1。介绍
主要有两种类型的骨髓干细胞,造血干细胞(hsc)和间充质干细胞(msc)。骨髓msc分泌等因素和细胞因子白介素6 (il - 6)和肝生长因子导致肝脏再生(
1 ,
2 ]
。 因此,msc可能发挥作用在增加肝脏的再生。有许多方法来调查使用msc和其他细胞(
3 ]。每一种都有它自己的优势取决于使用的特定区域
3 ]。为我们具体研究肝脏再生,我们正在调查的原则聚合物膜微胶囊(
4 - - - - - -
8 ]bioencapsulate骨髓msc,原因如下。
(1)
细胞保留聚合物膜人工细胞内,从而防止免疫rejection-immunoisolation [
4 - - - - - -
9 ]。
(2)
有很多研究细胞bioencapsulation使用胰岛细胞疗法,肝细胞,基因工程细胞和其他细胞和有前景的结果(
5 - - - - - -
8 ]。然而,还需要更多的研究对长期生物相容性允许bioencapsulated植入细胞植入后超过1年。因此,我们寻找使用bioencapsulated干细胞在急性肝衰竭肝再生。在这种情况下,植入bioencapsulated msc只需要功能相对比较短的时间(几周在老鼠和人类)个月提高肝再生成一个功能。
(3)
Bioencapsulated msc和immunoisolated保留在聚合物膜微胶囊。这也避免了分散的问题植入骨髓间充质避免自由msc的罕见但潜在的致瘤性。
我们开始通过使用聚合物微胶囊(
4 - - - - - -
6 ]bioencapsulate骨髓有核细胞切除肝脏大鼠腹腔内注入90% (
9 ]。这导致增加回收率90%的切除肝脏老鼠和残肝再生(
9 ]。我们推测,这是由于两个因素。首先是直接调节肝细胞生长因子(HGF)的影响,从bioencapsulated msc移植后分泌,这些生长因子刺激,加速残余肝脏再生(
5 ,
6 ,
9 ]。其次是msc分化转化成肝细胞充分保持一些肝脏功能直到肝脏再生(
5 ,
6 ,
9 ]。然而,腹腔内注射bioencapsulated干细胞是分散在整个腹腔而不是局部,这可能刺激腹膜衬里导致腹膜炎。脾脏是可能的细胞移植治疗各种肝脏疾病(
10 - - - - - -
13 ),尤其是肝脏是不适合作为移植的网站。然而,intrasplenically移植细胞可以迁移到肝脏通过门静脉并导致栓塞肝内门静脉系统(
13 ];因此,在本研究中,我们使用海藻酸赖氨酸bioencapsulated msc海藻酸(APA)膜并移植到老鼠90%的脾脏切除肝脏。这种方式,bioencapsulated msc将在移植后脾脏。与自由msc、bioencapsulated msc被保留在所有时间和不成为分散造成不利影响。移植后14天,我们跟着PH值大鼠复苏的比例90%,剩余的重量肝脏、血液水平的细胞因子和生长因子。
2。结果
2.1。复苏的百分比在90%切除肝脏老鼠
实验端点14天。临床端点时大鼠的临床条件已达到终端阶段包括腹水、呼吸困难、弯腰驼背的姿势。如果这些临床端点出现,老鼠被安乐死。那些还没有达到临床端点算作“恢复”。
复苏移植后2周的百分比显示了以下结果。bioencapsulated msc移植到脾脏明显增加90%的复苏切除肝脏组相比,治疗组(
P
<
0.05
,图
1 )。然而,植入的免费msc的脾脏切除肝脏90%组没有导致任何重大的改变时相比治疗组(
P
>
0.05
,图
1 )。
图1
老鼠的复苏的百分比。
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实验端点14天。临床端点时大鼠的临床条件已达到终端阶段。那些还没有达到临床端点算作“恢复”,如图
1 。线从自顶向下:(1)虚假的控制;(2)切除肝脏90%(惠普)+ bioencapsulated msc;(3)PH值+自由msc;(4)博士的比例恢复率明显高于在bioencapsulated msc组相比,自由msc组或PH值控制集团(
P
<
0.05
)。
2.2。在不同的组肝脏湿重
移植后2天,没有显著区别自由msc组和对照组肝脏中PH值的90%体重比(
