SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 924782年 10.4061 / 2011/924782 924782年 研究文章 小鼠的肝脏分化特异诱导多能干细胞使疾病模型 在体外 Eggenschwiler 里特• 1 洛亚 Komal 1 Sgodda 马尔特• 1 安德烈 弗朗索瓦丝 1 Cantz 托拜厄斯 1、2 吴 Shinn-Chih 1 干细胞生物学 集群的重生 汉诺威医学院 30625年汉诺威 德国 mh-hannover.de 2 马克斯普朗克研究所分子生物医学 48149年明斯特 德国 mpg.de 2011年 29日 09年 2011年 2011年 17 03 2011年 12 07年 2011年 13 07年 2011年 2011年 版权©2011里特•Eggenschwiler et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

直接重编程体细胞成多能细胞OCT4 retrovirus-mediated表达式,SOX2, KLF4,原癌基因是一种很有前途的方法来获得特异诱导多能干细胞(万能)。在这项研究中,我们专注于三个鼠模型肝脏代谢紊乱:铜贮藏病害威尔逊氏病(毒奶老鼠),酪氨酸血症1型(fumarylacetoacetate-hydrolase缺乏症,华氏温标−−/老鼠)和alpha1-antitrypsin不足(这老鼠)。殖民地的成纤维细胞的转导细胞则出现2 - 3周后,从每个鼠标应变准备,维护个人iPSC线。rt - pcr和免疫荧光分析表明内生多能性标记物的表达。肝前体细胞可以来自这些针对疾病的万能干细胞应用 在体外差异化协议和转导后可以可视化的慢病毒albumin-GFP记者构造。这些细胞的功能特性允许重演疾病表型的各自内在的分子机制的进一步研究疾病。

 1。介绍

到目前为止,超过200 liver-based缺陷识别,可导致肝和肝外疾病,先天性肝脏代谢占15%到20%的儿童肝移植指征。因此,肝脏再生的分子途径的说明和广泛的临床细胞移植动物实验导致肝细胞移植的应用在许多遗传代谢性肝病患者,急性肝衰竭 1- - - - - - 4]。在这些最初的临床研究,肝细胞移植被认为是作为全科治疗仪选项,或者,在更严重的情况下桥梁移植( 5]。此外,结果表明,低温贮藏肝细胞从一个器官可以申请多个孩子 6]。

“诱导多能性”细胞的生成从成年体细胞retrovirus-mediated pluripotency-associated基因的表达在老鼠 7- - - - - - 10和人类的 11- - - - - - 13)提供了一个独特的工具来生成针对疾病的病理生理研究“诱导多能性”细胞(图 1)。作为一个概念验证,证明在最近的出版物,“诱导多能性”细胞从小鼠镰状细胞贫血模型以及Fanconi贫血病人可以生成,修复,用于校正移植的疾病( 14, 15]。然而,为了使用这些iPS衍生品研究的疾病,需要应用合适的差异化协议针对疾病的细胞表型。在过去,我们和其他人产生肝前体细胞从人类和小鼠胚胎干细胞系 16- - - - - - 19]。分化与现有的协议,一个原始肝表型与胎儿基因表达模式可以在大多数诱导胚胎干细胞( 16, 20.]。这些细胞移植,然而,迄今为止,导致只有在分散形成肝细胞或被称形成小肝细胞集群主要尿蛋白启动子-(中)驱动urokinase-type纤溶酶原激活物(uPA)和c大调−−/老鼠( 21- - - - - - 23]。然而,肝细胞适合药理测试已经被描述 24),在最近的出版物,肝细胞分化人类胚胎干细胞是精炼的 25实现移植肝细胞,在免疫缺陷小鼠的肝脏功能的道。

“诱导多能性”细胞作为模型来研究代谢肝病。诱导多能干细胞(万能)可以生成使用复古——或者表达规范化重组慢病毒结构因素Oct4、Klf4, Sox2有或没有原癌基因。这种技术可以让从患病的人多能干细胞的生成。征服这些iPS细胞肝分化协议的结果在一个方便的针对疾病的肝细胞来源。重要的是,这种技术可能会为深入研究相应的肝脏疾病。

