SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 685901年 10.1155 / 2012/685901 685901年 研究文章 评估英国史宾格犬遗传性视网膜变性的狗和疾病的关系 RPGRIP1突变 Narfstrom 克里斯蒂娜 1、2 宋 Manbok 3 海曼 珍妮花 4 马森 理查德·W。 5 Bergstrom 托马斯·F。 6 克拉森 亨利·J。 1 兽医和手术 兽医学院 密苏里大学密苏里州哥伦比亚65211 美国 missouri.edu 2 眼科学系 梅森眼科研究所 密苏里大学密苏里州哥伦比亚65211 美国 missouri.edu 3 兽医和手术 兽医学院兽医科学和BK21程序 首尔国立大学,首尔151 - 742 韩国 useoul.edu 4 眼睛照顾动物 弗吉尼亚州,20176 - 3367 美国 eyecareforanimals.com 5 生物统计学,医学院 密苏里大学密苏里州哥伦比亚65211 美国 missouri.edu 6 动物育种和遗传学 瑞典农业科学大学 750年07乌普萨拉 瑞典 slu.se 2012年 28 2 2012年 2012年 12 09年 2011年 09年 11 2011年 15 11 2011年 2012年 版权©2012年克里斯蒂娜Narfstrom et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

集约饲养和选择所需的特征产生了高水平的遗传疾病在狗。遗传性视网膜变性,通常被称为渐进性视网膜萎缩(PRA),流行与疾病实体狗与人类视网膜色素变性(RP)和雷伯氏先天性黑内障(LCA)。最近的分子研究英国史宾格犬(ESS)的狗已经表明,PRA例经常RPGRIP1基因的突变纯合子,缺陷也导致人类RP, LCA,锥杆营养不良。本研究描述疾病影响的一组ESS在美国,使用临床、功能和形态的研究。客观评价视网膜功能使用electroretinography (ERG)进一步蒙面的方式执行一组美国ESS狗,与考官蒙面基因状态的狗。只有4 6纯合子动物显示疾病的临床症状,强调更精确的研究的必要性和重要性在分子缺陷的临床表现为转化研究利用动物模型,如当使用干细胞治疗干预。

 1。介绍

国内的狗有一个独特的人口历史与瓶颈,影响犬基因组的多样性和结构。第一个瓶颈可以追溯到大约7000——50000代 1),反映了早期驯化野生种群的狗狼15000 - 100000年前 2- - - - - - 4]。当狗在1800年代建立了(约50 - 100代之前)更失去了遗传变异,和第二个人口瓶颈导致了相对较大的品种之间的遗传差异和小品种内的遗传变异。这两个瓶颈留给独特的签名在犬基因组中远程连锁不平衡(LD)和长单体型的500 kb-1 Mb在品种和短程LD跨品种( 1, 5]。集约饲养所需的特征和选择也产生高水平的遗传疾病基因品种繁育或近的原因。国内的狗因此成为一个重要的动物模型为比较基因组分析和遗传疾病的特征。其他用途狗模型转化研究如基因治疗或干细胞移植治疗策略与遗传性视网膜致盲性疾病。

遗传性视网膜变性,通常被称为渐进性视网膜萎缩(PRA)在狗和猫,是一组疾病的感光细胞存在于各种形式。视杆细胞和视锥细胞通常是主要的影响,随着时间的推移导致双边失明。名单上有超过100的狗对于那些可能会受到影响,在34至少15突变的普遍特定的狗( 6]。对猫来说,PRA是观察到的频率更低,尽管最近,显示CEP290基因的突变是诱发大量的遗传性视网膜变性的猫品种,主要阿比西尼亚和暹罗猫 7]。

通过发展遗传性疾病的理解过程影响视网膜外层部分,PRA进一步生化反应特征,电生理学、形态学和基因。使用分子方法,包括诱发突变基因的说明几个遗传性视网膜疾病,尤其是知识已经获得很多很多关于疾病机制( 8]。犬基因组序列的可用性( 1)( http://www.genome.gov/12511476)简化了识别的任务负责疾病和基因特征的狗。同样,一个完整的基因组序列(10 x)的猫最近已经完成(韦斯·沃伦,华盛顿大学,个人通信,2010)。普拉斯的数字指定基因符号反映的特定细胞参与遗传性视网膜营养不良或蛋白质参与视网膜退行性条件。

