皮肤穿孔活检(4毫米圆形)从所有个人使用一个标准的打孔切片( 21]。活检都来自上层内部的手臂,一个主要是远离阳光直射。我们使用一个标准的皮肤外植体培养技术通过削减活检组织成12 - 15块,放置2 - 3块到一个的糊化6-well板1毫升high-glucose DMEM, 20%胎牛血清,1 x不必要的氨基酸(NEAA), 1 x青霉素链霉素(P / S), 1 x谷酰胺(Glu)(都从英杰公司购买,卡尔斯巴德,CA)。产物的角化细胞首次指出镀后2 - 5天。细胞被扩大了使用标准的组织培养技术,细胞通过在confluency使用胰蛋白酶/ EDTA(表达载体)和15 - 20百万细胞。Miocells冻存银行。这项研究和协议制度审查委员会批准和所有科目给书面知情同意。病人临床信息提供了补充表1(见补充材料可用doi: 10.1155 / 2012/140427)。

则都是派生的使用逆转录病毒系统提供四种基因编码OCT4、KLF4, SOX2 cMYC(从Addgene质粒17217,17218,17219,17220, http://www.addgene.org/)使用出版协议 22, 23]。所有线都为多能性的特点,分化潜力分为三个胚芽层,karyotypically正常genotype-match父母的成纤维细胞,(见补充表2)。在IPSC第1761行先前描述和刻画阮et al . 2011 7]。

万能干细胞培养和维护在丝裂霉素C灭活小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF) (EMD微孔的猫。不。PMEF-CF) hESC媒体含DMEM / F12,分离血清替代20%(表达载体,猫。10828028号)、1 x NEAA 1 x P / S, 0.1% β巯基乙醇(表达载体,猫。21985023),0.5 x L-Glu和6 ng / mL的碱性纤维母细胞生长因子(FGF2)(猫。233号- fb,研发系统、明尼阿波利斯、锰)。细胞分裂每周手动没有酶治疗。

获得npc, iPSC殖民地收获使用1毫克/毫升的胶原酶IV(表达载体,猫。不,174104019)。大约1小时后,当所有殖民地举起完全从培养皿,殖民地被转移到10厘米细菌培养皿(BD生物科学、贝德福德,MA)。形成拟胚体(EB)培养与搅拌悬浮摇臂(摇臂II 260350型,Boekel科学、Feasterville, PA) 4天的EB媒体,也包括hESC媒体- FGF2有或没有5 μM dorsomorphin(金龟子)(σ,圣路易斯,密苏里州,猫。不。P5499)和10 μM SB431542(某人)(Tocris生物科学、Ellisville、钼,猫。1614号)。

接下来,EBs培养了额外的2 - 3天风潮在神经感应媒体(NIM)组成的DMEM / F12(表达载体,猫。12500号,粉末形式),1 x NEAA, 0.5 x L-Glu和新鲜无菌过滤N2,包含1.55 g / L葡萄糖(σ,猫。不。G7021), 2 g / L碳酸氢钠(σ,猫。不。S5761), 100 μ腐胺(σ,猫。不。P5780), 30 nM亚硒酸钠(σ,猫。不。S9133), 20 nM孕酮(σ,猫。不。P8783), 0.1毫克/毫升转铁蛋白(σ,猫。不。T0665), 0.025毫克/毫升胰岛素(σ,猫。不。 I6634) and FGF2 (20 ng/mL). Cell culture plates were coated with Geltrex (Invitrogen, Cat. No. 12760021), media changed every day. Neural rosettes were formed in 2–5 days in adherent culture.

