SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 175979年 10.1155 / 2012/175979 175979年 评论文章 间充质干细胞和心血管疾病:基础研究到临床应用的路线图 礼拜日 曼努埃尔 Arana 米利暗 Pelacho Beatriz 繁荣 菲利普 瓦格纳 沃尔夫冈 血液学和细胞疗法 我们西班牙纳瓦拉大学 西班牙纳瓦拉大学基础医学研究应用 加拉卡斯Pio十二36,潘普洛纳 31008年西班牙纳瓦拉 西班牙 unav.es 2012年 24 10 2011年 2012年 01 09年 2011年 13 10 2011年 2012年 版权©2012•曼努埃尔•梅佐et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

近年来,干细胞研究的难以置信的提高了患者和医生的期望。间叶细胞的祖细胞,由于他们的可用性,易于操纵,和治疗的潜力,已成为最具吸引力的选项之一来治疗各种疾病,从软骨缺陷心脏疾病。此外,他们的免疫调节能力开辟了同种异体的使用,从而扩大其应用的可能性。在本文中,我们将关注他们的使用在心肌梗死的治疗,观察其特征, 在体外和 在活的有机体内的作用机制,以及临床试验。

 1。介绍

尽管传统上被视为健康问题尤其是工业化世界,相关的心血管疾病是现在全世界死亡的第一原因 1),与心肌梗死(MI)导致死亡人数的12.8%。除了生活方式的变化与经济和社会发展的一个主要原因是MI是一个不断发展的疾病。缺血性事件后,厌氧条件下迅速引起大量细胞死亡,不仅涉及心肌细胞(CMs),而且血管细胞。虽然生物试图施加一个补偿活动(了 2])在第一阶段的疾病,甚至能部分恢复功能,由此产生的疤痕不会添满,无情地领先的心脏衰竭的病人向设置。因此,虽然不是传统认为是这样,心脏疾病是一种退行性情感,缺乏足够的收缩和血管细胞导致失代偿性的神经激素的微环境( 3),从而进一步损害器官功能和细胞生存。

尽管干细胞的存在已经是一个众所周知的事实对近半个世纪 4),在过去的15年里经历了重大推动。能力分化使得干细胞治疗退化性疾病的优秀候选人,代替细胞障碍的过程中丢失了。因此,心脏疾病和MI强烈研究的对象( 5]。在细胞类型研究,间充质干细胞(msc)是强有力的候选人在MI设置成功。在接下来的页面中,我们将讨论他们的能力以及预处理和临床调查,这些细胞已经被使用。

 2。起源、类型和特点

Friedenstein及其同事的研究被认为是第一个报告MSC ( 4]。在这些,单独使用的潜在人口骨髓(BM)派生的基质细胞,称为成纤维细胞克隆形成单位,检查。BM确实是最著名的祖细胞的来源之一,MSC被其中[ 6]。虽然这并不完全理解,BM-MSC被认为作为支持者和养育者骨髓内的其他细胞( 7- - - - - - 9),可能在一个位置接近血管( 10]。然而,有一个相对较小的人口(0.01% - -0.0001%的有核细胞在人类BM [ 11),所以MSC可以很容易地净化后由塑料坚持和扩大BM提取。同样,但添加简单的机械和酶处理、混合细胞群(称为基质血管分数,SVF)可以分离出脂肪仓库,后 在体外文化和均质化,产生的间叶细胞祖细胞组织,也称为脂肪干细胞(ADSCs) [ 12]。脂肪组织被认为是更丰富的祖细胞来源,窝藏在BM的数字(100到500倍 13]。然而,尽管相似的表型、分化或生长动力学、功能存在一定差异,基因组和蛋白质组水平( 9, 14),暗示某种程度的承诺的BM-MSC chondrogenic和成骨的血统高于ADSC [ 15]。