尽管PRA通常与一个品种表现特定的表型,相同的等位基因突变可能是共享的几个不同的品种,比如 prcd突变( 9]。在其他情况下,不同的等位基因突变引起PRA的原因已经被记录在相关品种( 10]。重要的是,品种也可能表达超过PRA的一种形式。例如,在金毛至少三个不同的基因和突变是PRA负责。两个已知的基因,prcd slc4a3,但至少一个基因还有待特征( 11]。多个致病突变的存在对PRA在某些品种复杂phenotype-genotype关系的理解和解释的结果,因此DNA测试程序( 12]。由于这些因素,表型异质性是经常发现当研究各种形式的视网膜退化性疾病的狗。这也被观察到具有类似人类的视网膜疾病过程,如视网膜色素变性(RP)或雷伯氏先天性黑内障(LCA)。在这些疾病中,发现明显的表型异质性包括发病年龄、临床表现、和疾病进展的 8, 13]。特别是RP的至少140只有被描述在视紫红质基因突变 14, http://omim.org/entry/268000]。

古典PRA被描述为一个广义的眼底疾病,主要影响杆光感受器和后视锥细胞的参与。临床上夜盲症与疾病进展的早期迹象,但,两昼夜视觉发生感情。Ophthalmoscopically早期变化指出广义扩散变化颜色和反射率的绒毡眼底血管衰减在以后的阶段,变化是最严重的外围地区,但后来参与整个眼底的( 15]。

PRA描述的英国史宾格犬狗最初是在美国 16]。有一些不寻常的发现疾病,增加底部的粒度或稍微不变色的早期临床症状观察很远绒毡眼底的外围。发病的疾病有一个变量的时间和进展,导致失明在大多数受影响的狗。

RPGRIP1基因的突变已被确认为诱发人类RP, LCA,遗传性锥体杆体营养不良( 17- - - - - - 19]。RPGRIP1蛋白是参与传输机制通过感光连接纤毛发生交互与另一个蛋白质,RPGR [ 20.]。后者缺陷基因负责x连锁人类视网膜病和x连锁PRA在萨莫耶德犬和西伯利亚雪橇犬狗 21]。此外,NPHP4突变 ,另一个已知基因与RPGRIP1交互,展示了锥/杆萎缩症的病因wire-haired腊肠( 22, 23]。另一个这样的基因与RPGRIP1音乐会CEP290,当突变被发现导致猫(遗传性视网膜变性 24]。蛋白质也是传输机制的一个重要组成部分,即专业phototransduction的关键蛋白质合成的从他们的网站内段通过连接纤毛外段( 25]。所需数量的正常基因并整个感光细胞的正常功能和结构,特别是对于外节盘形态发生( 26]。

Mellersh和合作者最近映射的锥杆轨迹(cord1) 14.5 Mb地区狗15号染色体(CanFam2.0 16.54 - -30.68 Mb:坐标),含有RPGRIP1基因。一个44 bp插入RPGRIP1基因外显子2进一步确定,删除蛋白质。这个缺陷完全隔离cord1表型的锥杆萎缩症动物卫生信托(英国)研究群迷你腊肠犬。认为突变是负责cord1疾病,由于RPGRIP1基因的突变。这是进一步强调,狗与这种疾病是很有价值的动物模型研究疾病机制和潜在治疗人类,LCA ( 27]。

的 RPGRIP1突变锥杆萎缩症(cord1)进一步评估作为PRA的候选基因在ESS狗使用DNA收集密苏里大学(美国哥伦比亚),从大量的狗,不受影响,影响双边、广义视网膜变性。外显子2的突变观察RPGRIP1在所有受影响的狗(加里·约翰逊和莉斯汉森、个人通讯,2007)。

本文描述了结果之后发起的一个研究项目,为了描述视网膜变性的临床体征ESS品种和评估家族ESS genotype-phenotype相关性在美国,关于RPGRIP1基因的突变。最近,这项研究是进一步扩大到包括血液样本一群瑞典ESS狗,有和没有临床症状的PRA和关于的相关性 RPGRIP1突变。

 2。材料和方法 2.1。动物和临床检查

ESS狗来自美国包括疾病的特征。他们私有狗的主人或育种者要求眼睛检查,根据眼计划程序,因为他们的狗或其近亲属被用于繁殖。12例临床症状视网膜变性的1.5 - 12岁ESS狗是为期两年的研究期间发现的。受影响的狗都是纯合的 RPGRIP1突变。

