SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 303610年 10.1155 / 2012/303610 303610年 临床研究 优化的参数更有效地使用脂肪中提取干细胞再生医学治疗 Aguena Meire 1 Dalto Fanganiello 罗伯特。 1 Tissiani 路易斯Alexandre Lorico 2 Ishiy 菲利普奥古斯托·安德烈 1 大学生Atique 罗德里戈 1 阿隆索 Nivaldo 2 Passos-Bueno 玛丽亚丽塔 1 Schlenke 彼得 1 生物科学学院 圣保罗大学 05508 - 090圣保罗 巴西 usp.br 2 部整形手术 医学院 圣保罗大学 01246903圣保罗 巴西 usp.br 2012年 14 3 2012年 2012年 27 09年 2011年 15 12 2011年 03 01 2012年 2012年 版权©2012 Meire Aguena et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

脂肪干细胞tissue-derived(对asc)协会在自体脂肪lipotransfer承诺一个更有效的软组织重建,对asc和优化协议隔离从lipoaspirate脂肪是急需的。我们表明,增加脂肪细胞的分化依赖于对asc的数量。在10个捐助者的样本,我们发现更高浓度的有核细胞相比,小腹侧面( P = 0.015 )。样本6捐赠者的细胞中我们没有发现差异收益率通过手动或pump-assisted愿望( P = 0.56 )。我们建议的数量的增加对asc注入的脂肪可能提高效率的新形成的脂肪组织,获取脂肪组织的解剖区域需要考虑优化收获组织对asc的数量。最后,pump-assisted愿望可以使用没有任何重大伤害细胞的可行性。

 1。介绍

脂肪转移已经使用在过去的几十年中作为自体动态填充在整形手术康复在一些情况下,比如在重建受损由于燃烧脂肪组织损伤、颅面重建由于先天性缺陷或损伤,在其他癌症或肿瘤以及审美的原因。尽管这种方法被认为是成功的,几个外科干预的需要达到目标的结果并不罕见。因此,开发的替代协议实现更有效的重建软组织的主要兴趣。如今,当前的承诺是提高脂肪组织生存的脂肪移植和干细胞疗法的结合,特别是使用脂肪tissue-derived干细胞(对asc),由于干细胞可能改善新血管形成和部分阻止炎症反应 1, 2]。

脂肪干细胞tissue-derived(对asc)可以很容易地隔绝stromal-vascular分数(SVF)人类脂肪组织通过简单的外科手术,可以重复获得,大量,在某些情况下,在局部麻醉的情况下,可以接受 在体外向成骨分化,脂肪形成的,神经源性肌原性的,chondrogenic血统当处理特定因素( 3, 4]。Multipotentiality对asc使他们有趣的和有前途的候选人为中胚层的缺陷修复和疾病管理( 5]。

无论使用脂肪组织作为唯一实现材料对asc或实现,有几个问题有待解决,以提高其在组织再生治疗的可行性。例如,它是不清楚是否对asc的百分比在注入的脂肪组织会影响脂肪组织再生的效率。此外,解剖施主能级的影响在间充质细胞的数量和类型仍然是不确定的:虽然一些作者建议subabdominal地区是最丰富的站点间充质干细胞(msc) [ 6, 7),其他人指出臀部的最佳组织提取msc。被评估的另一个重要的问题是获取方法,一些作者建议pump-assisted技术的使用减少的可行性有核细胞( 8]。考虑到这些因素可能控制的外科医生,他们的理解当然会有影响最后的浓度对asc lipoaspirate[中包含 9]。

针对上述问题,这项工作的范围是调查如果对asc的比例影响的效率 在体外脂肪生成和比较的有核细胞数量SVF根据收获面积和最后,收获方法。

 2。材料和方法 2.1。道德声明

本研究通过生物科学研究所的人类研究伦理委员会(允许095/2009-FR251136)。

 2.2。Lipoaspiration手术

Lipoaspiration是由10毫升注射器耦合到套管直径2,5毫米,使用科尔曼方法( 10)或监管pump-assisted吸脂−350毫米汞柱使用套管直径3毫米。泵和手动lipoaspiration比较实验,10个捐助者被提交给sub-abdominal抽脂的右侧与手工方法和左侧sub-abdominal泵的方法。侧面和腹部比较实验,6捐助者在这些不同的解剖网站提交给抽脂,与传统的泵吸lipoaspiration方法。为了减少个人之间的差异,样本从不同的位置和使用不同的方法测试获得的配对在每个系列的主题。