P
>
0.05
,图
2 )。另一方面,早在移植后第二天,肝脏切除肝脏90%组体重比接收bioencapsulated msc明显高于未经处理的90%切除肝脏组织和自由msc集团(
P
<
0.001
,图
2 )。然而,肝脏和身体重量比例仍显著低于假对照组2天。后14天的肝体重比bioencapsulated msc集团达成的虚假的对照组(图
3 )。这表明bioencapsulated msc移植组,经过2天的移植、肝脏质量恢复的速度比PH值控制和自由msc移植,但仍未恢复到完整的原始大小直到第14天。这显著增加肝脏质量可能有助于保持足够的肝功能的老鼠生存,直到肝脏再生。
图2
在2天残肝湿重。
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图3
在14天残肝湿重。
![]()
bioencapsulated MSC组的第二天,残余肝体重比例明显高于PH值控制和自由MSC集团(
P
<
0.001
),但仍低于虚假的集团(
P
<
0.01
)。
14天之后90%的PH值,残余肝脏湿重与体重比在那些动物bioencapsulated msc集团已经恢复比虚假的对照组(没有明显不同
P
>
0.05
)。
2.3。生长因子和细胞因子在等离子体
bioencapsulated msc移植组,HGF和il - 6水平高于90%的PH值控制和自由msc组移植后从第一天到第三天(
P
<
0.01
;数据
4 和
5 ),而TNF -
α 高90%的PH值控制和自由msc组从第一天到第七天比bioencapsulated msc移植后组(
P
<
0.01
,图
6 )。
图4
HGF在等离子体。
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图5
在血浆il - 6。
![]()
图6
肿瘤坏死因子-
α 在等离子体。
![]()
从第一天到第三天手术后,bioencapsulated msc组血浆HGF显著高于自由msc组和对照组(
P
<
0.01
)。
在第一次手术后三天,il - 6在bioencapsulated msc组明显高于90%的PH值控制和自由msc集团(
P
<
0.01
)。
血浆肿瘤坏死因子-
α 在90%的PH值控制显著高于bioencapsulated msc组和自由msc组在术后前3天(
P
<
0.001
)。在自由msc集团TNF -
α 明显高于bioencapsulated msc集团(
P
<
0.01
)。
3所示。讨论
Intrasplenic bioencapsulated msc移植的PH值显著增加回收率在90%的百分比老鼠,而并没有观察到这种效应在自由msc移植组。
过度的肝切除术后肝功能衰竭的机制还不清楚。它可能涉及功能性薄壁组织细胞的损失,剩余肝脏急性炎症反应,微循环障碍。大规模肝切除术后,致命的肝衰竭的特征是细胞凋亡增加,减少肝再生;所以没有足够的肝脏能力来满足身体的代谢需求,维持内环境稳定
14 ]。PH值后,流向正弦损伤内皮细胞激活枯氏细胞释放炎性细胞因子如TNF -
α 和TGF -
β 1。这些进一步诱导坏死和凋亡的残余肝脏
15 - - - - - -
17 ]。在我们的研究后的头几个小时,PH值,TNF -
α 参加肝再生的启动步骤,这个启动步骤引起的过渡细胞G0 G1 (
18 ,
19 ]。此后,TNF -持续升高
α 诱导肝细胞凋亡的残余肝脏
20. ]。在目前的研究中,有一个显著增加的血液肿瘤坏死因子-
α 24小时后获得高水平的肿瘤坏死因子- 90%
α 在这个阶段可能进一步诱导肝细胞凋亡。肿瘤坏死因子-
α 显著降低了bioencapsulated msc移植后24小时相比,PH值控制和自由msc移植组。
HGF和il - 6在bioencapsulated msc组高于PH值控制。很可能这是由于生产bioencapsulated HGF和il - 6的msc。以前的体外研究表明bioencapsulated msc产生il - 6和HGF
