正如上面提到的,调整的重大突破 β地中海贫血来自Sadelain集团在纽约,在那里他们设法纠正地中海贫血小鼠模型中的媒介物( 16),后来在拯救杀伤力重型地中海贫血模型( 32),使用TNS9 β球蛋白向量。同时,Pawliuk et al。 17)表明,lentiviral-mediated干细胞转移antisickling变异的人类 β球蛋白链导致血液校正,减少终末器官损伤小鼠镰状细胞病(SCD)。同样,Imren et al。 33)使用 β球蛋白矢量显示 β球蛋白表达达到大约32%的总血红蛋白,而在全球范围内的情况下向量,法拉利集团 β球蛋白表达从14到37% 18]。

修正 β地中海贫血也通过使用 γ球蛋白向量,如前所述,与人组是第一个构建和测试向量。在他们的第一次尝试,使用noninsulated向量,他们设法纠正地中海贫血小鼠模型中的媒介物。然而,表型修正不同由于染色体定位效果和向量拷贝数( 20.]。为了解决这些问题,Arumugam et al。 21)合并cHS4 D432绝缘子 β4 γ向量和成功地增加转基因的表达,在病毒滴度为代价的。同样,Hanawa et al。 34证明动物接受移植 β-thalassemic干细胞转导新LV,包含3.2 kb的电感电容电阻测量序列,表达高水平的胎儿血红蛋白,从17%到33%不等,平均向量拷贝数为1.3。上述策略导致平均血红蛋白浓度的增加(26 g / L)和增强其他血液参数的改进 34]。

最后,赵等人从人士团体更进一步,把耐药性基因,methylguanine甲基转移酶(管理) γ球蛋白向量( 35),证明改进的小鼠 β地中海贫血和浓缩的纠正HSC隔间,雇佣 在体外和 在活的有机体内后,选择药物治疗。然而,尽管HSC的成功的药物引起的浓缩池在上面的研究中,发现与其他调查人员倾向于表明管理选择方法可能并不总是产生期望的结果,通常是伴随着与毒品有关的毒性。更具体地说,Larochelle et al。 36]未能诱导选择长期重新繁衍的肝星状细胞在恒河猴和显示,烷化剂bis-chloroethyl亚硝基脲(BCNU)可能导致重大nonhematopoietic毒性,如肺充血、水肿和necrohemorrhagic结肠炎。此外,最近的工作由佐丹奴et al。 37)使用小鼠连续移植模型表明,管理方法也会导致插入突变和克隆选择的主导地位。综上所述,上述数据表明,尽管管理选择方法可以是一个有效的策略修正HSC的浓缩室,其毒品毒性和插入突变可能代表了相当大的风险因素在人类临床试验中使用。

这两个 β球蛋白和 γ球蛋白向量用于纠正人类红细胞生成的文化和免疫缺陷小鼠的红细胞。在详细研究中,Puthenveetil et al。 38慢病毒载体携带人类)测试 β球蛋白表达盒,两侧的染色质绝缘子transfusion-dependent人类重型地中海贫血,并表明,正常的人类 β球蛋白是表达红细胞细胞产生 在体外;红细胞生成的恢复和细胞凋亡明显减少了。这些gene-corrected人类 β地中海贫血祖细胞被移植到免疫缺陷小鼠,在那里,他们能够建立正常红细胞生成。此外,罗塞利et al。 39),使用全球向量,报道成功的校正实现重型地中海贫血在人类细胞的转导频率高、恢复血红蛋白合成,从细胞凋亡救援,纠正无效的红细胞生成。