脂肪组织和BM是研究最广泛的间叶细胞祖细胞的来源,因为他们很容易收获,由于祖细胞的相对丰度和缺乏道德问题。然而,msc已经无所不在地发现在很多不同的位置,脐血( 16],牙髓[ 17],经血[ 18),或心脏 19)等(了 20.])。这各种各样的起源、方法和缩写了标准化在2005年由国际社会对于细胞治疗,这对MSC设置最低要求(表定义 1)。首先,MSC必须plastic-adherent保持在标准培养条件。其次,MSC必须表达CD105、CD73 CD90、CD45和缺乏表情,CD34, CD14或CD11b CD79a或CD19和HLA-DR表面分子。第三,MSC必须分化成骨细胞,脂肪细胞,内层 在体外( 21]。不过,必须采取谨慎一些报告不符合这些标准,和MSC通常是用于“骨髓基质细胞,间充质基质细胞或骨髓干细胞。”因此,澄清发表在MSC被定义为“多能间充质基质细胞” 22),添加支持房地产所需的特征( 23]。

MSC定义标准化的要求。

多能间充质基质细胞(MSE)的属性
(我)塑料的依从性
(2)细胞表面抗原表达谱
CD73+,CD90+CD105,+,HLA-DR−,CD11b−,CD14−,
CD19−,CD34−、CD45−,CD79 α−
(3)Multipotency
成软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞
3所示。msc心脏再生必须提供什么?

当考虑心脏组织再生的目标,期望的目标必须包括三个目标:(i)的生产替代心肌质量,(2)功能性血管网络的形成来维持它,和(3)心室受损的返回适当的几何形状。细胞疗法理论上可能影响这些过程在两个方面:通过直接移植细胞的分化所需的血统或其生产的分子治疗潜在的(图 1)。

主要MSC动作受伤的心肌。间叶细胞祖细胞移植到缺血心肌能够分泌过多的治疗性分子(旁分泌活动),甚至对(有氧运动)来区分血管血统,鼓励受损组织的愈合,避免其过渡到一个伤痕累累肌肉,心脏组织主要在血管再生水平。缩写:igf - 1:胰岛素样生长因子- 1;SDF-1:基质衍生因子- 1;VEGF:血管内皮生长因子;HGF:肝细胞生长因子;MMP:基质金属蛋白酶;LV:左心室。

BM-MSC显示他们 在体外引起内皮细胞的能力(ECs) [ 24, 25)和平滑肌细胞(smc) [ 24]。心肌细胞分化问题,是脱甲基特工曾( 26),或者效率低下和不完整 27, 28]。相比之下,ADSC的心脏可能是更好的记录 在体外,显示他们的能力产生厘米,通过使用DMSO ( 29日)提取或厘米( 30.]。此外,ADSC似乎港祖的特征子集的表达Nkx2.5和Mcl2v 31日),其分化依赖于自分泌/旁分泌血管内皮生长因子(VEGF)的活动 32]。SMC ( 33和电子商务 34)已经从脂肪细胞,但必须要有警示,这些研究要么依靠新鲜孤立的细胞或文化的亚种群在differentiation-promoting介质在净化间充质人口(之前 35, 36]。最后,其他间叶细胞祖细胞也厘米或CM-like细胞分化,如月经血液MSC ( 18]或脐血MSC ( 37]。

然而,尽管它是非常有趣的,这种分化潜能必须应对两种对立的因素。首先,接受干细胞治疗的病人严重病变,通常老年人,两个因素,一个杰出的对干细胞功能的影响。例如,减少循环内皮祖细胞的数量和功能与心血管疾病风险直接相关,吸烟 38, 39)和年龄也已被证明能够削弱ADSC的血管生成能力( 40]和BM-MSC [ 41]。第二,道细胞的小比例(见[ 42]审查)耦合造成的巨大灾难MI(在某些情况下损失超过10亿厘米( 43])和低分化率即使在实现 在体外受控条件使添加少量的细胞治疗低效的方法。

