差异,在长期传播猪和鼠VM nt。文化的差异治疗也可能影响结果。

颈板转录因子Pax6和MASH1是必不可少的在胎儿和成人/产后哺乳动物大脑的神经发生。Pax6和MASH1表达神经干细胞/祖细胞的两个成年人的大脑神经源性区域,也就是说,侧脑室和subgranular区的SVZ的海马齿状回 46- - - - - - 48]。早期的因素似乎函数步骤来平衡神经干细胞的增殖和分化。

在这项研究中,颈板标记Pax6猪主要VM中标识和MASH1组织相应的培养开始,但没有发现在培养VM nt在任何阶段的传播。利用rt - pcr分析,Kukekov et al。 49)以前显示的存在Pax6 RNA转录neurosphere文化源自于室旁室区和海马的成年人脑(24-57岁)。

结构蛋白的表达巢蛋白(神经上皮干细胞蛋白质)和波形蛋白,这两者都是中间丝蛋白,用于积极识别神经上皮干细胞( 50, 51]。最近,另一个细胞骨架蛋白,GFAP(胶质原纤维酸性蛋白),以前认为是表示只在分化的神经胶质细胞,已被确定在成年哺乳动物SVZ神经干细胞/祖细胞和海马 52, 53]。巢蛋白、波形蛋白和GFAP表达被发现被表达在神经祖细胞与后期人类皮层( 54]。

在nt系统,巢蛋白、波形蛋白和GFAP蛋白被广泛表达在两个主VM组织以及元文化在整个长期传播期。巢蛋白、波形蛋白和GFAP-positive细胞均匀分布在nt和没有见过免疫染色的强度下降,随着年龄增长的文化。成熟的星形胶质细胞也表达GFAP和池GFAP-positive细胞因此必须包括完全分化的神经胶细胞,至少在年轻的nt。

长期传播期间(237 DIV),猪VM nt显示CNPase-positive细胞数量的增加和结构相似之处少突胶质细胞主要出现在集群的核心文化。确认存在一个核心微环境充分的营养和氧气对维持细胞代谢。

只有少数CNPase表达细胞中确定主VM组织培养。颞少突胶质细胞的数量增加培养nt可能反映了内在histogenetical编程VM的组织,它坚持 在体外文化条件。众所周知,少突神经胶质神经元出现晚于神经系统的组织发生和产后继续发展 55]。

除了神经前体细胞分化的神经胶质细胞,敏锐地孤立E27-30-day-old猪VM组织包含成熟和未成熟神经元验证表达式的MAP2(成熟),TH(多巴胺) β微管蛋白3(不成熟的)神经元标记。而未成熟的神经细胞表达 β微管蛋白三世可以确定在两个年轻和年老nt,成熟的神经元内相继死亡的第一段落nt (MAP2 = 42 DIV;TH = 21 DIV)在无血清的存在,bFGF,和EGF包含扩散介质,仅留下干/祖细胞增殖。持续的表达 β微管蛋白三世可能自发的神经前体细胞的分化的结果在传播nt以前在古典neurosphere试验( 56]。

 4.2。诱导分化的VM nt

研究表明,完整neurospheres的神经元分化的结果是高于分化的结果来自分离文化和高收益率相比更多的神经元分化细胞密度低密度,展示在神经细胞间联系发展的重要性( 18, 57]。

在目前的研究中,猪VM nt,享年51 - 232 DIV,被镀到laminin-coated塑料盘子,区分为10 - 25天mitogen-free介质或mitogen-free中辅以aFGF forskolin, TPA, db-cAMP或FGF-8b嘘。

而去除培养基的促分裂原诱发noncell-type-specific分化,增加的因素aFGF、forskolin, TPA,和db-cAMP诱发酪氨酸羟化酶(TH)表达在大鼠前脑文化和文化NT2 / hNT细胞系,源自人类畸胎癌细胞( 29日]。的因素似乎刺激TH表达式通过激活蛋白激酶A (PKA)和蛋白激酶C (PKC)信号通路 29日]。

嘘,FGF-8b至关重要诱导的中脑多巴胺能分化在特定感应网站和前脑在老鼠胚胎 28]。从我们的实验结果也显示出有丝分裂原FGF-8b对中脑多巴胺前体的影响从鼠胚胎细胞 9, 58]。

所有的协议测试在这个研究多巴胺能刺激分化/ TH表达猪VM nt,但是却引起 β微管蛋白类型III表达式。大多数的细胞分化VM nt astroglial标记GFAP表达,并表现出astroglial形态学特征。

当猪subventricular区(SVZ) nt源自E28-30-day-old胚胎生长在mitogen-free介质或mitogen-free中包含aFGF forskolin, TPA, db-cAMP的表达 β微管蛋白类型III和TH的相关性增强验证这些协议应用到猪的文化。大胆的,它可能表明,aFGF forskolin, TPA,和db-cAMP forebrain-specific诱导多巴胺能的分化,,然而,无法诱导多巴胺能midbrain-derived前体细胞的分化。

FGF-8b和嘘关键因素在中脑多巴胺能细胞的发展 在活的有机体内,但可能不适用于诱导多巴胺能的表现型 在体外。例如,cotreatment FGF-8b和嘘只有一个小TH-inductive效应(少于5%)在小鼠胚胎纹状体前驱细胞和人类干细胞系NT2 / hNT 在体外( 59]。当然,之间的差异 在活的有机体内和 在体外数据可以反映差异的起源和发展阶段的细胞类型研究,但另一种选择和合理的解释也可能是一个或多个额外的介质是必不可少的中脑多巴胺能神经元的诱导和规范 在活的有机体内。这样的一个分子可以转化生长因子- β(TGF - β),它已被证明是必不可少的中脑多巴胺能神经元的诱导和维护 在体外和 在活的有机体内在鸡肉和鼠模型( 60]。

即使没有直接的多巴胺能的潜力,nt可能仍然在PD相关的移植。最近的一项研究由摩西et al。 61年]表明,长期传播neurospheres来自老鼠胎儿纹状体多巴胺能神经元变性和腹侧中脑有能力拯救从诱导细胞凋亡,促进生存 在体外的多巴胺能神经元和 在活的有机体内黑系统可能通过可溶性接触独立因素。

总之,我们的数据显示,首次腹侧中脑的前体细胞(VM),隔绝猪胚胎年龄28 - 30天,可以长期传播神经tissue-spheres (nt)。超过230天之后,nt仍然形成神经元和神经胶质,从而使实验研究的神经前体细胞,他们的利基和分化能力。

 确认

作者欣然承认的优秀的技术援助Dorte Lyholmer, Maibritt稳索达姆,和兰迪Godskesen。特别感谢安妮特Møller达尔提供的照片猪胚胎的大脑。本文是由Fonden直到Lægevidenskabens Fremme,才是Almene喜爱,丹麦帕金森协会丹麦医学研究理事会(j .没有。271-07-0582),丹麦的干细胞研究中心和欧洲科学基金会EuroSTELLS EUROCORES项目。

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