同样,使用不同的人员和他的同事们 γ球蛋白向量和一个 在体外人类红细胞生成的模型,显示最近lentiviral-mediated γ球蛋白基因和基因激活内源性的 γ球蛋白基因有可能为患者提供治疗住宅水平 β球蛋白缺乏症( 40, 41]。最后,群Anagnou,解决问题的效价低,变量表达式,和基因沉默,影响人的基因治疗载体,成功地使用了HPFH-2增强剂在一系列oncoretroviral向量( 42]。基于这些数据,同一组( 43)生成的一种新型绝缘罪LV指定为GGHI,包含一个 γ与117−HPFH球蛋白基因点突变和HPFH-2增强剂。这个向量能够产生高效的住宅导致表型校正CD34在红色的文化中⁺肝星状细胞分离外周血(PB)或骨髓(BM) [ 43]。在这个特定的向量设计、整合全长1.2 kb cHS4 U3地区和罪配置没有明显影响病毒效价,因为它 2 × 10 8 你/毫升。也一直在努力的能力 γ球蛋白向量具有不同包膜糖蛋白的准型转换人类肝星状细胞( 44),导致了水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)更有效转导细胞比其他gammaretroviral糖蛋白,华支持clinical-grade向量(因此它的使用 44]。

第一个人类临床试验使用 β球蛋白LV开始在法国6月7日,2007年,Leboulch和他的同事们选择两个 β地中海贫血病人移植LV-transduced肝星状细胞( 45, 46]。第一个,28岁的病人经历了一段时间的延长发育不全可能由于技术处理的细胞,基因疗法向量没有关系,尽管没有任何副作用的,需要政府untransduced细胞作为一个备份,为了避免被感染。因此,lentiviral-modified细胞在PB并未达到显著水平,也没有治疗血红蛋白,导致没有结论对于特定的病人。

第二个病人的研究是一个18岁的男性患有HbE / β°地中海贫血,血红蛋白生产形式的障碍是严重受损。他transfusion-dependent从三岁起,需要160毫升的红细胞/公斤/年。他收到了 4 × 10 6 CD34⁺细胞/公斤( 46]。转基因细胞的水平从最初几个月的2%增加到11%,33个月。具有重要的意义上面的崛起也观察到正常的水平 β球蛋白的蛋白质,10% - -20%的肝星状细胞是转基因,从而提高红细胞的生产和质量。值得注意的是,治疗一年后,患者不再需要输血。2008年他最后一次输血是6月6日,四年后移植,尽管有点乏力和接受重复放血铁过载的减少,病人不需要输血,这意味着这个单例可以被视为一种临床成功。

然而,尽管第二个病人的成功的结果,Cavazzana-Calvo等人报道,一个造血克隆,怀著一个向量插入HMGA2基因显示克隆优势( 46]。在20个月后移植,特定的转基因肝星状细胞的克隆占50%;然而,其贡献血红细胞的循环池仍然在3%左右。潜在的改变的临床意义 HMGA2表达式由向量集成所反映出的事实是这个基因可能作为潜在的致癌基因在不同类型的癌症。然而,尚不清楚的是,矢量插入这个基因实际上导致了相对较高的贡献这克隆造血作用,因为它可以想见,上述观察可能只是反映了移植的结果从一个小数量的转导肝星状细胞。

总之,上述病人原则上证明代表了基因疗法可以成为一个成功的治疗方法。这次成功的临床试验表明,可以产生大量的治疗性蛋白 在活的有机体内lineage-specific方式和验证体细胞基因转移使用慢病毒罪向量转换长期重新繁衍肝星状细胞。它还表明,体细胞基因转移 体外可以为患者提供输血独立性严重形式的地中海贫血。

原始人类和非人类灵长类动物的肝星状细胞的抗感染HIV-based向量吸引了大量的注意力在过去的十年。最近的工作由Naldini集团( 50)表明,慢病毒基因转移是有限的由蛋白酶体通过一个或多个细胞后补手续书的规定步骤向量的粒子。实验中涉及到蛋白酶体抑制剂MG132 LV转导证明人类CD34基因转移到增加了4倍⁺细胞( 50]。在这项研究中,瞬态和可逆抑制蛋白酶体功能并没有导致任何明显的HSC的缺陷。然而,作为蛋白酶体是主要的细胞蛋白水解机械、抑制其功能可能会导致细胞毒性,通过快速积累蛋白质在细胞,导致其生存的障碍。因此,蛋白酶体抑制剂的使用作为一种增加慢病毒HSC转导需要进一步调查,之前被认为是安全的在临床试验中使用。最后,在不同的研究Zhang et al。 51),细胞循环p21蛋白,发现在肝星状细胞的高水平,被确认为一个独特的分子屏障感染艾滋病毒,通过其与病毒整合酶的相互作用,从而抑制染色体整合( 51]。