获得知情同意参与业主的狗。视网膜的临床研究包括评估和基于视觉的反应和反应:威胁,眼花缭乱,瞳孔光反射的检查以及视觉测试行为和视觉反应下降棉花球( 28]。学生与短效扩张瞳孔放大的前20分钟检查内部结构,用1 - 2滴tropicamide 1%每只眼睛(Mydriacyl,博士伦,随着Inc .,坦帕,FL)。标准眼科检查眼睛的内部是使用间接检眼镜检查执行(Welch-Allyn分销商、医疗器械仓库,Inc .,医学博士,美国)和裂隙灯活组织镜检查(SL14 KOWA有限公司,东京,日本)。眼底的外表与数码眼底相机记录(Nidek nm - 100, Nidek有限公司,是CA)。

 2.2。DNA样本

收集的DNA样本ESS狗之前加里·约翰逊博士的实验室,密苏里大学,哥伦比亚大学,美国利用。所有收集的样本盈余从血液标本提交程序 cord1临床生物化学条件下的测试或匿名的个人和他们的主人。DNA提取血液样本和基因分型 cord1疾病导致等位基因的突变基因RPGRIP1基因进行描述Mellersh et al ., 2006 27]。

此外,调查中cord1基因型是否普遍ESS狗在瑞典,特别是在ESS狗患有PRA,血液样本共有14个正常和狗检测44影响bp RPGRIP1基因外显子2(表中插入 1)。瑞典的狗的血液被收集到EDTA管和基因组DNA提取手动使用QIAamp从外周血白细胞DNA血液Midi设备(试剂盒、希尔登,德国)或自动卡塔尔投资局交响SP /仪器(试剂盒、希尔登,德国)。

瑞典ESS狗genotype-phenotype相关性关于RPGRIP1突变。狗的性别为男性和F M表示为女性。诊断显示为岁(y)和几个月(m)当狗第一次检查和诊断出患有PRA。狗没有PRA(正常),最近的考试日期是用于年龄在考试。给出了基因型/−−的基因影响,为运营商+ /−,+ / + 44的基因明显个人bp RPGRIP1基因外显子2中删除。

狗的数量 性 年龄在考试 表型 RPGRIP1基因型
ess - 008 米 2 y 4米 PRA −−/
ess - 014 F 3 y 8米 PRA −−/
ess - 004 F 5 y 9米 PRA + /−
ess - 006 米 5 y 7米 PRA + /−
ess - 016 米 7 y 3米 PRA + /−
ess - 020 米 9 y 8米 PRA + /−
ess - 003 F 5 y 4米 PRA + / +
ess - 005 F 3 y 1米 PRA + / +
ess - 007 米 11个y 4 m PRA + / +
ess - 009 米 4 y 6米 PRA + / +
ess - 015 F 8 y 3米 正常的 + / +
ess - 017 F 5 y 11米 正常的 + / +
ess - 018 F 12 y 1米 正常的 + / +
ess - 019 米 7 y 10米 正常的 + / +

引物的pcr RPGRIP1 44 bp在exon2插入的基因设计使用软件Primer3 [ 29日]。使用引物进行PCR扩增Cfa_Cord1-F (5′6 fam-ccctttcctgggactttagg-3′)和Cfa_Cord1-R (5′-CCCTCTGCCTATGTCTCTGC-3′)。10 - ng的基因组DNA用于10 uL PCR-reaction每个引物的0.5毫米,50 mM氯化钾,10毫米Tris-HCl pH值8.3,2.5毫米MgCl2,每个核苷酸的0.2毫米和0.5单位的聚合酶(AmpliTaq金;美国应用生物系统公司,培育城市,CA;DNA聚合酶)。总共35 PCR循环进行,每个在94°C与变性1分钟,退火60°C 40年代和引物延伸在40年代的72°C。片段长度多态性被确定使用ABI 3100 DNA分析仪和GeneMapper软件(应用生物系统公司,Inc . (ABI),促进城市,CA)。

 2.3。蒙面Electroretinography研究

14个美国狗都包含在一个蒙面electroretinography (ERG)研究客观评价视网膜功能(ERG见下面的细节)。从这些狗血,年龄7 - 9米和13 y 10 m,先前被约翰逊博士的实验室基因分型,如上所述。狗为视网膜功能评价选择依照主人的同意和可用性。每个关于狗的基因状态 RPGRIP1突变是未知的调查员(k . Narfstrom)时的ERG录音:6狗纯合子(影响); RPGRIP−−,7是杂合的(正常); RPGRIP−/ +,1是纯合子(正常); RPGRIP1 + / +(表 2)。每个狗的ERG执行之前,他们接受了常规眼科检查如前所述。