获得纯粹的npc,圆花饰手工孤立使用15号手术刀切割与距离广场边缘的殖民地(图 3(F))。切割片的花结被取消使用吸管,山肩到Geltrex-coated文化神经祖细胞的菜肴和维护媒体(人大媒体)包含neurobasal媒体(表达载体,猫。21103049)1 x NEAA 1 x L-Glu 1 x P / S, 1 x B27补充(表达载体,猫。17504044),FGF2 (20 ng / mL)。手动隔离圆花饰如上所述重复一次获得更纯npc人口。大约5 - 10块的花结被分离成单个细胞使用Accutase (MP生物医学,梭伦,哦,猫。不,0910004)。细胞Accutase治疗,疗程2 - 5分钟,直到变成了圆形,然后收集细胞,离心,resuspended人大媒体,镀上一个96 -涂上Geltrex和培养在37°C和5%的公司₂。当支流,NPC被分裂的比率1:2个井与48-well等更大的表面积,24-well,在媒体人大12-well等等。

磁珠分选,npc Accutase处理,收集,通过30 μ尼龙网(pre-separation过滤器,30 μm, Miltenyi研究赤褐色,CA,猫。不,130-041-407)。总细胞数大约是10⁷。细胞悬液在300×g离心10分钟。上层清液吸气完全和细胞颗粒resuspended在60 μL的缓冲区(1 x PBS, 2毫米EDTA (Ambion公司、奥斯汀、TX,猫。不。AM9260G)和0.5%从牛血清白蛋白(BSA)(σ,猫。不。A3294)。细胞混合好,冰箱里孵化10分钟(2−8°C)。然后,20 μL (anti-PSA-NCAM微(Miltenyi生物技术,赤褐色,CA,猫。没有。130-092-966)被添加到混合,混合与移液,和孵化15分钟在冰箱里(2−8°C)。细胞被洗通过添加2毫升的缓冲和离心机在300 g×10分钟。上层清液吸气完全和细胞颗粒resuspended 10⁸细胞在500年 μL的缓冲区。一个女士列(Miltenyi研究,猫。没有。130-042-201)放置在磁场miniMACS分离器(Miltenyi研究,猫。130-042-102),与500年冲洗 μL的缓冲区的三倍。细胞悬液应用到列。列是用500年 μL缓冲区的三倍。新缓冲区添加列水库是空的。列被从分离器和放置在一个15毫升BD猎鹰锥形管(BD生物科学,352097)。一毫升的缓冲区添加到列和磁性标记细胞被刷新了坚定地推动柱塞到列。筛选了分数直接浓缩在第二列和磁选过程被使用新的列女士重复一次。一毫升的人大媒体添加到列排除磁性标记细胞。然后另一个1毫升的人大媒体添加和细胞悬液被转移到一个35毫米Geltrex-coated培养皿。

多巴胺能的分化是由培养npc Geltrex-coated文化菜或玻璃盖玻片(费舍尔科学、匹兹堡、PA,猫。12 - 545 - 80 - 12 -圆- 1)涂上了poly-L-ornithine (20 μg / mL)(σ,猫。不。P4957) 37°C 4小时和层粘连蛋白(σ猫。不。L2020) (20 μ一夜之间在4°C g / mL)。

多巴胺能分化在媒体的定义是由培养~ 0.5×10⁶npc (35 mm培养皿)DA1媒体十天与1 x NEAA Neurobasal媒体补充,1 x L-Glu 1 x P / S, 1 x B27, FGF8b (100 ng / mL)(研发系统,猫。423号- f8)和测试与2 μM Purmorphamine (Pur) (EMD化工、猫。540220号)、Gibbstown NJ), 0.4毫米凹陷(法明岱尔恩佐生命科学,NY,猫。不。alx - 270 - 426 - m001)或200 ng / mL声波刺猬,C24II(嘘)(研发系统,猫。1845 - sh)。在这十天里,当细胞融合性的增长,他们通过Accutase如上所述和山肩到Geltrex-coated盘子~ 80%的细胞密度。低密度导致细胞死亡。