 2.3。脂肪干细胞(对asc)隔离和扩张

从sub-abdominal和侧面皮下脂肪组织lipoaspirates得到传统泵吸从六个健康女性接受整容手术过程。在另一个实例中,脂肪组织从sub-abdominal地区10个健康女性被pump-assisted吸脂,孤立与负压控制,或手动lipoaspiration。脂肪组织是洗广泛与无菌磷酸盐(2.7毫米137毫米氯化钠,氯化钾,10毫米NA2HPO4, 2毫米KH2PO4 pH值7.4,从Sigma-Aldrich试剂)去除污染碎片和红细胞。洗脂肪组织处理0.075%胶原酶(IA型;Sigma-Aldrich)在PBS 40分钟37°C与温和搅拌)如前所述 4]。哈佛商学院的胶原酶灭活了2卷(表达载体、钙、美国),infranatant离心5分钟在3000 g。关于样品用来测试是否有收获细胞浓度,压力的影响细胞颗粒七样品通过pump-assisted抽脂和七个匹配样本通过手动lipoaspiration resuspended在DMEM F12(表达载体、钙、美国)补充15%的边后卫(Hyclone), 1%非必需氨基酸(表达载体、钙、美国),1% penicillin-streptomicyn(表达载体、钙、美国)和播种在常规组织培养瓶immunophenotypical鉴定。

 2.4。细胞计数

可行的细胞数用台盼蓝染料排斥试验。刚做好的解决方案10 ul 0.05%台盼蓝(西格玛奥德里奇)蒸馏水混合10 ul细胞悬浮液的5分钟。可行的细胞数在纽鲍尔室使用光学显微镜(尼康Eclipse TS100)。

 2.5。Immunophenotyping

Immunophenotype表征细胞群是由流仪分析。用于细胞的比较收益的样品根据解剖区域,我们执行这个描述使用新鲜孤立stromal-vascular分数和每个示例分析是一个池stromal-vascular分数的五位女性捐赠者。用于比较的样本的细胞产量取决于抽脂技术,镀细胞培养用PBS洗净,用胰蛋白酶消化解决方案(0125%胰蛋白酶、0、02% edta在PBS)。这些细胞被孵化1小时在4°C以下反抗体:CD29-PECy5, CD34PerCP, CD31-PE, CD45-FITC, CD90-R-PE, CD73-PE, CD105 (Becton, Dickinson和公司、新泽西、欧洲大学协会)和SH2 SH3, SH4轻轻地由阿诺德·卡普兰教授捐赠(凯斯西储大学)。只匹配控制样本孵化与PBS。与PBS,第二次洗后样品孵化与non-conjugated第一抗体与anti-mouse-PE孵化第二抗体(番石榴技术)对额外15分钟在4°C。细胞悬浊液洗了PBS、固定1% p-formaldehyde (Sigma-Aldrich)和5.000标记细胞进行了分析使用一个番石榴EasyCyte流式细胞分析仪运行番石榴表达+软件(美国番石榴技术海沃德,CA)。

 2.6。异构ASC和成熟的纤维母细胞文化的准备

冠状缝骨膜纤维母细胞细胞谱系和脂肪衍生干细胞谱系增长到80 - 90%融合在独立的烧瓶。细胞谱系胰蛋白酶处理0125%,0,02% EDTA(表达载体、钙、美国)和悬浮细胞在不同浓度的混合这两种细胞谱系,如下:5% ASC和95%纤维母细胞;25%的ASC和75%的纤维母细胞;50%的ASC和50%的纤维母细胞;ASC只有75%的ASC和25%的纤维母细胞和100%。细胞被镀的浓度为104/厘米2为每一个实验。这些混合单元血统被播种在12孔板,24小时后,混合细胞诱导脂肪形成的分化。