在我们的研究中,我们针对生成针对疾病的“诱导多能性”细胞从老鼠携带遗传缺陷三个临床相关代谢肝病。作为铜的小鼠模型存储障碍威尔逊氏病,我们选择了所谓的有毒牛奶的老鼠,携带ATP7b基因的点突变( 26),密切代表患者的疾病表型( 27]。作为急性酪氨酸血症I型模型,我们研究了fumarylacetoacetate hydrolase-deficient(华氏温标−/−)的老鼠 28],也作为一种良好的肝再生模型研究肝细胞移植机制。最后,我们研究了转基因小鼠品系,表达人类的变异对碘氧基苯甲醚 α1-antitrypsin变体(这),它描述了肝损伤相关积累错误折叠的蛋白质( 29日]。

 2。材料和方法 2.1。老鼠,动物组织样品,和细胞来源

C3HeB FeJ-Atp7btx-J / J(通用名:毒奶老鼠)获得杰克逊实验室(美国我巴尔港)。华氏温标−−/阿恩特提供的小鼠进行沃格尔(德国汉诺威医学院),和组织样本(削减耳朵和尾巴tips)从成人这老鼠从罗伯特·巴尔斯(德国汉堡帽/萨尔州大学)。所有的动物都是维护和依照制度准则与免费的食物和水。小鼠胚胎干细胞携带一个Oct4 promoter-driven eGFP转基因源自OG2老鼠( 30.)以及胚胎干细胞来源于影响小鼠(Charles River)提供的马克斯·普朗克分子生物医学研究所(德国明斯特)。

 2.2。隔离和成年小鼠成纤维细胞的重编程

成纤维细胞分离胎儿的毒奶和华氏温标−−/老鼠(ED 13.5)和耳朵削减成人这老鼠,分别。细胞在DMEM低葡萄糖(PAA、奥地利)提供10%的边后卫(PAA)、青霉素、链霉素+ 1%谷酰胺(PAA)和100年 μ米 β巯基乙醇(Gibco,德国)。转导之前的一天,成纤维细胞被播种在6-well每口井的100000个细胞板(瑞士TPP)。第二天,毒奶和华氏温标−−/成纤维细胞转导与3 μL集中逆转录病毒重组向量hOCT4 hSOX2, hKLF4,和hC-MYC,而这款成纤维细胞转导与3 μL每个集中lentviral hOCT4、hSOX2 hKLF4。细胞培养24天的小鼠ES细胞中补充了白血病抑制因子(生活)和山肩对6厘米的食物影响小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)馈线细胞。6天后,殖民地和subcloned。

 2.3。生产慢病毒和Gamma-Retroviral向量

生产慢病毒载体,转染前的一天,HEK 293 t细胞被播种 3 × 10 6 每10厘米菜(TPP)细胞在DMEM完全(DMEM高葡萄糖,PAA)提供10%的边后卫(PAA)和1%青霉素和链霉素+谷酰胺(PAA)。那天转染、中交换了8毫升DMEM完全补充25 μM氯喹(Sigma-Aldrich,德国)。对慢病毒质粒编码呕吐/波尔(pCDNA3.GP。预备,10 μg), RSV-Rev (pRSV-Rev 5 μg), VSV-G (pMD2。G, 2 μg),包装质粒编码各自的转基因(SFFV-hOCT4、SFFV-hSOX2 SFFV-hKLF4, SFFV-hC-MYC, Alb-GFP, 10 μ400年g)涨跌互现 μL (ddH2O和100 μL (1.25 CaCl2。的plasmids-CaCl2混合添加一滴一滴地2 xhbs并观察直到沉淀在相差显微镜下可见,然后添加到HEK细胞。7小时后,介质与10毫升DMEM完全交换,36个小时后,收集上清液,经过0.45 μ在14000×g m过滤,离心8 h。病毒颗粒在PBS resuspended (PAA)在0.5%的收集上层清液的体积浓度(200倍)。Gamma-retroviral向量作为生产之前报道( 31日]。