最终成熟为多巴胺能神经元在DA2媒体包含neurobasal媒体进行补充与1 x NEAA 1 x谷酰胺,1 x B27补充,1 x Penicillin-Streptomycin 20 ng / mL BDNF(研发系统,猫。248号- bd), 20 ng / mL GDNF(研发系统,猫。212 - gd), 1毫米dibutyryl营(σ,猫。不。D0627) 20 - 30天。细胞并没有继续在DA2通过媒体形成的过程。分析了细胞在30天的成熟过程。

EBs收集6天的EB镀金前形成了玫瑰的形成。总RNA提取使用RNeasy微工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和500 ng RNA用于反转录成cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad大力神,CA)。总反应体积是20 μL;与80年的cDNA样本稀释 μL超纯水,5 μL的稀释cDNA样本作为qPCR扩增的模板。qPCR使用ABI棱镜7000执行序列检测系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。所有的反应都是运行在20 μL反应体积使用SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)和30 pmol每个引物。qPCR参数如下:2分钟50°C;在95°C 10分钟;40周期为15秒95°C, 1分钟和60°C。数据收集60°C。所有数据被规范化 β 肌动蛋白EBs的表达式和绘制褶皱变化样本没有金龟子/某人。在这项研究中使用的基因引物:Sox1 (5′-GAGATTCATCTCAGGATTGAGATTCTA-3′5′-GGCCTACTGTAATCTTTTCTCCAC-3′);巢蛋白(5′-TGCGGGCTACTGAAAAGTTC-3′, 5′-AGGCTGAGGGACATCTTGAG-3′);Brachyury (5′-AGGTACCCAACCCTGAGGA-3′, 5′-GCAGGTGAGTTGTCAGAATAGGT-3′);GATA4 (5′-GTCATCTCACTACGGGCACA-3′, 5′-CTTCAGGGCCGAGAGGAC-3′);Oct4 (5′-TGGGCTCGAGAAGGATGTG-3′, 5′-GCATAGTCGCTGCTTGATCG-3′) β肌动蛋白(5′-CTGAACCCCAAGGCCAAC-3′, 5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′)。

EBs和npc和4%多聚甲醛固定(PFA)(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA)在室温下10分钟。神经元PFA仔细固定通过添加相同体积的8%到井相同体积的介质和孵化在室温下10分钟。固定细胞permeabilized Triton x - 100(σ,0.3%的猫。不。X100) 5分钟和被封锁在阻止缓冲区(5%正常山羊血清,向量实验室,伯林盖姆,CA)在1 x磷酸缓冲盐(PBS)(σ,猫。不。P5493),其次是孵化与主抗体在4°C在5%的正常山羊血清和PBS。以下主要抗体被用于:巢蛋白(EMD微孔,Billerica,妈,猫。不。MAB5326), 1: 200; Sox1 (EMD Millipore, Cat. No. AB15766), 1 : 100; Tyrosine Hydroxylase (TH) (PelFreez Biologicals, Rogers, AR, Cat. No. P40101-0), 1 : 300; Pax6 (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, Cat. No. Pax6), 1 : 20; neuronal class III β微管蛋白(TUJ1) (Covance,普林斯顿,纽约,猫。不。mms - 435 - p), 1: 500年,和二级抗体Alexa萤石488山羊Anti-Mouse, Alexa萤石555山羊Anti-Mouse, Alexa萤石488山羊Anti-Rabbit, Alexa萤石555山羊Anti-Rabbit(表达载体)1:300。盖玻片是安装与DAPI Vectashield安装介质(向量实验室)。荧光图像捕获在一个Eclipse Ti倒置荧光显微镜(尼康仪器公司、麦尔维尔、纽约)。相衬图片拍摄与蔡司Axiovert 25倒置显微镜(卡尔蔡司AG)、从、德国)。