然而,分泌有益分子已经证明能够发挥积极作用,即使几道细胞离开( 44]。这些分子可以诱导效益增加组织灌注,减少胶原蛋白沉积和纤维化,增强宿主细胞生存,或吸引/调节内源性祖细胞。因此,陈和同事相比BM-MSC的表达谱和真皮成纤维细胞( 45),这表明间充质祖细胞分泌较高数量的一些分子,包括强有力的proangiogenic细胞因子VEGF或趋药性的基质衍生因子- 1 (SDF-1)。从BM-MSC条件培养基诱导EC和巨噬细胞的招募,并改善伤口愈合。此外,它最近表明serum-deprived BM-MSC获得欧共体特性和增加VEGF的释放或肝细胞生长因子(HGF),另一个强有力的血管生成分子( 46已报告),这两个被ADSC[分泌 32, 47, 48]。此外,3月博士的研究小组证明ADSCs pericytic自然,能够形成和稳定功能的血管网络和内皮祖细胞(混合在一起的时候 49]。BM-MSC显示强大的antifibrotic行动,作为他们的条件培养基降低心脏成纤维细胞增殖和胶原蛋白的表达类型我和III ( 50, 51),增加分泌antifibrotic分子如基质金属蛋白酶(MMPs) 2, 9日和14日 52]。这些细胞表达五种MMP(2、13和膜type-MMP 1 2和3),能够通过I型胶原膜(交叉 53),从理论上讲,它将允许他们贩卖infarction-derived疤痕。同样,ADSCs生产转化生长因子(TGF -) β1 ( 54),一个强有力的监管机构的纤维化。作为一个整体,这些例子证明间叶细胞祖细胞的旁分泌介质梗塞进化能力有相当大的影响。

最后一个值得注意的能力是能力BM-MSC ADSC,调节免疫反应。骨髓来源间充质祖细胞抑制激活T细胞的增殖和细胞毒性T细胞的形成 55),诱导抗炎表型,这将允许他们的同种异体的使用和适用性的范围大大拓宽。然而,黄等人报道,分化能力降低免疫逃避( 56),增加了相关免疫刺激性分子MHC-Ia和二世和免疫抑制MHCIb减少。类似,麦金托什和同事报道,adc超出通道(因此一个没有污染的分化细胞( 57])未能引起从外源的T细胞反应 58),但这个属性可能会减少在炎症刺激下,如图所示 在体外( 59]。

最后,爆发以来诱导多能干细胞(万能) 60),间充质细胞进行了调查( 61年, 62年)由于其相对容易获取和效力高于其他细胞类型(例如,真皮成纤维细胞),显示出提高效率,即使没有致癌基因的原癌基因。他们支持能力也取得了优秀的候选人取代老鼠细胞成为喂食器( 63年, 64年]。

 4所示。MSC在心肌梗死动物模型

然而,尽管所有的积极特征间叶细胞祖细胞已经描绘他们 在活的有机体内测试在疾病的动物模型是强制性的。在这方面,可以找到三个不同的设置。首先,急性设置,在数小时内细胞移植的心肌梗死。这里,炎性微环境和细胞坏死或凋亡信号释放居民( 65年, 66年)是主要的反对势力的细胞治疗活动。然而,自导信号( 67年)和一个antifibrotic环境( 68年可能会有积极的影响。同时,从实用的角度,处理急性模型提供了对动物的优点只有一个手术,当时的MI(或几分钟后它),应用细胞,从而降低死亡率和侵袭性。因此,大多数的报道用急性模型( 37, 69年- - - - - - 84年]。大多数研究(除了范德Bogt和两个同事( 74年, 77年])一直表明,治疗诱发心脏功能的一大收获,主要是通过旁分泌机制,诱导组织灌注的增加和减少疤痕的大小和胶原蛋白含量。

取得了类似的结果在第二个设置,慢性的。这里,发生缺血后的修复过程完成后,疤痕已经成熟,尽管新创建的血管网络,这是混乱和不充分 85年, 86年]。这些事实把一个很大的负担强加给细胞生存。然而,它必须考虑均匀的一代种群BM-MSC或ADSC需要数周的 在体外文化,因此,除非用于同种异体的设置,没有可能性的床边翻译使用的间叶细胞祖细胞急性设置。尽管如此困难,更少的报道处理这个问题( 87年- - - - - - 90年]。结果急性设置相比,间充质细胞疗法的长期梗塞的心对器官收缩性和组织学有积极的影响。

作为第三和中间位置,所谓的亚急性模型代表一种情况仍在血管生成过程,通过内皮祖细胞( 91年)或巨噬细胞( 92年),炎症的消退和纤维化的进程也在增加。与慢性模型,很少有报道在此设置 17, 18, 93年, 94年),但又好处和机制似乎是一致的。