细节关于狗在蒙面ERG的研究。给出了基因型/−−的基因影响,为运营商+ /−,+ / + 44的基因明显个人bp RPGRIP1基因外显子2中删除。当时的年龄为眼科和ERG检查作为年(y)和几个月(m)。

狗的数量 RPGRIP1基因型 ERG年龄 ERG的结果 其他临床结果
1 −−/ 9 y 2米 不正常的 视力正常,眼底正常
2 + /− 8 y 7米 正常的 视力正常,眼底正常
3 + /− 7 y 9米 正常的 视力正常,眼底正常
4 + /− 7 y 9米 正常的 视力正常,眼底正常
5 + /− 13 y 10米 正常的 视力正常,眼底正常
6 + /− 11个y 11米 正常的 视力正常,眼底正常
7 −−/ 9 y 2米 不正常的 视力正常,眼底异常
8 −−/ 9 y 2米 不正常的 视力正常,眼底异常
9 −−/ 8 y 4米 正常的 视力正常,眼底正常
10 + /− 9 y 4米 正常的 视力正常,眼底正常
11 + /− 8 y 正常的 视力正常,眼底正常
12 + / + 9 y 3米 正常的 视力正常,眼底正常
13 −−/ 12 y 4米 不正常的 视力下降,眼底异常
14 −−/ 7 y 正常的 视力正常,眼底正常
2.4。Electroretinography

单边electroretinographic (ERG)评估使用便携式ERG执行单元(HMsERG模型1000年RetVet Corp .)、哥伦比亚大学,密苏里州),与mini-Ganzfeld圆顶定位大约1厘米从右边眼睛(图进行测试 1)。实际原因它被认为足以执行评估以来,只有一只眼睛双眼通常影响遗传性视网膜病变和视网膜的眼睛通常是在同一阶段退化的过程( 15]。

一个英国史宾格犬(ESS)狗深镇静和准备视网膜的功能评价。手持multispecies electroretinograph (HMsERG)单位一起预排程序的协议用于评估视杆细胞和视锥函数。

狗非常镇静用medetomidine IV (Exton Domitor、诺华、辉瑞动物保健,PA), 150微克/公斤,相当于0.15毫升/公斤,准备ERG会话在普通房间光线。心跳和呼吸频率都密切关注狗之前和在整个手术过程中,温度的控制。这只狗的头被放置在稳定的缓冲。最大瞳孔扩张提供了使用短效的瞳孔放大的(见上图)和眼睛进一步局部麻醉用0.5%盐酸proparacaine (Alcaine、爱尔康沃斯堡,TX)。控制镜插入,确保瞬膜以及上、下眼睑不干扰曝光最大瞳孔放大。皮下的铂电极针(模型E2、草仪器部门Astro-Med, Inc .)、西沃里克,RI)被用于地面电极,放置在枕顶,参比电极,从眼角外侧定位3厘米,接近底部的右耳。一个活跃的隐形眼镜电极(ERG-Jet《可塑炸弹,LKC Technologies Inc。盖瑟斯堡,Md)后被放置在角膜滴剂的一滴2%甲基纤维素(甲基纤维素,汽巴的视野,慕尼黑,德国)。电极连接到一个前置放大器,信号放大和带通滤波器在0.3和300赫兹之间。

每个ERG会话由暗明尔格,按照推荐的“狗诊断协议,”欧洲学院兽医眼科医生,主要是为评估和分离的视杆细胞和视锥函数( 30.]。这个协议是ERG预排程序的单元测试和执行自动启动ERG会话的考官。在20分钟的暗适应,scotopic-low杆强度反应了每4分钟的刺激强度0.01 cd·s / m2;反应后平均10闪光在2秒间隔和杆的反应被记录在每个时间点(测试# 1 - 5)。光刺激强度增加到3 cd·s / m2暗标准刺激和反应强度平均4闪光时间间隔为10秒后记录(测试# 6)。此后暗高强度反应了使用10 cd·s / m2;每隔20秒反应平均4闪光管理(测试# 7)。后两个录音描述反应从视杆细胞和视锥细胞的混合物。10分钟后的光适应背景亮度30 cd / m2明单,flash响应记录,使用3 cd·s / m2闪光刺激,平均32闪光的间隔0.5秒(测试# 8),其次是评价30 Hz适应光的闪烁的光强度刺激(测试# 9)。后两个录音进行以评估锥,锥途径,分别。数据是自动收集的简易闪存卡ERG单位,转移到电脑,打印和存储进行进一步分析。基本特性进行了评估和振幅和隐式时间——和b-waves测量如前所述[ 30.]。