5 ,
6 ,
9 ]。HGF和il - 6是重要的生长因子和细胞因子的航道再生后肝衰竭(
21 - - - - - -
24 ]。此外,il - 6刺激静止细胞进入细胞周期的再入后第一个2到4小时内PH值(
18 ]。
我们早些时候腹腔内植入的研究表明,一些bioencapsulated msc移植后14天显示分化转化成hepatocyte-like细胞(
9 ]。然而,我们没有发现任何transdifferenitation在移植后2天(
9 ]。大多数动物死后的前3天内90%肝切除术,看起来这是HGF和分泌il - 6等因素bioencapsulated msc,最初的角色在促进肝脏再生,防止残余肝坏死和凋亡。后,bioencapsulated msc在脾脏transdifferentiated成肝细胞等细胞。这种方式,脾脏可能充当一个异位肝支持一些肝脏功能维持的生命惠普老鼠直到肝脏再生。
有很多原因intrasplenic移植bioencapsulated msc。首先,90%的PH值后,残余肝脏太小,与大量的bioencapsulated msc移植。其次,先前的研究显示,通过体循环msc移植可能驻留在肝星状细胞分化和myofibroblasts,两者都可以促进肝纤维化、肝硬化的肝脏
25 ,
26 ]。在我们的研究中,我们在msc在脾脏的bioencapsulation msc。第三,生长因子和细胞因子的产生从intrasplenic残余肝脏移植msc可以直接流失,保持因素在门户系统中高浓度和残余肝脏。第四,bioencapsulated msc在脾脏再也不能离开脾引起栓塞。这将解决问题的栓塞intrasplenic自由msc移植之前报道(
27 ,
28 ]。这种方式,msc,不要分散在体内保留在不可能骨髓间充质形成致癌细胞突变的可能性。我们的研究结果表明,与自由msc、bioencapsulated msc呆在脾脏当随访14天。
聚合物微胶囊bioencapsulation不同类型的细胞都进行了广泛的调查和有前景的结果(
5 - - - - - -
8 ]。然而,他们只能植入后的12个月里的函数,因为长期的生物相容性问题[
5 - - - - - -
9 ]。然而,在目前的情况下研究肝脏再生可以发生在一个相对短的时间内,bioencapsulated细胞只需要函数这个持续时间没有问题长期的生物相容性。
总之,在切除肝脏90%的老鼠模型中,intrasplenic bioencapsulated msc移植的肝脏的再生和改善动物的恢复率。这可能是由于两个原因。起初,bioencapsulated msc分泌肝生长因子和细胞因子,流入通过门静脉导致残余肝脏增强肝脏再生。后,bioencapsulated msc在脾脏transdifferentiated成肝细胞等细胞。这种方式,脾脏可能充当一个异位肝支持。进一步研究肝再生的基本方面这种方法需要进行。例如,详细的组织病理学研究应该进行更详细地研究这个。此外,肝细胞增殖数据应该收集使用BrdU或ki - 67 (MIB-5)。如果msc改善再生,这将是重要的每天给博士除了前几天之后,应该指出,这是一个大鼠模型,和在大鼠肝再生速度远远超过人类。因此,本研究的结果不能直接应用于人类之前在其他动物模型进行了进一步的研究。
4所示。材料和方法
4.1。动物
雄性Wistar鼠,200 - 225克,从查尔斯河(St-Constant、加拿大)购买捐赠者的骨髓细胞。同基因的雄性Wistar鼠被用作接受者。
4.2。骨髓干细胞隔离和msc扩张
Wistar鼠与戊巴比妥钠麻醉和股骨都是孤立的。无血清L-DMEM(低葡萄糖DMEM、GIBCO BRL)被用来清除从股骨骨髓细胞使用一个22码5毫升注射器针。骨髓单核细胞分离与Percoll梯度密度(美国密苏里州σ1.073 g / mL)离心。简单地说,细胞悬液在同等体积的Percoll分层解决方案,离心机为20分钟2000转/分钟。然后我们恢复的白层等离子体下面的单核细胞层。细胞被resuspended扩张中(DMEM低葡萄糖,10%的边后卫,2毫米谷酰胺,玫瑰,100 U /毫升青霉素和100年