然而,深入分析研究上面提到的,可以找到大量的信息在间充质祖细胞如何注入心脏病变已经聚集。陈等人表明,移植的BM-MSC在长期梗塞的兔子心里感应SDF-1的浓度的增加,引起的趋化性host-derived BM祖细胞(CD34+,CD117+,STRO1+)和有关功能效益,减少梗塞大小和改善组织血管化( 89年]。李和同事证明了功能的增强伴随着prosurvival基因表达增强的一种蛋白激酶( 95年]而米娅和他的同事们表明,收缩性和重构中获益 在活的有机体内伴奏 在体外通过大量antifibrotic行为( 52]。MI的绵羊模型群博士Spinale监控MMP的演变及其抑制剂,展示与移植细胞的数量( 75年]。像他们 在体外行为,一些出版物展示了proangiogenic活动之间的联系 在体外和血管生成细胞因子的分泌(无论是直接或host-derived) VEGF, HGF,或胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)等( 17, 84年, 93年, 96年, 97年]。这些能力是否与这些细胞的声称pericytic性质( 10, 48, 49)仍有待解决。

免疫调制(了 98年)在理论上提供了对msc的同种异体的使用意味着作为一个现成的产品(扩大发病前缺血和适用的需求)。两份报告将外源的的影响和syngenic注入BM-MSC在大鼠心肌梗死模型,与冲突的结果。Imanishi et al。 78年)表明,自体和同种异体细胞移植心脏功能改善4周后,仍在受损组织,不刺激被拒绝。黄和同事相反( 56)是动物长达6个月。Syngenic细胞刺激心脏复苏,但同种异体的治疗的效果是暂时的(重要的3个月后注射而不是6)和BM-MSC比他们的Syngenic同行早消失了。然而,这种差异可以归因于方法论的差异对移植的时间(急性和慢性resp。)或跟踪(1和6个月)。等价的,重要的是,结果从临床相关的大型动物模型的MI外源的细胞曾显示或正面( 99年, One hundred.)或没有功能的结果( 79年]。相比之下,当使用自体ADSC或BM-MSC [ 72年, 83年, 101年, 102年),报告显示一个健壮的和一致的细胞移植后功能恢复。因此,严格考虑建立动物模型必须考虑。

 5。问题,解决方案

尽管乐观,干细胞疗法适合改善显示特定的警告,即缺乏实质性的移植和细胞的持久性,高水平的死亡,和低 在活的有机体内分化能力。一些方法来试图解决这些问题包括遗传操作和使用 在体外细胞或生物材料的预处理。从这个意义上说,趋化因子受体CXCR4 / SDF-1轴已被严重剥削。马等人研究了心脏SDF-1表达式的峰值( 103年在大鼠心肌梗死,发现注射细胞在那个时间点(1天postinfarction)细胞移植和组织血管生成增加。程和同事移植受体CXCR4 BM-MSC工程过度表现,加强细胞归巢受伤组织尾静脉注射后( 104年]。同一组结合BM-MSC外围注入和粒细胞集落刺激因子、管理 在体外趋化因子受体CXCR4表达增加。然而,尽管移植是增加,没有发现心脏功能的影响( 105年]。黄和同事证明超表达的趋化因子受体CCR1但不是CXCR2与改善生存和移植小鼠模型的心肌梗死,也恢复功能( 106年]。

细胞存活心肌梗塞是由缺氧危及,炎症、氧化应激。刘等人策划BM-MSC过度表现血管生成素( 107年文化,提高耐缺氧和被翻译成增加细胞移植和功能和组织学恢复归纳。通过adenoviral hemeoxygenase-1转染的细胞过度显示优越的治疗能力,主要通过防止炎症和细胞凋亡 108年),而有针对性的Akt生产过剩MI MSC恢复心脏功能2周后通过旁分泌的行动,包括防止低氧诱导细胞凋亡、细胞因子的释放,保护组织的新陈代谢( 109年- - - - - - 111年]。其他人研究了抗氧化剂,如歌等人发表,活性氧(ROS)减少BM-MSC坚持衬底,但是当处理一个活性氧清除剂(N-acetyl-L-cysteine),提高移植和纤维化和梗塞面积的增加使得 112年]。Hsp20过度也从氧化应激保护MSC和改善他们的有益的活动 97年]。