除了细胞因素重要的慢病毒基因转移到人类的肝星状细胞,另一个重要特征,削弱基因转移的效率是低水平的 体外HSC骑车。正如前面提到的,人类比小鼠的肝星状细胞保持更长时间的静止,前者进入G₁每30 - 40周( 28相比),4 - 8周( 27在小鼠的情况下。这些发现,连同这一事实被转导肝星状细胞更容易进入细胞周期时,指向的必要性 在体外肝星状细胞的增殖和扩张注定要慢病毒基因转移。主要工作都集中在研究小说的文化条件,从而导致HSC扩张和增殖。这些特性angiopoietin-like蛋白质有前途的候选人,诱导所示 体外扩大人类免疫缺陷小鼠细胞增殖( 52, 53]。同时,转录因子如HOXB4 [ 54)和NUP98-HOX融合蛋白( 55)也被证明能诱导肝星状细胞扩张。此外,嘌呤衍生物称为茎regenin1 (SR1)也是促进 体外CD34的扩张⁺细胞,通过扮演一个芳基碳氢化合物(AHR)受体拮抗剂,主要在CD34增长了50倍⁺细胞和统计增加细胞免疫缺陷小鼠保留他们灌输的能力( 56]。SR1显示直接绑定气道高反应性和气道高反应性抑制信号,涉及造血调控。最近的工作由王et al。 57)表明,抑制增殖作用的蛋白激酶(MAPK)也可能导致 体外肝星状细胞的扩张。增加在HSC扩张可能归因于p38 inhibitor-mediated抑制HSC凋亡与衰老和upregulation HOXB4和趋化因子受体CXCR4。尽管上述研究使用小鼠血统-细胞,这一事实导致HOXB4 upregulation,已经证明是人类必不可少的HSC扩张,表明它很可能是有效的在人类肝星状细胞的情况下。

如上所述,增加转基因人类肝星状细胞后慢病毒的水平基因转移并不是一件容易的事。已有多种方法被采用来实现这一目标。赵et al。 35)合并有抗性的基因管理,抵抗几个强大的造血BCNU等毒素,在他们 γ球蛋白LV和管理显示显著改善疾病的小鼠模型中( 35]。globin-expressing hsc被选中 在活的有机体内通过细胞毒性药物管理局和达到高的水平,足以改善疾病。此外,该系统还允许一个 在体外选择的转导细胞,移植前,导致浓缩的 γ-globin-expressing细胞室。然而,尽管上述方法的成功应用在小鼠模型中,有临床应用的主要问题,主要是由于烷基化agents-related基因毒性和插入突变的潜力,正如前面所讨论的那样。最后,它是可行的在系统中细胞数量不限制一步,这对人类肝星状细胞通常并非如此。

增加人类HSC慢病毒转导的另一个有前途的战略是通过设计向量进行配体的信封,这与靶细胞受体相匹配。在最近的一次开创性工作由Verhoeyen et al。 58),结果表明:HSC基因转移时显著增加慢病毒粒子设计显示早期表面作用的细胞因子。上述策略背后的基本原理是这些修改lv选择性和最低限度刺激肝星状细胞CD34内⁺细胞群,导致增加传导,因此基因转移。最后,使用替代的包膜蛋白RD114 [ 59, 60)代表了另一个很好的候选人加强病毒转导和可能使用更多的细胞毒性VSVG蛋白质作为替代。

