SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 795239年 10.4061 / 2011/795239 795239年 研究文章 Cancer-Testis抗原的表达模式在人类胚胎干细胞及其细胞衍生品指示血统追踪 Lifantseva 以“ 1 Koltsova 安娜 2 Krylova 塔季扬娜 2 Yakovleva 塔季扬娜 2 Poljanskaya 加林娜 2 Gordeeva 奥尔加 1 沈 Perng-chih 1 柯里佐夫发育生物学研究所 俄罗斯科学院 26瓦维洛夫街,119334年莫斯科 俄罗斯 ras.ru 2 研究所的细胞学 俄罗斯科学院 194064年4 Tikhoretsky大道,圣彼得堡 俄罗斯 ras.ru 2011年 18 7 2011年 2011年 14 03 2011年 25 04 2011年 2011年 版权©2011 Nadya Lifantseva et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

多能干细胞可以分化成不同的血统,但经过在长期培养和遗传和表观遗传变化,因此,需要定期监测。cancer-testis抗原的表达模式(cta) MAGE-A2 a3、a4, a6, a8, b2,和计检查在未分化的人类胚胎干细胞(他)细胞,分化他们的衍生品,畸胎癌(hEC)细胞和癌症细胞系neuroectodermal和中胚层起源。未分化的他细胞和胚状体的身体细胞表达MAGE-A3, a6, a4 a8,抵押品,而后来分化衍生品只有MAGE-A8 MAGE-A4表示。同样,鼠标也多能干细胞表达cta Magea但不是Mageb家庭。尽管他和hEC细胞表达模式的相似性,MAGE-A2和MAGE-B2只发现在hEC细胞而不是他。此外,我们的分析表明,cta异常表达在癌症细胞系和显示较低的组织特异性。CTA表达模式识别的多能干细胞及其衍生品可能有用隔离异常CTA-expressing细胞改善基于干细胞治疗的安全性。

 1。介绍

两种方法对多能干细胞线生产开发。隔离的传统的方法包括从胚胎植入前的胚胎多能细胞或胚胎生殖细胞系细胞转化为多能干细胞( 1- - - - - - 4]。另一种方法是实验的体细胞基因组重组改变他们的分化潜能。有三种技术重组:体细胞核移植,多功能的融合和体细胞,诱导多能性引入pluripotency-related体细胞的基因或蛋白质( 5- - - - - - 7]。尽管不同的起源,所有的多能干细胞系显示相当相似的基本生物学特性:高自我更新率和能力的体外和体内分化成多种细胞类型。另一方面,比较分析众多派生人类胚胎干细胞(他)细胞系证明他们在细胞生长速率不同,基因表达谱、基因甲基化谱,microRNA概要文件( 8- - - - - - 10]。这些差异可能是由于多能胚胎细胞的遗传背景初始化他的细胞系,使用不同的文化系统的维护以及随机事件在长期体外培养导致基因改变( 11- - - - - - 14]。此外,诱导多能干细胞(iPS)细胞来源于不同体细胞的分化和肿瘤发生的电位不同 15- - - - - - 17]。转录的变异和基因甲基化谱的人类ES和诱导多能干细胞被广泛讨论 18- - - - - - 24]。

大量研究表明,长期会导致不同的遗传畸变的积累和培养多能干细胞异常的表观遗传变化,这样的变化可以导致基因组不稳定性,细胞转化和癌症发展( 11, 13, 25, 26]。此外,大多数诱导多能干细胞是由overactivation致癌基因的细胞原癌基因和Klf4可能提高他们的自发控制表达式未分化的多能干细胞和分化的祖细胞,这些细胞,因此,可能会转化为癌症干细胞( 27]。综上所述,所有这些数据表明利用多能干细胞系需要定期监测的遗传和表观遗传的完整性。此外,大规模搜索新基因标记的识别需要的细胞进行了肿瘤发生的转变。