μ 2.5 g / mL链霉素,两性霉素B
μ g / mL, 10 ng / mL表皮生长因子(EGF)、10 ng / mL bFGF)。他们被播种在10厘米文化盘子的密度
5
×
10
4
细胞/厘米2 95%的空气中孵化,5%的公司2 在37°C,新鲜媒介改变每3 - 4天。贴壁细胞融合可以达到80%,然后通过[
29日 ,
30. ]。通常3通道后,细胞纯化纺锤状msc和可以收获为进一步实验使用。
4.3。Bioencapsulation msc的
海藻酸赖氨酸海藻酸(APA)微型胶囊的方法被用来封装的msc如前所述
6 ,
9 ,
31日 ]。简单地说,msc
2
×
10
8
悬浮在15毫升1.5%海藻酸钠溶液(美国罗克维尔市Inotech)。细胞悬液挤压通过液滴发生器(NISCO Encapsulator, NISCO工程公司、瑞士)。被允许形成的珠子落入一个包含100毫米CaCl PYREX菜2 。珠子被允许凝胶后钙的解决方案5分钟,珠子都沉浸在50毫克% 15分钟poly-L-lysine解决方案,用缓冲盐水(0.85%氯化钠,10毫米玫瑰,20毫米果糖,PH值7.4),然后沉浸到0.2%海藻酸钠10分钟。最后,被安置在50 mM的珠子柠檬酸钠为20 - 30分钟内海藻酸凝胶溶解,形成一个APA膜。最后微胶囊含有msc在L-DMEM孵化没有补充,无血清,5%的股份有限公司2 ,37°C孵化器移植前4小时。
4.4。百分之九十的PH值和移植协议
90%的PH值是按照标准的程序执行
32 ]。虚假的操作,我们只进行腹部切口和削减暂停韧带的肝脏,然后关闭切口。后立即PH值90%,msc bioencapsulated msc被注入intrasplenically免费使用18-gauge针和23 G针msc注入。在脾脏注射通过3 - 4网站。可吸收止血剂(Surgicel NU-KNIT Ethicon Inc .,新泽西,美国)被用来防止出血后注入。
我们执行两个动物实验,在第一个实验中,48动物随机分为4组:虚假的控制(
n
=
10
);90%的PH值控制(
n
=
1
4
);90%的PH值移植
3
×
10
7
bioencapsulated msc (
n
=
12
);90%的PH值移植
3
×
10
7
自由msc (
n
=
12
)。血液样本被从这些老鼠在不同的时间点。这一组的实验端点是14天。实验端点14天。当老鼠已达到临床端点终端阶段包括腹水、呼吸困难、弯腰驼背的姿势。如果这些临床端点出现,老鼠被安乐死。那些还没有达到临床端点算作“恢复”。
在第二个动物实验,老鼠被分成以下组和31日收到相应的干预,虚假的控制(
n
=
5
);90%的PH值控制(
n
=
9
);90%的PH值移植
3
×
10
7
bioencapsulated msc (
n
=
8
);90%的PH值移植
3
×
10
7
自由msc (
n
=
9
)。
麦吉尔大学动物伦理委员会的机构不允许生存研究死亡。因此,这一组的实验端点是2周。如果临床端点的迹象出现,如终端压力如腹水、呼吸困难,弯腰驼背的姿势,然后老鼠被安乐死。在PH值后第14天,所有老鼠存活实验端点都牺牲了,肝脏和脾脏被切除进行分析。
4.5。血液细胞因子测定
血液样本取自受体大鼠前和博士后不同时间点血浆样本存储在冰箱−76°C到测试。HGF, TNF -
α ,il - 6在等离子体测量使用酶联免疫吸附试验(ELISA)。HGF酶联免疫试剂盒从免疫学研究所购买了东京,日本。TNF-a和il - 6包购买的研发系统,明尼阿波利斯,MN,美国。分析程序是按照制造商的指示。
4.6。统计分析
数据被当作平均数±标准差。为多个比较两个以上的团体,我们进行单向或双向方差分析(方差分析)。如果方差分析是很有意义的,我们执行Newman-Keuls过程事后考验。kaplan meier曲线用于分析复苏大鼠的百分比。
χ
2
(卡方检验)方法被用于比较每组复苏的百分比。一个
P
值小于0.05被认为是显著的。