造血干细胞动员指被迫迁移步骤从大英博物馆到血液中。动员PB可以用作CD34的另一个来源⁺慢病毒转导细胞,基因转移,最终移植治疗 β地中海贫血,产生一个3到4倍浓缩 61年]。最近,这种策略吸引了许多研究小组的注意,用粒细胞集落刺激因子(g - csf)的主要诱导外周血干细胞(PBSC)动员,单独或与化疗( 61年, 62年),特别是在基因治疗领域的普及 β地中海贫血。特别是,李et al。 63年)评估管理的g - csf动员干细胞和祖细胞相比,thalassemic主要儿科患者和CD34的动力学⁺细胞和淋巴细胞亚群与健康PBSC的捐助者。结果表明,CD34⁺细胞在20 thalassemic患者和11个健康的捐赠者的10到16 g - csf动员的有效浓度 μ克/天/公斤的重量。无显著差异在日常的水平两组受试者之间的干细胞数量,证明CD34的严密监视之下⁺细胞水平铅、PBSCs由g - csf动员和收集的 β地中海贫血患者是可行的 63年]。最近,Yannaki et al。 64年)用g - csf动员了小鼠肝星状细胞,表明thalassemic老鼠有效动员低于控制同行由于增加脾肝星状细胞的捕获和祖细胞。减少动员效率在HBB恢复脾切除术时执行^th-3老鼠,这表明人类基因治疗,造血干细胞动员可能需要超过一个周期或替代协议,以产生足够的肝星状细胞的基因操纵和移植。

关于法国正在进行的临床试验,从监管机构授权后可能已经使用BM-derived或外周血g - csf动员CD34⁺细胞( 45]。

“诱导多能性”细胞生成通过重编程体细胞分化成多能胚胎干细胞(ESC) [ 65年]。这些“诱导多能性”细胞,这是相同的人类的ESCs,有可能引起人体的每一个细胞类型。这些细胞中表达的基因和表面蛋白是几乎相同的ESCs的表达,因此,最终可用于正确的突变细胞或组织通过同源重组。因此,体细胞的病人可能是孤立和iPS细胞重新编程,采用基因如Oct3/4 Sox2 Klf4和原癌基因或Nanog Lin28,经过遗传操作和分化所需的细胞谱系,它们可以回到病人的管理,维护,至少从理论上来说,相同的属性和特点 65年]。有不同的诱导多能性的技术,这些都是广泛的审查,帕特尔和杨 65年),详细介绍在最近一本杂志特刊( 66年]。简而言之,它们包括体细胞转移、细胞融合、重组细胞提取物,主要和直接重编程使用病毒载体,蛋白质、rna、小分子核糖核酸(microrna),和小分子。

“诱导多能性”细胞技术似乎很有希望在人类基因治疗 β地中海贫血,因为它提供了一种替代方法,便于患者使用策略来获得更多的肝星状细胞的基因操纵和移植。第一个报告基因修正人的上下文中,使用“诱导多能性”细胞,进行了SCD小鼠模型。汉娜et al。 67年]收割的皮肤细胞SCD鼠标和重组他们的ESCs,通过逆转录病毒提供Oct4、Sox2, Lif4,原癌基因的基因。后删除 原癌基因减少或消除假定的肿瘤发生在治疗小鼠,ESCs是培养生产BM干细胞前兆时,和更换后的叛逃与正常基因,通过同源重组,他们移植回SCD的老鼠。结果疾病改善这些老鼠,血液和肾脏功能恢复正常水平。后小鼠的研究中,你们et al。 68年)是第一个表明这个问题也是可行的人类,当他们设法从thalassemic患者皮肤成纤维细胞重新编程 β°地中海贫血到“诱导多能性”细胞,证明了后者,基因打靶后,可以分化成hemoglobin-producing肝星状细胞。

这样的基因打靶,然而,需要严格控制的,因为随机整合的转基因产品可能导致致肿瘤性,因此,一般需要一个策略中引入转基因“安全”地区“诱导多能性”细胞势在必行。一个好的方法来克服这个障碍最近来自Sadelain集团( 69年),成功地诱导 β球蛋白转基因表达“诱导多能性”细胞克隆,LV集成在整个基因组的“安全港”。“诱导多能性”细胞在这项研究源于皮肤成纤维细胞或BM间充质细胞来自患者 β地中海贫血主要。为了确定转基因安全港口集成在人类基因组中,他们利用生物信息学和功能分析。检索(即安全港网站。,safe integration sites) met the following five criteria: (i) distance of at least 50 kb from the 5′ end of any gene, (ii) distance of at least 300 kb from any cancer-related gene, (iii) distance of at least 300 kb from any miRNA coding gene, (iv) location outside a transcription unit, and (v) location outside ultraconserved regions (UCRs) of the human genome. Measurement of β球蛋白表达在这些祖细胞达到高水平,这表明上述策略,一旦提高,可以非常有效的 β地中海贫血。