Cancer-testis-associated抗原(cta)可能被视为潜在的候选基因特定转化细胞,因为它们经常表达在不同类型的癌症,但在正常组织表达模式很受限制 28]。所有cta显示男性性腺表达,其中一些表达在滋养层,胎盘,中枢神经系统和发展中 29日- - - - - - 33]。一些基因家族广泛表达在体细胞和生殖细胞以及肿瘤细胞( 30.]。此外,某些cta发现了间充质干细胞和分化他细胞( 29日, 34]。然而,大多数CTA家庭的细胞功能,包括超过100个基因保持神秘。最近的研究表明,cta参与转录的规定( 35),细胞周期和增殖 36- - - - - - 39,细胞凋亡 40),和对细胞因子在癌症细胞 41]。此外,一些cta的表达包括MAGEA SSX, NY-ESO家庭监管epigenetically启动子甲基化和组蛋白乙酰化作用机制( 42- - - - - - 44]。CTA蛋白质被发现的一个子集引起自发的体液和细胞毒性T-cell-mediated在癌症患者的免疫反应,因此,这些抗原可能是潜在的癌症疫苗目标( 28, 45, 46]。

另一方面,cta可能参与早期胚胎血统的规范。MAGEA和计的家庭已经证明在人类生殖细胞系表达具体的开发过程中男性和女性的生殖系统( 47- - - - - - 50]。为了澄清CTA的可能作用在天堂决心在CTA的早期发展和特异性表达在病理组织的发展过程中,我们检查了CTA表达模式的法师,B, D,多能干细胞和计的家庭,他们自发分化细胞衍生品和癌症细胞系来源于neuroectodermal和中胚层来源的组织。

 2。材料和方法 2.1。细胞系

我们利用他细胞系SC5、SC7 SC3a源自囊胚(细胞学研究所俄罗斯科学院圣彼得堡)( 51]。小鼠ES细胞R1线请提供a纳吉(西奈山医院,多伦多,加拿大),小鼠胚胎生殖细胞(如)线EGC-10源自E10.5胚胎是由a迈凯轮(WTCR癌症和发育生物学研究所,剑桥,英国)。癌症细胞系都从俄罗斯获得细胞培养收集( http://www.rccc.cytspb.rssi.ru/)。使用以下组的癌症细胞系:(1)人类畸胎癌PA-1和鼠标畸胎癌F9,(2)人类神经母细胞瘤IMR-32 SK-N-MC,(3)人类恶性胶质瘤- 172,GL-6 (u - 251毫克),t - 98 g,(4)人类横纹肌肉瘤- 204 v和胚胎性横纹肌肉瘤RD,和(5)人类骨肉瘤HOS (TE85,克隆F5), mg - 63 u - 2操作系统。

 2.2。人体组织标本

睾丸和大脑的人类组织样本来自成年男性在法医尸检体检,莫斯科卫生行政部门。人体组织取样程序进行葬礼根据俄罗斯联邦法律和制度伦理委员会批准。解剖后,立即组织样本被转移到试剂盒试剂(表达载体)。

 2.3。小鼠胚胎和组织样本

C57Bl / 6小鼠2 - 3个月时得到的动物育种Facility-Branch“Pushchino”(有机化学研究所、俄罗斯科学院)。动物保持和试验机构伦理委员会批准。总rna提取从7.5 E小鼠胚胎与胎盘,胎儿性腺与附加E11.5胚胎的中肾有关,和男性胎儿性腺E14.5胚胎。此外,总rna分离睾丸和大脑组织样本的成年雄性老鼠。

 2.4。细胞系的维护

人类ES细胞在人类胚胎成纤维细胞馈线线路维护细胞(俄罗斯研究所的脊椎动物细胞培养的细胞学)灭活通过丝裂霉素C治疗(10 ug / mL,σ)。胚胎干细胞及其分化细胞衍生品被种植在淘汰赛杜尔贝科修改鹰的介质(KDMEM)补充了2毫米谷酰胺,不必要的氨基酸1%,10 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子bFGF(表达载体),0.1毫米 β巯基乙醇(σ),15%击倒血清替代(Gibco /表达载体)。殖民地的未分化细胞他手动脱离馈线细胞,分为细胞集群和转移到低粘附文化板块球体代或新板块与馈线细胞扩张。从加料器细胞隔离后,他细胞集群形成拟胚体(EBs)一天之内培养成低粘附板块(他一一Bio-one)。在第十天的培养不依从文化、EBs收集和用于rt - pcr分析。