然而,病毒或基因修饰细胞意味着某些风险,目前很难设计出治疗到床边。生物工程使用生物相容性材料来提高或直接细胞疗法和合成或自然派生系统已经使用。金和同事播种BM-MSC在保利(lactide-co-1-caprolactone)补丁应用于一只老鼠cryoinjury模型能够改善心脏功能,减少梗塞大小( 113年]。猪小肠黏膜下层,脱细胞基质,被用来治疗慢性心肌梗死的兔模型,显示出显著的收缩性和组织学中获益,以及细胞迁移对受伤的组织( 114年]。细胞板技术允许增加厚度通过叠加的结构,如图所示,陈et al。 115年],其移植鼠syngenic模型心肌缺血改善心脏功能以及通过移植细胞旁分泌治疗分子的分泌。Mori博士的小组相比细胞的移植片植入ADSC和成纤维细胞,显示效果优越的间叶细胞祖细胞 116年]。最近,自体ADSC被移植和同种异体的ESC-derived CD15+梗死的心脏祖细胞在一个猴子模型,演示的安全程序,虽然功能不是分析结果( 117年]。

最后,必须添加一个警告。疾病的动物模型是一个强大的工具来探索某种治疗的可行性,MSC治疗心肌梗死,尽管积极的和可重复的结果,啮齿动物,甚至更复杂的大型动物模型是简单化的人类疾病。如上所述,动物细胞疗法应用并不老,也严重病变,从而使任何结果,即使非常积极,只是一个线索或提示病人之前最后的应用程序,可以评估,真正的安全性和有效性。

 6。间叶细胞祖细胞和临床应用

几个与自体BM-MSC进行临床试验,证明其安全性当移植患者的急性或慢性心肌梗死( 118年- - - - - - 120年]。此外,第一个临床试验设计为随机研究显示3个月后心脏功能的改善急性心肌梗死患者冠脉内BM-MSC [ 120年]。的令人鼓舞的结果之前的临床试验,新大酒店/ II研究已经启动,包括transendocardial自体的细胞(hMSC或hBMC)在缺血性心力衰竭试验(TAC-HFT; http://www.clinicaltrials.org/NCT00768066/),MSC治疗的前瞻性随机研究接受心脏手术的患者(普罗米修斯)试验( http://www.clinicaltrials.org/NCT00587990/),经皮注射干细胞交付影响Neomyogenesis(波塞冬)初步研究( http://www.clinicaltrials.org/NCT01087996/)[ 121年),等等。

BM-MSCs来自同种异体来源的细胞作为一个现成的产品进行测试。第一大酒店,随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增研究是在53个急性心肌梗死患者,静脉注射收到三种剂量的BM-MSCs(0.5、1.6或 5 。 0 × 10 6 BM-MSC /公斤体重)来自一个单细胞供体(Prochymal;奥西里斯疗法,Inc .)或安慰剂 122年]。安全的过程证明,显示更少的室性心动过速,甚至更好的cell-treated组肺功能。同时,肾、肝和血液实验室指标两组相似,没有病人产生肿瘤。重要的是,显著增加检测的射血分数(EF)治疗的病人。磁共振成像substudy,细胞治疗,但不是安慰剂,左心室射血分数增加,导致不良的逆转重构后6个月的治疗。现在,第二期多中心试验ProchymalTM已经开始( http://www.clinicaltrials.org/NCT00877903/)。

此外,BM-MSC安全一直在测试期严重慢性心力衰竭患者,随机、单盲、安慰剂对照、剂量、多中心研究。在本临床试验中,患者接受的endoventricular注入同种异体BM-MSC产品(Revascor中胚层Ltd .)梗塞边境地带,没有报道手术并发症。分析获得的数据经过6个月的跟踪( http://www.mesoblast.com/newsroom/asx-announcements/archives/)明显下降的患者数量严重或任何主要不良心脏事件,如复合心脏死亡、心脏病,或需要冠状血管再生过程。此外,第一个队列研究( n = 20. 患者)接受低剂量的细胞治疗,显示出显著增加更大的EF(与对照组相比 123年]。