ERG会话终止后注射盐酸atipamazole (Antisedan,辉瑞公司,圣路易斯,密苏里州)是管理肌内扭转深度镇静(在一个剂量比高于给定medetomidine,即。,类似卷注入)。

 2.5。形态

在主人的请求由于医疗无关的问题,三个美国ESS狗安乐死和眼组织用于本研究。先进PRA被诊断的两个狗(9和6岁的职责),而第三只狗,3岁,有一个正常的眼底。安乐死是由静脉注入Beuthanasia-D-Special(先灵葆雅动物保健,奥马哈市东北)。每个狗的眼睛是无核的立即死后,每只眼睛的后段放置在固定的解决方案使用光和电子显微镜检查(LM和EM)。固定剂包括2.0%戊二醛、1.12%多聚甲醛,0.13钠甲次砷酸盐,0.13毫米CaCl2,pH值7.40。洗眼杯孵化了温柔的在室温下搅拌至少2个小时。洗眼杯被分段总值获得2×3毫米从以下地区:中央底部的一部分,颞视神经头(centralis-like地区)的区域,midperiphery优越,周边,伪劣midperiphery和外围。这些地区的样本后缀在1%四氧化锇和嵌入在环氧树脂。他们用0.17钠甲次砷酸盐,pH值为7.4,其次是二次四氧化锇固定在1%。随后,样本通过顺序孵化增加浓度的丙酮脱水,嵌入在环氧树脂。部分嵌入样本削减对LM和EM考试。LM, 1-micron-thick部分安装在玻璃幻灯片和甲苯胺蓝染色。对于新兴市场,部分是安装在铜网格和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。LM执行使用蔡司Axiophot显微镜和EM进行使用JEOL 1200 EX透射电子显微镜。

 2.6。统计评估

进行了描述性统计与蒙面ERG研究使用SAS v9(美国SAS研究所有限公司卡里,NC)的狗分为正常(包括纯合子的正常和杂合的狗)和狗的DNA分析的影响 RPGRIP1突变。由于小样本大小影响组和数据并没有显示任何极端的异常值,两个示例 tSatterthwaite近似的测试自由度允许不平等的团体利用之间的差异。由于团体之间的显著差异,结果被认为是重要的在0.01显著性水平。

 3所示。结果 3.1。视网膜变性的临床表征由于<斜体> RPGRIP1 < /斜体>突变

一个10岁的狗检查是由于严重的视觉问题报告的主人,首先指出在8岁。先进的视网膜变性的迹象被检眼镜检查观察这只狗。没有其他的11个狗检查视网膜疾病的临床症状(用检眼镜检查的改变或减少ERG响应)显示视觉问题直到6 - 9岁,根据业主。

最早用检眼镜检查的疾病的迹象出现在1.5 - 2岁的ESS狗,分别。均显示增加粒度在遥远的外围毯的眼底,用分钟hyporeflective棕色灰色斑点在遥远的绒毡眼底(图的边缘 2)。随着年龄的增加(3-8-year-old狗)这些异常变得更广义的扩散斑点状阴影毯的眼底和眼底颜色的变化。也有广义毯的反射率的变化(hyporeflectivity和运动的镜头用于间接检眼镜检查,其中一些地区成为hyperreflective)。在稍后阶段也有严重的衰减视网膜血管。9岁、广义观察终末期类型的视网膜变性与显著影响最大狗hyperreflective毯的地区,严重的衰减的视网膜血管很少有船只仍然可见,主要在中央部分的眼底。在这个阶段也有漂白穿插nontapetal眼底色素沉着过度。一个9岁的狗主要是正常眼底的外表虽然ERG检查显示减少锥和杆系统的反应。双边、继发性白内障(完整的和不成熟的类型)观察到12岁的临床影响本研究中描述的狗。

复合的眼底照片从一个两岁的ESS狗影响锥杆萎缩症和纯合的 RPGRIP1突变。中央眼底主要是正常而增加的粒度是midperipheral和外围观察眼底(明星)。也有轻微的视网膜血管血管直径和可变衰减(箭头)。

 3.2。在瑞典ESS Genotype-Phenotype评价

血液从14狗被包括在研究中十的狗被诊断出患有PRA。两例PRA是疾病导致RPGRIP等位基因的纯合子(−−),四人这些杂合的(+ /−)和四个的情况下正常等位基因的纯合基因型(+ / +)(表 1)。