他的早期细胞衍生品SC5或SC7细胞已经从自发分化孤立附着ES细胞培养维护没有馈线细胞10 - 14天他手机媒体。统一的细胞来自于胚胎外的内胚层,早期neuroectodermal-like莲座状结构和手动mesenchymal-like细胞被孤立,feeder-free条件下传播和收集rt - pcr和免疫组织化学分析。

小鼠ES和EG细胞保持在小鼠胚胎成纤维细胞丝裂霉素C或支线细胞灭活的feeder-free系统媒体包含白血病抑制因子(生活,10 ng / mL)。小鼠ES和EG细胞、鼠标畸胎癌F9和人类畸胎癌PA-1细胞在DMEM培养补充2毫米谷酰胺,不必要的氨基酸,1% (HyClone), 0.1毫米 β巯基乙醇(σ),15%胎牛血清(HyClone)特点。EB代R1 EGC-10 F9, PA-1细胞被置于“悬滴”为3天(每减少500个细胞)。形成后,EBs收集和培养10天在低附着力盘子。

神经母细胞瘤,胶质母细胞瘤,横纹肌肉瘤,骨肉瘤细胞系维持此前推荐这些细胞株(见 http://www.rccc.cytspb.rssi.ru/)。

 2.5。畸胎瘤和畸胎癌试验

畸胎瘤和畸胎癌,我们作为接受者免疫缺陷裸体小鼠的动物育种Facility-Branch“Pushchino”。所有动物研究机构生命伦理委员会批准的协议。鼠标,如和EC细胞和人类ES和EC细胞皮下注入裸小鼠(106细胞/鼠标)。肿瘤的发展,动物牺牲后,畸胎瘤和畸胎癌被孤立和10%多聚甲醛固定(σ),根据标准方法脱水,嵌入到石蜡切片。组织准备被苏木精和伊红染色和莱卡DMRXA2显微镜下检查。

核型分析

准备中期染色体,0.1 μg / mL秋水仙胺(美国Gibco Karyomax)添加到培养基细胞固定前4 h。分离后,细胞治疗低渗的0.075氯化钾溶液和1%柠檬酸钠,然后由冰醋酸(3:1)。中期利差是由滴细胞玻片上紧随其后的是空气干燥。准备中期利差的彩色染色方案。核型分析,常规G-banded技术应用。不少于30中期SC5利差,SC7, SC3a进行分析。他细胞分析研究了一个Axio成像仪M1显微镜(德国卡尔蔡司)Ikaros4核型分析系统(MetaSystems、德国)和描述为人类细胞遗传学命名根据国际系统。

 2.6。检测碱性磷酸酶活性(高山)和免疫染色

人类和小鼠ES,例如,EC细胞和EBs在磷酸盐溶液,2%多聚甲醛固定15分钟内PBS, pH值7.0。高山活动被发现在解决方案包含10毫升0孵化后,02年M Tris-HCl缓冲(pH值8日7),1毫克Naphtol-AS-B1-phosphate, 5毫克快红染料德克萨斯红(从σ)37°C 1 h。

免疫荧光分析,细胞固定在4%多聚甲醛在PBS 1 h清洗和permeabilized Triton x - 100(σ)为0.5%。非特异性反应被鸡血清(Gibco /英杰公司)的10%。细胞被孵化的解决方案主要抗体PBS-Tween 20一夜之间在4°C。主要抗体兔子anti-Oct4,山羊anti-GATA4(圣克鲁斯生物技术),山羊anti-Nanog(研发系统),鼠标anti-Nestin (Abcam),反 α辅肌动蛋白(σ),和兔子anti-BRY (Abcam)被用于稀释1:100。二次鸡antirabbit、驴antigoat和鸡antimouse抗体共轭与Alexa萤石594和Alexa萤石488(分子探针)稀释1:900年阻止缓冲区和应用于细胞3 h在室温下。DAPI(分子探针)申请核染色了20分钟。细胞被安装和徕卡DMRXA2荧光显微镜下检查。消极的控制,主要抗体被省略了,使用了相同的染色过程。