 2.4。多能干细胞的文化

小鼠iPSC和OG2 (Oct4-GFP转基因)胚胎干细胞(ES)细胞在小鼠胚胎成纤维细胞培养在糊化菜(猎鹰BD)培养基我(DMEM,英杰公司)补充15% FCS(所选批次)和添加剂:0.2%的50 mM β巯基乙醇、1%笔/链锁状球菌/ L-Gln, 1%非必需的氨基酸(PAA)和10 ng / mL重组人类白血病抑制因子(生活,Chemicon)。

 2.5。免疫细胞化学

细胞被播种在影响馈线细胞细胞化学染色前三天在50每口井的细胞密度24-well菜(TPP)。细胞被固定为4% PFA在4°C 20分钟,洗两次TBS, permeabilized渐变20 0.1%和0.05%在TBS NP-40 30分钟在室温下(RT)。固定细胞被封锁5% BSA在RT TBS 30分钟,并与TBS洗了三次。主要抗体稀释TBS 1: 75年Nanog(圣克鲁斯,sc - 30328)和1:100年Oct4(圣克鲁斯,sc - 5279),孵化1 h RT和清洗三次。二次抗体稀释1:400年TBS(表达载体:Nanog Alexa萤石647 a21447和Oct4 Alexa萤石488 A11001)和孵化45分钟在rt,细胞被洗两次,沾染了0.2 μg / mL DAPI(表达载体D3571)为1分钟TBS rt,细胞被洗两次,分析使用奥林巴斯IX71和细胞P软件。

 2.6。碱性磷酸酶(美联社)染色

使用Chemicon AP染色进行碱性磷酸酶检测工具(美国微孔)根据制造商的协议。

 2.7。互补脱氧核糖核酸合成和Taqman-Based qRT PCR

互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用rt - pcr SuperScriptTM三世第一链合成系统工具包(美国英杰公司)与随机五个一。Taqman-based qRT PCR检测进行StepOne +周期计(应用生物系统公司)使用标准的设置。Taqman探针被命令从小鼠应用生物系统公司 β肌动蛋白(Mm00607939_s1) Oct4 (Mm00658129_gH) Sox2 (Mm00488369_s1), Nanog (Mm02019550_s1)、白蛋白(Mm00802090_m1),法新社(Mm00431715_m1), Ck18 (Mm01601706_g1) Abcc2 (Mm00496899_m1),竞技场队伍(Mm00443267_m1), Hnf4a (Mm00433964_m1)和人类SERPINA1 (Hs01097800_m1) Oct4 (Hs_03005111_g1) Sox2 (Hs_01053749_s1) KLF4 (Hs_00358836_m1)和原癌基因(Hs_01570247_m1)。分析外生逆转录病毒表达小鼠重新编程是使用以下引物/探针组合:执行pMXs-Oct4: TGGTACGGGAAATCACAAGTTTG,牧师:GTCATAGTTC CTGT TGGTGA AGTTCA,探针:6 fam-cttcaccatgcccctca-mgb;pMXs-Sox2: GTGTGGTGGTACGGGAAATCAC牧师:TTCAGCTCCGT CTCC ATCATG,探针:6 fam-tgtacaaaaaagcaggcttgt-mgb;pMXs-Klf4: GTGTGGTGGTACGGGAAATCA牧师:CGCGAACGTGG AGAA GGA,探针:6 fam-cttcaccatggctgtcag-mgb;pMXs-cMyc: TGGTACGGGAAATCACAAGTTTG牧师:GTCATAGTTCCTGTTGGTGAAGTTCA,探针:6 fam-cttcaccatgcccctca-mgb。

 2.8。畸胎瘤化验

畸胎瘤的形成分析, 1 × 10 6 细胞将皮下移植到NOD / SCID小鼠和增长了2 - 3个月。老鼠被牺牲,畸胎瘤是固定在10%福尔马林和嵌入到石蜡。部分被苏木精和伊红染色和评估三个胚芽层的形成。