Stereological分析使用一个奥林巴斯BH2显微镜(奥林巴斯,中心山谷,PA)机动x - y阶段与计算机辅助Stereological系统(奥林巴斯美国Inc .)。这包括一个彩色摄像机(CCD-Iris、索尼),与高分辨率的SVGA监控电脑,一个指针测微计(VRZ 401, Heidenhain)和立体声调查员(MBF生物科学,威利斯顿,VT)。应用盖玻片被划定在4 x放大。从一个随机的开始位置,计算帧叠加在图像,和细胞系统采样使用40 x物镜(奥林巴斯),与DAPI染色细胞核作为抽样单位。至少200个细胞取样根据规则光学解剖器( 24),而每个stereological估计的误差系数在0.07和0.1之间( 25]。

多巴胺能分化后,细胞分离与TrypLE表达(表达载体,猫。没有。12605 - 028年)在37°C 5分钟,用PBS,离心机,通过70年在PBS resuspended,紧张 μm细胞过滤器(BD生物科学,猫没有。352350),离心机,resuspended,固定在4% PFA在PBS在室温下10分钟。然后他们离心机,resuspended, permeabilized 0.3%皂苷(σ,猫。47036号),孵化TUJ1 (Covance, 1: 100)和TH(图像的基本单位Freez生物制剂,1:100)在冰上30分钟和洗洗涤缓冲(PBS和皂苷0.03%)一次。然后细胞孵化APC-conjugated抗小鼠免疫球蛋白抗体(BD生物科学,猫。550826号)和PE-conjugated抗兔免疫球蛋白抗体(BD生物科学,猫。558416号)为30分钟,冰洗洗涤缓冲,resuspended PBS。所有排序程序进行了利用BD数字优势(BD生物科学),80年 μm喷嘴。数据分析FlowJo流式细胞仪软件(版本7.6.4,树星公司、亚什兰或)。我们比较清白的npc细胞悬液和清白的分化细胞负控制免疫荧光的检测来确定阈值。

统计分析了使用GraphPad棱镜(版本4,GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。数据分析了单向方差分析(方差分析)。Newman-Keuls事后分析工作在方差分析差异观察测试( P < 0 。 05年 )。数据被当作手段+平均数标准误差(SEM)。所有结果都来源于至少三个独立的实验中,除了1679细胞株在图的结果 1和流式细胞仪数据图 6来自两个独立的实验。

大多数出版神经元分化方法描述选择的人类胚胎干细胞(hESC)行如H9或16和围绕这些细胞系这些协议进行了优化。尽管一般跨多个hESC再现性,在特定的人类一致的再现性的细胞则没有被证实,疾病模型和药物筛选构成挑战。( 26- - - - - - 29日]。最近的一个出版物指向特定的标记,如mir - 371 - 3和FoxA2能够预测先验万能干细胞的分化潜能或ESCs到神经元血统,可与下游相关应用程序( 30.]。

我们的目标是开发一个可复制的跨各种不同的iPSC可靠协议。我们测试了5级协议神经元多巴胺能分化,最初是由李和瑞士思德利公司介绍在小鼠胚胎干细胞( 18),随后进一步发展( 28, 29日]。这个协议包括EB形成了四天,神经形成莲座丛,隔离神经圆花饰,扩张和PSA-NCAM neuroprogenitors浓缩使用磁珠分选。最后一个成熟阶段利用FGF8和声波刺猬(嘘)第十天之后,BDNF, GDNF, B27, dcAMP Neurobasal媒体20 - 50天(图 1(一))。我们原因这5级协议生成神经前体产生EBs有几个优点,可以很容易地扩展没有分化的潜在损失( 31日]。因此,本协议适用于研究疾病机制在neuroprogenitor阶段和维护可能派生其他中枢神经系统的细胞类型( 28]。

在控制iPSC线,EBs培养4天在EB媒体显示神经形成莲座状的类似结果被Swistowski et al ., 2009 28(数据未显示)。当我们试图npc来自额外的细胞则来自与PD控制和患者影响我们观察到神经很少莲座状形成。此外,这些花结并不像npc的扩展。