 2.7。体外<斜体> < /斜体>脂肪形成的分化

诱导脂肪细胞的分化,细胞培养的脂肪形成的感应中DMEM高葡萄糖补充10%的边后卫(Gibco-Invitrogen、钙、美国),1% penicillin-streptomycin(表达载体、钙、美国),1 μ地塞米松(Sigma-Aldrich), 100 μ吲哚美辛(Sigma-Aldrich), 500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)和10 μg / mL胰岛素(Sigma-Aldrich) 14天。

 2.8。油红O染色和量化

油红O染色,细胞培养在12-well文化板块,对每个实验;4井条件。去了14天后,细胞与PBS洗,固定在4%甲醛1小时,然后用去离子水细胞被洗。后,细胞用60%异丙醇,细胞板在室温下干燥。这些细胞被沾0.6% (w / v)油红O解决方案(60%的异丙醇,40%水)在室温下1 h。细胞然后用去离子水洗涤三次去除游离染料和拍照。油红O染色也筛选了异丙醇为100% (v / v)和量化测量的光学吸收500海里。油红O染色的未分化的细胞生长并行文化作为空白样本化验。

 2.9。统计分析

连续变量被平均值和标准偏差表示单独或和我们使用了非参数Wilcoxon符号秩检验成对的数据以评估如果人口意味着等级不同。评估统计学意义pump-assisted之间的相关性和手动抽脂和对asc的百分比之间的混合细胞数量和脂肪形成的分化我们使用双尾皮尔逊相关测试。测试 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有应用的测试是通过使用GraphPad棱镜5项目。

 3所示。结果 3.1。的浓度的影响脂肪干细胞在体外<斜体> < /斜体>脂肪形成的分化

评估如果有脂肪的浓度的影响干细胞的效率 在体外脂肪形成,我们创建了五个异构混合亚种群组成的细胞培养对asc和成熟的成纤维细胞来源于颅冠状缝,诱导他们去和量化形成的脂质空泡油红色的o染色后14天(图 1)。应用线性回归模型,显示在图 2之间有显著相关性,对asc的百分比和增加石油红色的o染色( R 2 = 0.979 )。

石油红色的o染色 在体外对asc脂肪形成的混合种群的分化和成熟的成纤维细胞。对asc百分比显示的比例。拍照的10倍放大显示在上面的线和拍照20 x放大显示在低线。

线性回归显示显著相关性对asc的比例混合单元人口和石油的增加红色的o染色( R 2 = 0.979 )。误差线代表每个样本的标准差为一式四份。

 3.2。供体细胞浓度的影响

为了确定间充质细胞的数量和比例变化根据捐赠者的脂肪组织,我们评估细胞从SVF六女患者平均年龄37岁(范围、26-51年)提交到下腹部抽脂,后侧面医学建议。我们观察到更高浓度的有核细胞脂肪从小腹脂肪相比,从侧面( P = 0.015 ;数据 3(一个)和 3 (b))。

棒图显示(×10 (a)细胞数量6)每卷的脂肪组织(mL)从腹部或侧面从6个人和(b)的平均值和标准偏差数据显示在图“a”。的Wilcoxon符号秩检验表明样品之间的显著差异( P < 0.05 )。

作为显示在图 4 ,我们观察到更高比例的间充质细胞阳性(79.7 -84.7%)和粘附细胞标记(CD29;96%)样本中分离出腹部比从侧面获得样品(24.36 -28.40%和50.48%,分别地)。此外,旁边有一个更加突出的样本分组人口造血(53.75%)和内皮细胞的起源(21.56%)相比的腹部(29.38和15.8%,职责)。

Immunophenotype表征新鲜的人类间质血管分数从脂肪组织分离。捐赠者是提交给抽脂(腹部和侧)在两个不同的网站,和每个样品分析是一个池stromal-vascular分数的五位女性捐赠者。直方图为每个示例(区域显示在黑色)比较细胞数量和荧光强度和匹配-控制(区域显示在灰色)。积极染色细胞的百分比是每个直方图显示以上。