 2.9。肝分化协议

万能干细胞分化了悬滴法的修改版本,此前公布的卡尼亚等 。( 17]。简而言之,则是使胰蛋白酶化和电镀前gelatin-coated 6厘米菜(TPP) 45分钟从细胞分离。“诱导多能性”细胞包含上层清液离心机在250 g×4分钟和resuspended小鼠ES细胞培养基不生活30000细胞/毫升。从这个细胞悬液, 50 × 20. μL挂滴被放在里面的盖子10厘米,生长在37°C公司5%2孵化器对胚状体的身体(EB)的形成。在第五天,EBs收集和保存在IMDM 20%的边后卫,1%笔/链锁状球菌/ L-Gl n, 1%不重要的氨基酸,0.2% 50 mM β巯基乙醇,0.1% 450毫米 α-Monothioglycerol (PAA) gelatin-coated 6-wells (25 EB的每口井)。9天后,细胞使胰蛋白酶化和转移鼠尾胶原蛋白类型I -(罗氏诊断)涂布6-wells和保存在IMDM隔夜附件。第二天,细胞被洗一次PBS和继续HCM SingleQuots (Lonza)为进一步肝分化为14到20天。在与慢病毒转导Alb-GFP记者构造, 1 × 10 e 6 慢病毒颗粒(MOI ~ 3 - 5)被添加到2毫升HCM 6-well的在每一天5 + 9 + 3和孵化前48小时中交换。这个协议利率传导功效接近100%的小鼠肝癌细胞(Hepa 1 - 6)表达式nonhepatic细胞可以忽略不计,如成纤维细胞。肝分化效率估计年底GFP-positive流式细胞仪分析细胞分化在BD流式细胞仪石中剑(BD生物科学)。

 2.10。白蛋白ELISA

细胞上清液后三天从5 + 9 + 14天肝细胞分化。浮在表面的Hepa 1 - 6细胞作为积极的控制和稀释1:1与新媒体。ELISA根据生产执行协议(鼠标白蛋白酶联免疫试剂盒;Bethyl实验室)使用100 μL浮在表面的每一个反应。主要的抗体稀释1:1000、二级抗体1:10000和三甲ELISA基质添加(热科学的皮尔斯,美国)。每1000细胞和分泌白蛋白计算归一化。

 2.11。尿素生产

分析了尿素生产用二乙酰单肟法( 32]。上层清液后三天从5 + 9 + 14天肝细胞分化。颜色反应,100年 μ与1400年L上层清液混合 μL试剂(蒸馏水、混酸试剂和杂色试剂比1:1:1)和煮15分钟在98°C。吸光度检测使用540纳米过滤器在单点测量。结果规范化10000细胞和24 h。

 2.12。细胞色素P450活性

激活细胞色素P450亚型1 a1决心使用EROD试验[ 33]。新媒体包含10 μM双香豆素和8 μM 7-ethoxyresorufin添加了两个小时5 + 9 + 14天肝细胞分化。75年 μL细胞上清液混合了25 μL 0.1 Na-Ac解决方案和孵化与10个单位 β葡萄糖醛酸酶为2 h / arylsulfatase 39°C。通过添加200反应停止 μ分析了L EtOH, resorfurin光度计的使用535 nm励磁和595海里排放过滤器。结果规范化10000细胞和2 h。

 2.13。核型分析

细胞治疗10 μ米/毫升诺考达唑8个小时逮捕细胞中期。这些细胞被收集在胰蛋白酶化和细胞溶解在0.56%氯化钾固定在甲醇:乙酸(3:1)。细胞核被掉在玻片从1.5米的高度,进一步与DAPI染色染色体计数分析。