另一方面,关于其他MSC如脂肪组织来源,没有临床试验已经开始,尽管ADSC的有益的潜力已经功能型证明( 83年]。直到现在,只有noncultured脂肪间质血管分数被测试在临床水平。第一项研究中,双盲,安慰剂对照试验名叫阿波罗( http://www.clinicaltrials.org/NCT00442806/;( 124年])在AMI患者自体脂肪衍生干细胞内,被证明是安全的。现在,一项II期和III期推进审判已经开始评估他们的功效( http://www.clinicaltrials.org/NCT01216995/)。

一般来说,从执行的许多临床试验获得的结果,与MSC或其他干细胞群体(主要是BM-derived细胞和骨骼肌成肌细胞),教会了我们一些重要的经验教训将有助于设计和解释下面的临床试验。(我)细胞治疗并非在所有患者同样有效。一般来说,似乎越心脏损伤(即严重postrevascularization LVEF减少或高度的梗塞transmurality),更好的造福移植诱导的细胞似乎是( 125年- - - - - - 127年]。(2)细胞治疗剂量和时间是至关重要的。因此,一个荟萃分析的结果最相关的临床试验患者在急性心肌梗死细胞显示患者大大增强效应,受到高剂量细胞(108细胞)。同时,相同的研究显示更有利的影响,细胞注入梗塞后第一周( 128年]。(3)自体治疗不一定是最好的。直到现在,大多数临床研究设计对于自体的细胞应用程序为了避免immunorejection移植的细胞。然而,它必须承担记住干细胞来自患者年龄在动脉粥样硬化或其他疾病的风险可能会有缺陷,从而,治疗可能不是有效的与细胞来源于年轻健康的捐赠者( 129年- - - - - - 131年]。在这个意义上,使用MSC,目前的免疫调节特性( 132年),可能的相关性。因此,同种异体MSC治疗的优点是,在假定的更大的旁分泌作用,同种异体细胞来源于健康的捐赠者可以发挥,充分测试的临床级可以使用同种异体细胞产品可以用于任何病人。重要的是,急性心肌梗死患者也可能有资格获得这样的待遇。此外,物流复杂性和制造成本,自体的细胞制备意味着将显著降低同种异体的应用程序。然而,应采取谨慎考虑问题时他们的免疫特权解释说。

因此,尽管它是强制性的,以更好地了解MSC表型转换的机制,阐明如何影响细胞的潜在好处,它认为,在任何情况下,因为MSC不会分化对心血管细胞并将作为旁分泌因子来源( 111年],永恒的心可能不是必要的治疗目的。在这种情况下,一个暂时的行动应该充分发挥其效益。第二期临床试验正在评估同种异体MSC治疗的疗效,与长期的安全。如果allogeneicity细胞减少它们的有效性,几个选项可以考虑,如颞病人免疫抑制和/或捐助者与接受者HLA-II最小化不匹配。因此,移植细胞的移植率增加到目前为止的一个主要挑战。作为已经表明,支架的使用可以改善这个因素。有趣的是,临床试验已经完成在15慢性心肌梗死患者治疗与胶原蛋白支架以前播种与骨髓单核细胞( 133年]。cellularized补丁被植入到心包,并且没有不良事件报告,显示了治疗的可行性和安全性。此外,限制影响心室壁重构和改善舒张功能被检测到。这些积极的结果可能会促进新的较大的随机对照试验,在间充质干细胞和其他人口可能测试与支架相结合,从而导致进一步的治疗使用干细胞。

 7所示。结论

间充质细胞引起了巨大的兴趣近年来由于其潜在的和多功能性。虽然我们现在才开始了解他们修理或诱导的机制受损器官的修复,他们的多效性的活动和技术易于操纵使他们适合使用MI的治疗。虽然等待随机,双盲,安慰剂对照的临床试验中,大群病人可能参与,可用数据演示的安全治疗和指向一个积极效果,进一步鼓励新调查。添加最新的改进,包括 在体外调节和生物工程,肯定会想进一步一步找到一个优化的治疗方案。然而,某些问题,主要是免疫调节能力和外源的使用,需要更好的理解。

 确认

这项工作是支持的资助FP (FP7 INELPY之下,学院祝您健康卡洛斯三世(ISCIII-RETIC RD06/0014 (FIS))和Ministero de Ciencia e Innovacion项目Internacionalizacion CARDIOBIO)和英国石油公司(Instituto de Salud卡洛斯三世(PI10/01621和CP09/00333 (FIS))。

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