小分子已报告改善指导ESC /细胞则为神经血统[ 32, 33]。我们测试了小分子的结合:金龟子和某人,描述了这两种SMAD抑制。协同模式的作用抑制剂SMAD信号,‘诺金’和SB431542,据报道快速诱导神经转换为( 15, 34]。小杯,骨形成蛋白(BMP)拮抗剂,和小分子金龟子也有类似的活动,有选择性地抑制BMP I型受体:ALK2 ALK3, ALK6和块SMAD1/5/8磷酸化( 35]。某人已被证明是一个激活素受体激酶受体的选择性抑制剂ALK4, ALK5, ALK7 [ 36]。

成功的一代的npc,它从原始至关重要,未分化的iPSC文化。IPSC殖民地应该对细胞质细胞核密集的低比率和离散边界和没有沿着外围分化和/或中心的殖民地。在这个协议中,我们发现2毫米直径大小的殖民地产生神经形成莲座状(图的最佳效果 2(一个))。

IPSC殖民地保持酶的胶原酶治疗。分离后,一半的殖民地在培养皿中被暴露于5 μM金龟子/ 10 μM某人另一半是放任自流。4天的殖民地被培养EB媒体有或没有金龟子/某人。EBs培养仅在EB媒体显示松散,不紧凑,和不规则形状(图 2 (b)),而大多数的EBs对待金龟子/某人证明紧凑、固体和圆形状的总量和平均大小为350 μ米直径(图 2 (b))。4天,媒体改变了NIM媒体含N2是新鲜的不同的单个组件。没有一个商用N2补充显示一致的结果(数据没有显示)。EBs被镀上Geltrex-coated文化菜6天。6 - 10在天,神经花结被他们发现径向排列的细胞的形态学特征(数字 3(一)- 3(D))。在NIM孵化的早期阶段(大约8 - 10),神经圆花饰显示黑暗中心的“花形”结构与一体的边界线(数字 3(一)和 3(B))。在后者的孵化与尼姆,“花形”形态更明显,边缘清晰,如图 3(C)和 3(D),切割圆花饰(数据 3(E)和 3(F))山肩并手动隔离一次生成NPC的数量更高的纯度。

我们评估神经分化的EBs 10天(图 1 (b)通过免疫细胞化学)。神经标记Pax6和Sox1 Oct4以及多能细胞的标志。Pax6和Sox1显示积极的附加EB染色(数字 3(G)和 3(H)),然而,Oct4没有免疫反应性(数据没有显示)。在同一时间点,神经花结形成的百分比有或没有的金龟子/某人被手动计数量化包含神经的殖民地圆花饰除以总殖民地附加到培养皿(数字 1 (b)和 3(我))。没有金龟子/某人,我们观察到低形成莲座丛在0%和31.9%之间,我们无法获得可扩展的npc。金龟子/某人的结合,另一方面,增加了神经玫瑰形成大幅48%到97.5%的EBs在控制和PD-specific细胞系。总的来说,我们没有注意到不同的玫瑰PD线之间形成的效率和控制线路。

在第六天,我们进行了基因表达分析在EBs的多个标记。在所有六行我们研究neuroectodermal标记Sox1巢蛋白,中胚层Brachyury标志,内胚层的标记GATA4和多能Oct4标志。令人惊讶的是,有一个显著的差异> 150倍的基因表达式neuroectodermal标记Sox1和金龟子巢蛋白- / SB-treated EBs EBs相比没有小分子(图 4)。这表明这两个小分子非常有效地调节SMAD信号通路导致neuroectodermal标记这个巨大的增加。这种增长是一致的在所有六iPSC线测试,在神经元分化和差异之间没有观察到病人和控制线路。Endo和中胚层标记GATA4 Brachyury以及多能性标记10月4都低于未经处理的,标准化的人大。