 2.7。RNA隔离和rt - pcr分析

总rna提取细胞系,人类和小鼠组织,和老鼠胚胎样品使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的建议。每个样本处理涡轮DNase (Ambion /英杰公司)为了避免DNA污染,和1 μg总RNA从每个样本的反向转录使用RevertAid M-MuLV逆转录酶和随机六聚物寡核苷酸引物(Fermentas)互补脱氧核糖核酸的合成。PCR反应混合物准备根据制造商的协议Taq(石英玻璃)。探测器在94°C变性5分钟和骑车45 s 94°C,在58为45°C年代,在72°C 45 s紧随其后的是最后在72°C扩展完成后5分钟30周期。管家基因的表达(人类RPL19和鼠标产生Hprt基因)是用于PCR反应正常化。引物序列和规模的预期产品表中表示S1和S2(看网上辅料doi: 10.4061 / 2011/745239)。GAGE1引物对,2、10、12、13是借用 29日]。

 3所示。结果 3.1。CTA基因的表达在成年人类和小鼠睾丸和大脑组织

首先,我们测试了CTA表达式通过rt - pcr检测的引物在正常人类和小鼠组织作为积极的和消极的控制。MAGE-A2的表达,a3, a6, a4, a8, MAGE-B2, MAGE-D1, d2,计家族的一些成员(GAGE-1 2 -10、-12、-13)被发现在人类睾丸只有MAGE-D1和MAGE-D2表达在人类大脑样本(数据 1(一)- - - - - - 1 (c))。同样地,我们发现Mage-a4的表达,Mage-a 1, 2, 3, 5, 6, 8, Mage-b 1 - 3, Mage-b3, Mage-d1, d2在小鼠睾丸和Mage-d1 d2在大脑相应数据 1 (d)和 1 (e))。我们的分析表明,所有的聚合酶链反应序列引物只发现预期的大小和没有发现额外的非特异性序列。此外,所有cta的表达研究中只发现睾丸而正常体细胞组织(大脑样本)只有MAGE-D1 d2 / MAGE-D1 d2表示。

CTA表达式在成年人类和小鼠睾丸和大脑样本。名称:T:人类睾丸,B:人类大脑。

 3.2。CTA在人类ES和EC细胞基因表达

人类ES细胞系SC5 SC7, SC3a最近派生和多能干细胞的特征标准体外和体内试验( 51)和(图 2(一)- 2(c))。这些细胞系的细胞遗传学分析表明,他们保留了正常二倍体核型形成在至少30段落:46,XX SC5和SC3a和46,XY SC7(图 2(c))。然而,这些线的分化潜能被发现是不同的。人类ES细胞系SC5 SC7形成畸胎瘤和三个胚芽层(图的衍生品 2(b)),而SC3a细胞更容易分化体外生长在畸胎瘤并限制能力。

CTA在他SC5表达模式、SC7 SC3a hEC PA-1细胞和细胞。(a)碱性磷酸酶活性和OCT4在未分化的他和hEC在EBs细胞和由这些细胞系。比例尺= 100 μm。(b)通过畸胎瘤和畸胎癌组织学部分由他和hEC细胞株。细胞中发现的三个胚芽层衍生品畸胎瘤(te)完全由他细胞和癌细胞在畸胎癌(TEC)。比例尺= 100 μm。(c)的正常二倍体核型形成他SC5, SC7,和SC3a细胞:SC5-46, XX;SC7-46 XY;SC3a-46, XX。(d)的表达在他SC5 cta, SC7, hEC PA-1和SC3a细胞,细胞和EBs由这些细胞。