 3所示。结果与讨论 3.1。iPSC威尔逊氏病的小鼠模型

作为第一肝肝疾病的小鼠模型,从我们生成的万能,我们选择了杰克逊毒奶老鼠。这些老鼠反映人类疾病威尔逊氏病导致纤维化改变,炎性浸润和铜积累在小鼠的肝脏 27]。毒奶mice-derived万能干细胞生成使用胎儿成纤维细胞附着单层条件下培养。细胞转导对鼠标Oct4 gamma-retroviruses编码,Sox2, Klf4,原癌基因的互补( 7, 31日在正常的支线细胞培养条件下)和维护。六天之后,转导细胞分裂和播种在辐照加料器应用标准的小鼠胚胎干细胞培养条件。大约两周后殖民地与不同形态从最初转导细胞(图 2(a))。这些殖民地,形态最正常的胚胎干细胞相似,是机械采摘和subcloned,进一步培养推导之前个人iPSC线(图 2(b))。为进一步描述,则被播种在封面免疫组织化学染色(数据 2(c) - 2(f))。分析最重要的两个pluripotency-associated标记Oct4(图 2(c)和Nanog(图) 2(d))清楚地描绘了这些标记的colocalisation DAPI染色细胞核(图 2(e))的毒奶iPSC殖民地。此外,毒奶的多能状态iPSC殖民地证实了碱性磷酸酶(美联社)活动如图 2(g),这是一个功能重组多能干细胞的标志。我们的研究结果进一步支持定量分析的基因表达谱qRT PCR(图 2(我))。派生的毒奶iPSC行显示了一个高表达水平的多功能标记Oct4、Nanog, Sox2称为无声的从小鼠胚胎成纤维细胞的转录活动。控制胚胎干细胞(ESCs)相比,来自Oct4-GFP转基因小鼠(OG2),这些标记的基因表达是略有减少,但不同的标记之间的比例反映了小鼠胚胎干细胞的表达模式。毒奶时能形成畸胎瘤的细胞则将皮下移植到NOD / SCID小鼠(数字 2(j) - 2(l)),此外,重组转基因被证明是完全重新编程细胞则沉默(补充图1 (A)这是网上doi: 10.4061 / 2011/924782)。核型分析显示一个二倍体染色体组40(图 2(h))。总结,我们的毒奶iPSC线表现出最重要的多能干细胞的特点提出行之有效的多能性网络和多能这些重组细胞的状态。

一代&表征的有毒牛奶“诱导多能性”细胞。(a)则来自成纤维细胞与小鼠毒奶用逆转录病毒载体表达人类OCT4 KLF4, SOX2和原癌基因。(b)则是subcloned获得更好的菌落形态。(c) - (f) Subcloned细胞则呈阳性鼠Oct4 Nanog,同时DAPI用于染色细胞核。(g)染色法对碱性磷酸酶的表达毒奶iPSC积累。(h)核型分析DAPI染色中期利差。(我)qRT PCR分析内生Oct4, Nanog在毒奶和Sox2表达则和OG2 ESCs老鼠胚胎干细胞。(j) - (l)描绘neuroectoderm形成畸胎瘤部分,中胚层(结缔组织)和内胚层。

毒奶“诱导多能性”细胞的肝分化我们使用协议基于细胞聚集在拟胚体的生成 17, 21]。第一次培养拟胚体镀“悬滴”,然后在媒体包含 α-monothioglycerol支持内胚层的规范,在成熟肝细胞培养基(HCM),它支持肝前体细胞的分化。在这个协议的最后阶段,我们获得的细胞表现出一个多边形形态,类似的葡萄糖肝细胞(图 3(一个))。作进一步分析,构建慢病毒的分化细胞转导记者表达增强绿色荧光蛋白(eGFP)的转录控制白蛋白启动子/增强器盒( 21]。这个试验确定了polygonal-shaped eGFP-expressing肝细胞分化的细胞(图 3 (b))获得的最后一步分化协议。然而,eGFP-positive细胞总数的10%以下,而且,因此,假定的肝细胞被fluorescence-activated纯化细胞排序(流式细胞仪)在基因表达分析定量rt - pcr(图 3 (c))。的毒奶iPSC-derived肝细胞表达成人肝标记白蛋白(铝青铜),祖标记 α胎蛋白(法新社)、细胞角蛋白18 (Ck18),这是一个标记区分从cholangiocytic细胞肝细胞,转体基因(竞技场队伍)和肝细胞的核因子4 α(Hnf4 α)。此外,表达式的顶端共轭出口泵MRP2 (AbcC2)检测,两极分化肝细胞的特征,表现出基底(正弦)和微管的顶端膜域。接下来,我们应用250 μM硫酸铜在过去7天内的肝分化和评估ATP7B-mediated铜运输毒奶iPSC-derived相比,肝细胞肝细胞控制(影响mice-derived万能)。肝细胞的数量来自控制C3H-iPSCs增加1.8倍,250 μM硫酸铜是补充道,由于铜的毒性作用nonhepatic细胞在分化细胞的体积分数(图 3 (d))。值得注意的是,肝细胞来源于毒奶没有保护的细胞则在硫酸铜的挑战,这从另一方面也证实了ATB7B-deficient这些细胞的表型。