 3.3。蒙面ERG研究

明显减少ERG反应观察4 6的狗,被诊断为纯合子 RPGRIP1通过血液检测(表突变 2)。4狗评估的三个基本特性的影响并没有显示任何明显缺乏视觉评价的所有者或考官。两个狗眼底正常出场,而其他两只狗和适度先进早期视网膜退行性变化,分别。两只狗,纯合的 RPGRIP突变,正常的基本特性,也ophthalmoscopically正常。

ERG的结果记录在一个正常的8岁的ESS和影响的两个狗,9和12岁,分别如图所示 3。评价一波振幅显示之间的显著差异影响组和杂合的,纯合子正常组,在0.01的显著性水平,当暗和亮标准强度反应比较( P < 0.0004 和 P < 0.0007 、职责)。b-wave这些差异也明显的相同级别的4 5暗低强度反应评估(# 2 - 5) P < 0.0084 ,0.0003,0.0005,和0.0020,分别地)和适应光的闪烁响应( P < 0.0032 )。——和b-wave隐含的时间没有显著差异,前者而后者明显长隐式时间被发现影响群狗与正常组相比暗标准刺激强度( P < 0.0066 )。ERG振幅和隐式时间细节见表 3。

ERG振幅和隐式时间正常和ESS狗戴面具的影响的研究。值,5日和第95百分位数为ERG和b-wave振幅在微伏(a)和(b)隐式时间以毫秒为单位,对正常和影响ESS狗。暗尔格由暗低强度的响应(S: 0.01 cd·S / m2),这是引起4、8、12、16、20分钟后暗适应指定:S1, S2、S3、S4, S5,暗标准强度的反应,Ssd: 3 cd·s / m2,暗更高强度的反应,Sh: 10 cd·s / m2。适应光的基本特性包括一个适应光的闪光回应:Psd,和30 Hz闪烁反应:Pfl,使用3 cd·s / m2对,至少10分钟后的光适应使用30 cd / m2的背景光。

响应 波 正常的 影响
中位数 5日 第95位 中位数 5日 第95位
S1 b 29.8 16.7 53.1 20.4 15.0 34.0
S2 b 61.6 40.2 101.3 37.7 35.4 45.0
S3 b 98.4 73.9 116.3 52.1 39.4 61.2
S4 b 122.8 78.8 146.4 56.2 50.9 71.2
S5 b 137.3 86.5 185.0 75.0 53.4 85.8
固态硬盘 一个 128.1 102.1 181.9 29.0 16.9 64.9
b 196.5 138.7 261.6 146.5 72.5 186.0
上海 一个 162.3 137.4 236.8 38.1 23.5 86.9
b 240.5 171.7 307.7 169.4 77.6 230.8
Psd 一个 8.3 3所示。9 11.5 3所示。0 2。5 3所示。6
b 30.8 13.8 35.0 15.4 6.6 24.9
Pfl b 34.1 15.4 47.5 15.0 6.9 22.6
响应 波 正常的 影响
中位数 5日 第95位 中位数 5日 第95位
S1 b 63.5 57.2 87.1 81.0 65.7 87.7
S2 b 75.8 69.2 92.4 84.5 78.5 91.7
S3 b 78.7 75.0 92.3 81.4 76.9 89.8
S4 b 82.3 73.6 95.3 80.3 76.3 96.0
S5 b 80.6 74.8 94.9 86.2 77.3 94.3
固态硬盘 一个 14.3 12.5 15.4 13.5 12.3 15.7
b 32.7 31.3 59.5 196.5 138.7 261.6
上海 一个 12.6 11.3 13.7 13.3 10.1 15.0
b 46.9 32.6 52.4 240.5 171.7 307.7
Psd 一个 10.6 10.0 12.0 10.0 9.0 12.8
b 21.6 20.0 23.5 30.8 13.8 35.0
Pfl b 21.5 20.4 24.8 34.1 15.4 47.5

暗和适应光的基本特性从一个正常的8岁的ESS狗和两个RPGRIP1−−/ ESS狗9岁的影响(1)影响和12年(2)的影响,分别。后者影响狗是正常的在9岁的时候用检眼镜检查的检查。12年岁只是稍微视觉受损,在适度晚期视网膜变性的检眼镜检查。S5:暗ERG响应使用10 mcd·s / m2光刺激后20分钟的暗适应,Ssd:暗ERG响应使用3 cd·s / m2在黑暗中光的刺激,Psd:适应光的使用3 cd·s / m ERG响应2在10分钟后的光适应(30 cd / m2背景光),Pfl:明ERG闪烁响应后30 Hz闪烁的光刺激的适应状态。