在我们的实验中,未分化SC5、SC7 SC3a细胞和EB细胞表达关键多能性基因OCT4 NANOG和高高山活动(数据显示 2(一)和 2(d))。在区分10天EBs, OCT4的表达和NANOG是表达下调,和高山活动减少(数字 2(一)和 2(d))。CTA表达式的分析表明,在未分化的他细胞株SC5, SC7, SC3a只有MAGE-D1, d2表示在高级别上,而其他CTA基因不表达或表达很弱(图 2(d))。似是而非的,低水平的表达可能是由于一些分化细胞有时污染未分化的细胞培养。另一方面,这些cta可以表示在未分化和分化早期他细胞。在两个他细胞系、SC5 SC7, MAGE-A3的表达,a6, a4、a8和量规检测细胞未分化的他和10天EBs由这些行。然而,细胞未分化的他和EBs SC3a线表示MAGE-A3, a6, a8和抵押品,但没有表达MAGE-A4。的表达MAGE-A2 MAGE-B2并没有检测到任何行研究。此外,每个他细胞系的表达谱段期间保持稳定(数据没有显示)。

Nullipotent畸胎癌PA-1细胞的多能干细胞恶性对应完全分化的能力(数据丢失 2(一)和 2(b))。EC PA-1细胞和EBs表达了高水平的OCT4 NANOG和几乎所有的商品交易顾问基金研究,MAGE-A2, a3, a6, a8, MAGE-B2, MAGE-D1, d2,计家庭基因。有趣的是,就像他SC3a细胞,PA-1细胞不表达MAGE-A4(图 2(d))。我们对hEC PA-1细胞和他细胞的分析表明,CTA表达谱非常类似,但是,与此同时,他们在两个CTA的表达不同。

 3.3。CTA基因表达在人类ES细胞分化衍生品

我们研究了三种类型的人类胚胎的早期分化细胞衍生品SC5和SC7细胞在体外自发他细胞分化成为主流。这些细胞很容易区别于其他细胞形态,很容易与其他细胞在细胞分离(图发展结果 3(一个))。识别细胞类型,我们分析了特定的基因和蛋白表达的研究样本。特定的标记基因的表达多能(OCT4、NANOG),胚胎外的内胚层(GATA4,法新社),neuroectodermal(巢蛋白)和mesenchymal-like (BRY和 α辅肌动蛋白被rt - pcr检测(图)细胞 3 (b))和免疫组织化学染色(图 3(一个))。分析CTA表达在这些选定的细胞衍生品已经表明,胚胎外的内胚层细胞表达高水平的GATA4法新社和低水平的OCT4表达MAGE-A8 MAGE-D1, d2(图 3)。Mesenchymal-like细胞, α辅肌动蛋白阳性但BRY-negative CTA表达谱类似于胚胎外的内胚层细胞(图 3)。相比之下,neuroectodermal细胞衍生品表达巢蛋白和MAGE-A4(图 3)。此外,所有三个细胞类型表示MAGE-D1, d2基因和基因没有表达计。

cta和lineage-specific基因的表达在细胞分化他衍生品。(一)形态学和免疫染色的胚胎外的内胚层衍生品抗体GATA4 OCT4、间充质细胞 α辅肌动蛋白和OCT4、巢蛋白和NANOG neuroectodermal细胞。比例尺= 100 μm。(b)的cta和谱系标记基因表达谱他细胞衍生品。

 3.4。cta的表达在人类癌症细胞系Neuroectodermal和中胚层起源

为了确定CTA-specific表达式模式是否与肿瘤的组织学起源或与其他特点,我们测试了细胞系是来源于胚胎(神经母细胞瘤、胚胎性横纹肌肉瘤),童年(横纹肌肉瘤,骨肉瘤),和成人癌症起源于中胚层和neuroectodermal(胶质母细胞瘤)。此外,OCT4的表达和NANOG在所有癌症细胞系(数据研究 4(一)和 4(b))。

cta在癌症细胞系来源于neuroectodermal和中胚层来源的组织。(a)细胞形态神经母细胞瘤和恶性胶质瘤的免疫染色这些细胞系对OCT4抗体。比例尺= 100 μm。(b)采用免疫分析OCT4表达式在横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞系。比例尺等于100 μm。(c) CTA癌症细胞系的表达谱neuroectodermal和中胚层的血统。