肝细胞分化的有毒牛奶“诱导多能性”细胞。(a, b)毒奶iPS受到肝分化使用挂滴法和慢病毒转导Alb-GFP表达载体。(c) qRT PCR分析肝标记基因法新社,铝青铜,Ck18、Abcc2,竞技场队伍,Hnf4 α。未分化细胞作为消极的控制,没有决定直到周期45(肝基因表达 ↓ )。(d)在过去的七天的分化,细胞与铜的挑战。的毒奶mice-derived细胞不能出口铜,和,因此,没有实现浓缩Alb-positive细胞。然而,C3H-derived控制铜后肝细胞能够“解毒”规范,因此,Alb-eGFP-positive细胞丰富。

 3.2。iPSC从FAH-Deficient老鼠研究酪氨酸血症1型

作为第二遗传代谢性肝病的小鼠模型,我们研究了fumarylacetoacetate水解酶敲除(华氏温标−−/)的老鼠 28),作为急性酪氨酸血症1型模型,导致致命的新生儿肝功能异常表型( 34]。我们已经生成的万能这些老鼠转导的c大调−−/-MEFs与逆转录病毒载体编码鼠标Oct4、Sox2 Klf4,原癌基因。9 - 12天之后首次转导第一iPSC-like殖民地观察,subcloned作为单独的c大调−−/ipsc线(图16天 4(a))。内生的表达在证实了这些重新编程细胞多能性标记免疫荧光染色法对小鼠Oct4和Nanog(数字 4(b)和 4(c))。完全重新编程华氏温标−−/万能细胞显示有效的重组转基因沉默(补充图1 (B)),保留正常核型(图 4(d)),激活内源性Oct4多能性网络有强表达,Nanog, Sox2(图 4(e))。此外,皮下注射后5周1×106未分化的c大调−−/万能NOD / SCID小鼠我们可以分析畸胎瘤,包含各种细胞类型中所描绘的一样从所有三个胚芽层数据 4(f) - 4(g),接下来,我们应用前面描述的肝 在体外差异化协议也华氏温标−−/万能。分化后,c大调−−/则显示表达的一组特征肝标记(法新社,铝青铜,Ck18、AbcC2竞技场队伍,Hnf4)如图 4(我)。肝细胞来源于华氏温标−−/万能的比例估计eGFP-positive细胞(数字 4(j) - 4(k)),最终分化期(5 + 9 + 20天),三天后与慢病毒转导记者构建表达eGFP由白蛋白启动子/增强器( 21]。因为新生儿华氏温标−−/小鼠可以从肝衰竭救出补充与化合物2 - (2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl) 1、3 cyclohexanedione (NTBC)我们还增加了这种物质在过去的10天 在体外差异化协议我们的实验(数据的一个子集 4(l) - 4(m))。荧光显微镜的差异化协议显示,治疗20 μ克/毫升NTBC支持来自c大调的肝细胞的可行性−−/万能,我们可以观察Alb-eGFP中占有相当高的比例pos细胞分化的细胞接收NTBC(图 4(左))而从未经处理的细胞分化细胞(图 4(j))。

华氏温标- / -“诱导多能性”细胞。(一)——(c) iPS来自成纤维细胞从c大调的分离−−/小鼠用逆转录病毒载体表达人类OCT4、KLF4 SOX2,原癌基因染色小鼠Nanog和OCT4。(d)核型分析DAPI染色中期利差。(e)的表达内源性Oct4, Nanog, Sox2由qRT PCR与胚胎干细胞相比。(f) - (h)华氏温标−−/细胞则能够形成组织移植时从所有三个胚芽层NOD / SCID小鼠皮下注射。(我)qRT PCR分析肝标记基因法新社,铝青铜,Ck18、Abcc2,竞技场队伍,Hnf4 α。未分化细胞作为消极的控制,没有决定直到周期45(肝基因表达 ↓ )。(j)——(k)华氏温标−−/万能干细胞分化使用挂滴法和慢病毒转导Alb-eGFP表达载体。(l) - (m)华氏温标−−/万能干细胞分化用同样的方法但NTBC治疗。NTBC-treatment救了致命的肝细胞的表型,和更多Alb-eGFP阳性细胞检测。