神经圆花饰手工切割和山肩是件生产人口的npc更高的纯度。花结是手动再次分离,收集,镀与Accutase保持酶的治疗,在媒体人大和扩展。手动使和NPC的扩张仍然产生了大约10%的未分化细胞Oct4-positive人大文化,这对进一步扩张显示iPSC形态(数据未显示)。因此,我们用磁珠分选与神经细胞粘附分子抗体polysialic酸神经细胞粘附分子(PSA-NCAM或CD56)数据 5(一)和 5(B))。我们观察到磁珠分选后细胞损失约20%。我们为npc排序后通过免疫细胞化学标记巢蛋白和Sox1定义。我们发现> 90%巢蛋白和Sox1免疫反应性的npc在iPSC细胞系通过这个协议(数据 5(C)和 5(D))。npc的比例使容易扩展1:与Accutase 2比1:3。文化生长良好时,媒体准备新鲜每2到3天,B27添加新人大媒体,在媒体的变化。我们扩大人大文化> 15章节后推导和没有观察形态学变化或表达巢蛋白和Sox1。

与这种新方法使用小分子神经感应,我们大大提高了再现性和效率的神经玫瑰阶段/人大的一代。这是宝贵的在使用patient-derived万能干细胞疾病建模,这可能的内在劣势文化携带潜在疾病相关不足。自从npc可以很容易地扩大,这可能会成为一个合适的细胞类型的高通量筛选大量的原始材料是必要的。

我们调查了替换的声波刺猬(嘘)小分子purmorphamine (Pur)或平和受体激动剂(凹陷)多巴胺能成熟。这些化学物质会便宜很多,有最小lot-to-lot可变性,重组蛋白相比有较长的保质期。

对于最后的多巴胺能成熟,我们使用了两步方法。第十天,我们培养的npc FGF8和测试两个小分子凹陷和咕噜咕噜叫,以代替嘘控制和患者的细胞系。在DA1媒体的第一天,npc的电镀密度(图应该大约60%到70% 6(A))。在这10天的协议,细胞分裂为100% confluency使用Accutase和山肩大约80%的细胞密度。当细胞被镀在细胞密度较低(< 50%),我们观察到显著的细胞死亡和细胞连接的低利率。十天之后,我们转向Neurobasal媒体补充BDNF, GDNF, dcAMP,每个第二天的B27,但B27日常预防细胞死亡。细胞分裂,直到他们开始生长过程(图 6(B))。多巴胺能成熟30天之后,细胞被固定,应用TUJ1和TH和复染色DAPI(数字 6(C) - 6(F))。

衡量神经分化的效率,我们评估TH和TUJ1表达神经元的比例相对于总细胞使用两种方法:体视学系统随机抽样和流式细胞术。流式细胞仪是用来减少偏见。这些文化的准确计数的挑战是密集的“补丁”的神经元和TH免疫反应性的神经元的多数本地化在这些“补丁”( 37]。

在流式细胞仪的散点图,(数字 6(G) - 6(J)),未分化的npc没有显示免疫反应性TUJ1和TH(图 6(H)),有一个类似的模式在无污点的npc的散点图(图 6(G))。分化神经元免疫反应性的TUJ1和TH(图 6(我)的总数相比,无污点的分化神经元(图 6(J))。

这两种方法,体视学和流式细胞术,没有显示出显著差异在三个不同的组件嘘,凹陷,或用于多巴胺能分化Pur TUJ1 /总数的比例而言,TH / TUJ1和TH /总细胞(图 6(K))。流式细胞仪数据略低于stereological方法。我们怀疑,我们失去了神经元在处理过程中,如通过细胞分裂使过滤器过滤块从细胞悬液流式细胞术。

一些研究表明,延长培养时间60天,更多的神经元TH-positive以及转换成为电生理成熟( 37, 38]。其他研究显示TH-positive神经元的比例更高,然而,不同的量化方法可能会引入偏见神经元的百分比收益率更高。