在神经母细胞瘤细胞系IMR-32 SK-N-MC, CTA表达模式明显不同。SK-N-MC细胞表达所有法师测试而IMR-32细胞只有两个(图 4(c))。然而,MAGE-B2的表达和不同级别的MAGE-A8细胞系中检测到。所有三个胶质母细胞瘤细胞系,GL-6 - 172, t - 98 g,表示MAGE-A8和很弱的MAGE-B2水平。两三个细胞系,GL-6和t - 98 g, MAGE-A3表示。因此,大多数组织的癌症细胞系neuroectodermal起源表示MAGE-A8和MAGE-B2 mrna但胚胎肿瘤(神经母细胞瘤)表达明显高于MAGE-B2水平。量规的表达中没有检测到任何neuroectodermal癌症细胞系(图 4(c))。

CTA癌症细胞系的表达谱分析中胚层来源的组织已经表明,他们都表达了变量MAGE-A8和MAGE-A4水平。两行,胚胎性横纹肌肉瘤RD和骨肉瘤u - 2侦察机OS, CTA概要文件很相似,除了MAGEB 2,表示几乎所有商品交易顾问基金研究包括量规(图 4(d))。

如前所述,OCT4的表达,NANOG,巢蛋白,BRY测试癌症细胞系。有趣的是,mrna OCT4、NANOG被rt - pcr检测到在所有癌症行疣状的蛋白质并没有透露。同样,低表达BRY被发现在mRNA水平在横纹肌肉瘤,恶性胶质瘤和巢蛋白在神经母细胞瘤和但不是在蛋白质水平(图 4和数据未显示)。我们建议OCT4和NANOG成绩单在所有癌症发现线研究可能假基因相关,没有功能意义。同样,BRY和巢蛋白mRNA的表达水平可能在这些细胞被激活异常经常观察到癌细胞。

 3.5。CTA在小鼠ES基因表达谱,例如,EC细胞和小鼠的生殖细胞系细胞

基因小鼠法师而已,就像人类同系物,在多种肿瘤中表达,在胎儿和成人男性性腺,几个胚胎,胚胎外的组织( 52- - - - - - 57]。为了确定特定的Mage-a和Mage-b基因表达模式可以归因于多能干细胞分化,CTA表达谱检测在小鼠多能干细胞(ES和EG细胞)和胚畸胎癌细胞(数字 5(一)和 5(b))。此外,我们比较的资料鼠标原始生殖细胞在种系发展的关键阶段:外胚层细胞在早期原肠胚形成阶段,postmigratory原始生殖细胞后他们的职业发展中生殖器隆起和男性胚胎性腺的生殖母细胞。我们的结果表明,多功能ES和EG细胞,nullipotent畸胎癌EC细胞及其EB Mage-a1表示,2,3,5,6,8,Mage-d1 d2但没有表达cta Mage-b家庭。此外,Magea-4基因的表达中检测出EGC-10和EC F9细胞而不是在ES细胞R1(图 5(b))。

基因表达谱的cta在小鼠ES,例如,EC细胞和小鼠生殖细胞系细胞。(一)多能ES和EG细胞和nullipotent EC细胞表达碱性磷酸酶和EBs Oct4和发展;ES和EG细胞分化成衍生品三个胚芽层畸胎瘤(te、羊毛)而EC细胞增长体内恶性肿瘤(TEC)。比例尺等于100 μm。(b)的cta的表达,Oct4, Nanog在小鼠ES,例如,EC细胞和EBs。(c) CTA表达谱的生殖细胞系细胞分离出胚胎7.5 E, E 11.5和14.5 E阶段。

的资料研究阶段的胚胎生殖细胞系细胞非常相似,因为所有的cta测试,除了Mage-a4,表示在所有类型的生殖细胞系细胞(图 5(c))。有趣的是,与其他cta, Mage-a 4是成年小鼠睾丸中表达而不是早期的原始生殖细胞和生殖母细胞。因此,小鼠ES的CTA表达谱,例如,甚至EC细胞明显不同与早期的外胚层细胞。另一方面,老鼠和人类胚胎生殖细胞系细胞表达了类似的CTA家庭除了计抗原在老鼠并不确定。