两只狗群,发现是纯合的 RPGRIP1突变通过血液测试,有一个和b-wave振幅和隐式时间值完全按照正常的狗。

为了评估如果锥系统的影响比杆系统的疾病,为每个计算百分比减少。这是通过比较平均响应的影响和正常狗,分别使用标准适应光的强度(测试# 8)和适应光的闪烁锥系统响应(测试# 9)和暗低强度刺激(测试# 5)杆系统。发现锥系统的影响比杆系统:降低46%和58%,分别为锥和减少44%棒影响组与正常相比ESS群狗。

 3.4。形态

光和电子显微镜进行使用视网膜部分3狗。两老狗用检眼镜检查的严重的迹象双边广义视网膜变性而年轻,一个3岁的ESS狗,表现出一个颗粒否则正常眼底的外观。最年轻的狗的DNA只获得了,显示的homozygocity RPGRIP1突变。

9岁的狗,双边萎缩性视网膜没有残余感光细胞和零星的残余细胞内的核和神经节细胞层观察,与视网膜神经胶质过多症(数字标记 4和 5)。

(一)光学显微镜(LM)的9岁的劣质nontapetal视网膜ESS的狗。严重的整个视网膜变薄与完整的感光细胞变性和内心的视网膜变性,瓦解和神经胶质过多症。(b) LM的优越的毯的视网膜。视网膜厚度的变化观察和一些地区的感光核一行仍然存在。甲苯胺蓝染色;×40。

视网膜超微结构的nontapetal (a)和绒毡(b)从同一狗如图 4。注意严重紊乱视网膜细胞内外层和结构。然而,RPE细胞层出现保存。在(b)的相对保留一些微小残余的视网膜光感受器细胞核内段(箭头)和大量的RPE顶端微绒毛。RPE:视网膜色素上皮细胞,T:绒毡层细胞。栏中描述了放大,是相同的(a)和(b)。

第二只狗的视网膜,6岁,显示出两国广义视网膜变性,完整的劣质视网膜萎缩,和缺乏感光细胞在这一领域,而在视网膜上1 - 2层感光核可以观察到。

3岁的狗,然而,表明主要正常视网膜形态学变化除了视网膜感光细胞层的位置检查:视锥细胞细胞核出现轻微异常,与密集的染色质和感光内段浓缩和萎缩(图 6)。光感受器外段不能清晰的可视化的薄片,因此他们的超微结构是不可能完全评估。

的外层视网膜超微结构正常的两岁的狗(a)和3岁的狗(b)的影响。注意在视网膜上锥体细胞核浓缩配置的受影响的动物(箭头所指)相比,正常的一个(在(a),箭头)和内部的黑暗出现段在视网膜上受影响的动物。栏中描述了放大,是相同的(a)和(b)。

 4所示。讨论

目前研究表明,大多数美国ESS狗与遗传性视网膜变性可以关联到疾病导致等位基因的纯合性 RPGRIP1基因。然而,四个6狗纯合的 RPGRIP1突变疾病的临床症状,同时2完全正常的出现都用检眼镜检查的检查和ERG。因此,一个清晰的观察genotype-phenotype不整合关于这组ESS狗。

大部分的基因和/或临床影响狗才显示出视力损害的迹象相对晚年和2临床完全正常。后者发现的原因是不清楚。它可能是 RPGRIP1插入本身不足以引起视网膜变性。似乎有可能额外因素的感光细胞死亡等额外的起始位点作为疾病的修饰词,描述了各种形式的PRA,例如,prcd和x连锁PRA ( 9, 31日]。也有可能是没有完整的外显率的突变( 32]。

类似的发现在可比人类临床研究观察到锥杆营养不良和一种退化。临床体征之间的表型变异影响个人和遗传性视网膜营养不良的发病已经观察到,人类锥杆营养不良(也通过功能测试 33]。初期症状的临床体征和时间的变化引起的视网膜病变尤其如此 RPGRIP1突变,一个变量遗传背景,如人口的情况。然而在纯种狗,更统一的表型是通常表示,由于越来越趋同的背景。这一事实适用于大多数形式的PRA;但是,对于遗传性锥体杆体营养不良观察长毛和短毛腊肠犬,与 RPGRIP1和 NPHP4分别突变,严重的异质性被描述为( 22, 27, 34]。