 3.3。1通道后收获方法对细胞浓度的影响

一组由10位病人,平均年龄49岁(范围、22 - 73年)和平均身体质量指数为24.88(范围、22 - 29.6),提交给sub-abdominal抽脂根据医学建议,被用来评估如果有影响的收获方法SVF有核细胞的产生。抽脂术进行应用2常用的获取方法:手动使用注射器和pump-assisted愿望,愿望与−350毫米汞柱压力控制。在文化1通道后,获得的细胞吸气手动和pump-assisted愿望显示阳性染色(> 89%)间充质(SH2 3和4)和附着力(CD29)标记和负染法(< 4%)对造血(CD45)和内皮(CD31)标记。褶皱的变化差异pump-assisted方法计算获得的细胞的数量相比,手动愿望和在图表示 5(一个)。应用线性回归模型(图 5 (b)),没有统计上的显著差异在使用这两种方法获得的细胞产生。

(一)条形图描绘了日志2褶皱的变化量之间的细胞通过pump-assisted方法相比,细胞的数量通过手动愿望十个人。(b)线性回归模型显示无统计差异在细胞数量取决于使用的吸脂方法。山坡上的不同实验数据的线性回归(黑线)并不重要( P = 0.56 )相比,理论线(虚线,构造假设数据)之间没有区别。

 4所示。讨论

自体脂肪移植的大量转移,脂肪生存需要而非纤维化。其他预期的特征,通常是高度可变的,是脂肪移植的临床寿命和维护移植脂肪的体积。修改这些变量,干细胞疗法的结合与脂肪转移,补充脂肪和脂肪中提取干细胞移植,据报道自体组织移植的方法称为cell-assisted lipotransfer [ 9, 11, 12)和几个病人的康复是一个承诺。

使用一个 在体外掺合料异构模型细胞群我们发现之间的正相关关系对asc和增加的百分比 在体外脂肪细胞的分化。因此,我们建议的数量的增加对asc在注入的脂肪组织可能会加强新形成的脂肪组织的效率。这些结果将支持这个想法,浓缩的脂肪组织间充质干细胞可以影响病人的康复过程提交自体脂肪移植( 5]。

因此,建立理想的参数优化可行的间充质细胞的数量,如沉降首选的lipoaspiration捐助网站对asc隔离和确定lipoaspiration干涉的方法间充质细胞的数量和质量肯定会导致一个更成功使用富含脂肪移植间充质细胞。

的寻找更高浓度( P < 0.05 )的下腹部有核细胞相比,旁边加上丰富的观察族群间充质来源的细胞样本的小腹表明SVF小腹可能比脂肪组织来源的间充质干细胞分离从侧面。我们的研究结果是一致的的工作Padoin et al。 7],在那里他们发现了一个更高的浓度有核细胞从小腹获得SVF相比,上腹部,大腿内侧,转子的地区,膝盖,和侧面。更加与众不同等。 6还建议,CFU化验后,腹部比臀部大腿/地区获取间充质干细胞。

如果我们考虑间质细胞的数量和类型,因此,下腹部的脂肪组织比那些从侧面。然而,进一步的研究是必要的为了阐明功能影响组织再生,因为我们不知道更高比例的造血和内皮细胞包含在旁边可能会促进新血管形成,为手术的成功是至关重要的过程。

我们并没有发现显著差异在SVF细胞产量比较手动抽脂使用注射器或pump-assisted lipoaspiration。事实上,弗雷泽et al。 13还测试了这两种方法的脂肪组织愿望和得出结论,单独使用细胞的频率没有影响收获方法。尽管这些数据显示没有影响这些方法SVF有核细胞数量、Mojallal等的研究。 8)得出的结论是,抽脂术在−350毫米汞柱压力控制提供了更大的细胞产生助力的愿望相比,负压700毫米汞柱和注射器抱负。然而,这些结果应该谨慎考虑,因为他们执行这个测试只使用3例。

在本文中,我们表明,即使没有区别的有核细胞获得的收益率使用注射器或手动愿望与pump-assisted愿望−350毫米汞柱压力,收获的解剖区域的脂肪组织需要考虑来优化SVF有核细胞的总数,因此,脂肪干细胞和祖细胞的数量。在可预见的未来,实现cell-assisted lipotransfer将导致改善fat-grafting结果为审美或恢复组织重建的目的。此外,我们的研究结果支持假设浓缩脂肪组织的间充质干细胞后,将改善再生过程cell-assisted lipotransfer。

 作者的贡献

m . Aguena和r·d·Fanganiello贡献同样这项工作。

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