 3.3。这款Mice-Derived万能干细胞研究<斜体>α< /斜体> 1-Antitrypsin缺乏症

作为第三小鼠模型的遗传代谢性肝病,我们调查了PiZ-mice,表达一种变异的人类 α1-antitrypsin并获得人类肝脏特异表型( 27, 29日]。的这款 α1-antitrypsin蛋白对应一个点突变(E342K)在人类 SERPINA1基因( 35),称为蛋白酶抑制剂Z-variant或这款,容易聚合和聚集在肝细胞的内质网,可导致肝硬化和肝癌 36]。产生这样的万能这老鼠,我们从PiZ-mice与慢病毒载体转导耳成纤维细胞编码人类OCT4、SOX2和KLF4分别。转导iPSC-like殖民地选后14天,subcloned获得个人PiZ-iPSC线。这些细胞则描述了小鼠多能干细胞(图的形态特征 5(一))和一个紧凑的殖民地形状和一个明确的闪亮的边缘周围的支线细胞。此外,PiZ-iPS细胞碱性磷酸酶染色阳性(图 5(b))和拥有一个二倍体核型组成的40个染色体(图 5(c))。内生多能性的特征基因表达标记Oct4、Nanog Sox2在相同的范围控制小鼠胚胎干细胞(图 5(d)),而外生人类OCT4沉默相比,新转导这款耳成纤维细胞(补充图1 (C))。多能性的PiZ-iPSCs进一步证实了畸胎瘤形成皮下注射后NOD / SCID小鼠导致肿瘤与各种细胞类型的所有三个胚芽层(数据 5(e) - 5(g))。最后,我们研究了如果肝衍生品PiZ-iPSCs表达变异的人类 α1-antitrypsin变体。为此,我们遭受PiZ-iPSCs肝分化协议。在第五天+ 9 + 3的分化开始后,我们转导细胞使用慢病毒Alb-eGFP-expressing记者构造,我们可以观察形态不同的集群eGFP-positive分化肝细胞来源于PiZ-iPSCs 5 + 9 + 14天(数字 5(j) - 5(k))。分化和转导细胞也通过流式细胞术分析Alb-GFP阳性细胞在5 + 9 + 14天(图 5(l)证明绝大多数(65.3%)表现出肝细胞表型。当我们应用Taqman-based qRT这些肝PiZ-iPSC-derivatives PCR分析,我们能够证实肝表型通过展示一组特征的表达肝标记,如法新社、铝青铜,Ck18、AbcC2,竞技场队伍,Hnf4(图 5(h)),更重要的是,我们发现致病的表达这变异的人类SERPINA1转基因,如白蛋白表达式(图 5(m))。的功能分化这款特点是通过测量白蛋白分泌的细胞则通过ELISA,尿素生产,CYP450活动(图 5(我))。

这款“诱导多能性”细胞。(a)耳成纤维细胞产生的细胞则隔绝这老鼠用慢病毒载体表达人类OCT4 KLF4, SOX2。(b)对碱性磷酸酶染色PiZ-iPSCs的表情。(c)核型分析DAPI染色中期利差。(d) qRT多能性标记的PCR分析内源性表达Oct4, Nanog Sox2在PiZ-iPS和OG2 ES。(e) - (g)这款iPS能够形成组织移植时从所有三个胚芽层NOD / SCID小鼠皮下注射。(h) qRT PCR分析肝标记基因法新社,铝青铜,Ck18、Abcc2,竞技场队伍,Hnf4 α。未分化细胞作为消极的控制,没有决定直到周期45(肝基因表达 ↓ )。(我)iPSC-derived肝细胞的功能分析:白蛋白分泌检测ELISA,尿素生产,CYP450活动分析。(j)——(k) 5 + 9 + 14天肝分化PiZ-iPSCs转导5 + 9 + 3天,慢病毒Alb-eGFP记者构造(l) FACS-analysis 5 + 9 + 14天的肝Alb-GFP阳性细胞的分化。(m) qRT PCR分析表达人类SERPINA1和白蛋白cytokine-based d 5 + 9 + 14的分化,而未分化PiZ-iPSCs(灰色酒吧)。