视网膜变性的ESS狗临床症状通常出现在晚年相对,业主往往很难评估。对于大多数受影响的狗在本研究观察到业主没有指出任何视觉障碍。的主人从本研究描述了一个11岁的狗,狗还能玩一个透明的飞盘,可以很容易地走在光线暗的条件下室内楼梯。这只狗有适度先进的视网膜变性ophthalmoscopically可见变化,是纯合的 RPGRIP1突变。另一只狗显示视网膜变性的临床症状已被兽医眼科医生诊断为ophthalmoscopically正常一年以前,7岁。基本特性表明,然而,严重降低视网膜功能按照锥杆萎缩症。

锥的感情很可能在疾病发病早期,和缺陷的狗学会忍受,只要其杆功能是正常的。形态的一个3岁的ESS狗,纯合子 RPGRIP1突变,显示超微结构变化特别是在视锥细胞,而杆感光细胞仍正常。可能是视觉问题变得明显临床在以后的生活中当棒开始退化。此外,第二阶段似乎发生在一个时间点的变量,但通常直到晚年,那么比较快导致广义严重视网膜变性(视网膜萎缩)。

ERG录音被证明是有用的在蒙面的研究目前调查客观检测减少感光功能萎缩症由于依照锥杆 RPGRIP1突变。在两种情况下,然而,在基因功能影响个人被发现在正常范围内。这些不和谐的临床结果符合不完全外显率的突变,但以前列举其他因素也可能参与其中。

其他受影响的基因或突变 RPGRIP1也可能出现在ESS品种。在至少一个突变基因,普遍32犬品种,prcd, ( http://www.optigen.com/,2011)。这也可能是一个候选基因,因为它是已知的影响英语和美国可卡犬的犬种,远亲ESS狗(Liz汉森、个人通信2006)。其他的一些突变导致狗主光感受器一种退化ADAM9 [ 35],CCDC66 [ 36],CNGB3 [ 37,现场 38],ρ[ 39],RPE65 [ 40],VMD2 [ 41],PDE6beta [ 42],PDE6A [ 43),和PDC ( 44]。

在ESS狗以前十PRA病例诊断在瑞典,从DNA用于当前的研究,只有两个人疾病导致等位基因纯合子 RPGRIP1轨迹。四是杂合的,四人正常野生型等位基因的纯合子(表 1)。的两种情况是纯合子RPGRIP1插入被诊断出患有PRA在2到4岁,分别。病例数虽小似乎有一种倾向为以后出现PRA在另8例。没有一个正常的狗被发现是纯合子在瑞典RPGRIP1插入样品,但做出任何推断外显率,需要更大的数据集。综上所述,瑞典样本的研究表明,至少有一个更多的基因负责PRA瑞典人口。

完整的联系 RPGRIP1和PRA在ESS因此还有待充分阐明。有确凿的证据说明 RPGRIP1基因参与所述锥杆萎缩症,但genotype-phenotype不整合观察表明,遗传背景最可能是更复杂的比之前的怀疑。总之,有很强的迹象表明其他突变或调制基因可能参与锥杆ESS狗的营养不良,也可能诱发其他类型的遗传性视网膜一种退化的品种。进一步的调查关于发展所需的额外的基因座或基因cord1因此是必要的。

视觉研究的一个重要目标是提供有效的治疗与视网膜致盲疾病影响的数百万人。治疗用狗和猫等大型动物模型是有效的和必要的方法来利用之前与人类治疗试验。证据的原则是通过使用基因疗法治疗研究狗的LCA模型( 45),导致成功的恢复视力。人类患者类似的程序进行了成功的结果( 46, 47]。视网膜致盲疾病的另一个有前途的治疗方法是干细胞治疗,有或没有的基因治疗( 48]。在准备这样的研究,然而,至关重要的,其特定的视网膜疾病的动物模型是精确的临床特点事先和分子方法,最大结果的转化过程。

 确认

作者要感谢英国史宾格犬的喂养者和主人与他们的狗狗眼睛参加考试,这使得这一研究成为可能。加里·s·约翰逊和莉斯汉森博士提供DNA ESS狗从遗传学部门数据银行蒙面的研究中,感激地承认。他们还要感谢Leilani Castaner霍华德·威尔逊和黛维达Myrby杰出的技术援助。本文由美国养犬俱乐部,华奥的联合研究基金和瑞典养犬俱乐部和英国史宾格犬繁殖俱乐部在瑞典和美国。

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