结合最近两次突破干细胞生物学、代patient-derived多能干细胞( 37)和肝细胞的生成未提交的多能干细胞( 16, 18- - - - - - 20., 25),可能会出现治疗各种肝脏代谢疾病的新方法。对肝脏代谢疾病,最近的两项出版物的可行性从小鼠生成这种针对疾病的iPS细胞( 38)和人类个体( 39]。这些细胞提供一个独特的机会相应疾病的病理生理学的研究在细胞水平。为此,我们调查是否肝祖细胞描绘各自的疾病的病理生理特点可以从万能干细胞来源于小鼠模型生成的铜储存障碍威尔逊氏病( 26),急性酪氨酸血症I型( 28), α1-antitrypsin不足( 29日]。所有三个小鼠疾病模型涵盖了患者的肝脏疾病表型的相关特征,研究动物模型。

尽管最近的出版物表明等iPSC代替代方法使用nonintegrating病毒载体( 40- - - - - - 43)、蛋白质转导( 44, 45),质粒转染( 46),或稳定的mRNA的应用程序( 47),我们选择了成熟的gamma-retroviral向量系统[ 7, 31日)交付的重组因子从毒奶mef老鼠和华氏温标−−/小鼠和最近改进的慢病毒的交付系统从PiZ-mouse iPSC代成纤维细胞( 48]。根据最近的出版物区分部分和完全重新编程细胞则和万能的表观遗传记忆的差异 49- - - - - - 51),我们假设的最稳定的重组病毒交付方法系统。支持这一结论的事实完全iPSC-derived老鼠到目前为止,只有使用万能干细胞生成派生这些病毒技术互补的nondeveloping四倍体胚胎( 49, 52- - - - - - 54]。分子和功能数据从我们的实验提供了强有力的证据,我们的iPSC的各种疾病模型完全重新编程为我们观察到一个稳定的精原形态多个段落,强烈的表达多能性标记,最重要的是,没有分化成肝细胞功能,应用 在体外差异化协议。

即使胚状体精神肝分化协议( 17, 21)不使用的外在补充有益的细胞因子作为诱导激活素A或BMP4内胚层的分化,我们获得的强劲的比例大约10%的细胞,获得肝表型。此外,这些细胞与各自功能相关的疾病,如灵敏度过量铜政府毒奶肝细胞或响应在华氏温标NTBC治疗−−/肝细胞。当我们分析了 α1-antritrypsin相关万能这老鼠,我们选择一个最近建立了cytokine-based差异化协议,这是基于单层细胞培养在媒体无血清条件( 16]。初步结果表明,该协议的肝细胞获得更成熟,但该协议的整体再现性需要进一步关注。最有可能,最佳的细胞因子应用程序时间表是强烈依赖于细胞增殖和密度以及其他因素在分化的时间进程,,因此,这个协议的健壮性是不容易实现。然而,我们选择这个协议PiZ-iPSCs肝分化的,因为我们的目标是进一步详细说明 α1-antitrypsin-defiency与patient-derived iPSC在未来,只有人cytokine-based协议按照单层iPSC文化。

 4所示。结论

这里,我们成功地生成iPSC从三个高度相关的小鼠代谢肝病模型,我们建立了 在体外分化成肝细胞特异,展览的病理生理表型临床条件。这些细胞将允许未来的研究新的药物靶点或基因修复策略各自的肝脏代谢障碍。

 确认

作者非常感激河中沙洲Zaehres和Axel Schambach代与病毒结构和支持(pMX逆转录病毒毒奶iPSC的生成和华氏温标iPSC (H.Z.),慢病毒载体(A.S.)这一代的万能干细胞)。此外,他们感谢马蒂娜Radstaak优秀的技术援助。部分这项工作是由美国联邦教育部和研究(拨款。01 gn0812 01 gm0854)和德国研究基金会(DFG EXC 62/1)。

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