 4所示。讨论

大多数CTA基因的表达在正常组织仅限于成人睾丸生殖细胞,但异常激活各种类型的癌症。此外,cta发现了被表达在胚胎胚芽和体细胞胚胎外的结构( 29日, 50]。我们假设表达式模式独特的cta在生殖细胞可能是发展项目的一部分,其中包括生殖细胞系的限制体细胞早期原肠胚形成阶段。另一方面,偏离正常的血统规范可能与干扰相关的典型CTA表达模式。我们调查了CTA表达模式在ES细胞分化正常血统的体外使用它们作为模型规范和比较CTA的未分化的胚胎干细胞,分化细胞衍生品,癌症细胞系neuroectodermal和中胚层起源以识别重合和歧视基因子集。

我们的研究结果表明,未分化的多能细胞他mRNA表达低水平的几个cta, MAGE-A3, a6, a4、a8和量规。注意MAGE-A4不是他SC3a细胞系中表达不同于SC5 SC7细胞在生长和分化潜能( 51]。但是,与未分化的细胞,他早期细胞衍生品只有一个基因的表达MAGEA家庭和没有表达cta计的家庭。这不能排除MAGE-A4和a8表达可能是未分化的他细胞和胚胎外的内胚层,mesenchyme-like neuroectoderm细胞也居住在EBs而MAGE-A3 a6,量规表示只在多能细胞。

此前,Gjerstorff et al。 29日]还发现MAGE-A2 MAGE-A6表达EBs KMEB1和KMEB2他细胞系和细胞衍生品的畸胎瘤细胞而不是无差别的他。然而,只有3 6他细胞系研究表示cta在体外和体内分化。此外,量规的表达没有发现在他细胞或在EBs。在我们的实验中,相同的引物对用于计表达分析,但低水平的计1,2,10,12 13转录被发现在两个细胞未分化的他和EBs细胞系的研究。相反,我们没有观察到的表达MAGE-A2在任何他细胞系或分化细胞衍生品但MAGE-A2 mRNA在EC PA-1细胞识别。如上所述,SC5 SC7他细胞系有非常相似的CTA表达谱和类似的增长和分化潜能,而且,此外,每个他细胞系保留了其特定的CTA概要文件在长期栽培。我们假设写在行间的CTA表达模式的差异可能对某种特点他细胞系的状态。

鼠标多能ES和EG细胞也表达了几个Mage-a家族的基因,但是,令人惊讶的是,Mage-a4表达只在鼠标和EC细胞。此外,Magea4的表达中没有检测到鼠标11.5 E的原始生殖细胞和胚胎E14.5虽然Mage-a4在成年男性性腺表达。老鼠胚胎和成年生殖细胞也表达了Mage-b1, 2、3基因与鼠标多能干细胞。同样,MAGE-B2在成人睾丸被发现的表达而不是发现在人类ES细胞或细胞衍生品。因此,小鼠ES的CTA表达谱,例如,和EC细胞明显不同甚至从早期外胚层细胞以及从原始生殖细胞。因此,多能干细胞体外可能不完全等同于这些胚胎细胞类型。然而,CTA表达谱的相似人类和小鼠多能干细胞表明他们的相似的细胞状态和起源。

对CTA表达在生殖的发展和在哺乳动物体细胞血统。之前的研究表明,在人类的原始生殖细胞的决心,分化和性腺成熟,CTA表达模式进行重大改变。首先,计蛋白质在男性和女性表达了原始和成熟的生殖细胞,从5 - 8周的妊娠期到成年期( 29日, 49, 50]。MAGE-A1的表达、MAGE-A4 NY-ESO-1胎儿睾丸和卵巢开始晚于规表达式和终止在男性和女性的不同发展阶段胎儿性腺( 47, 48, 50]。MAGE-A4已经发现单个细胞的表达首先胎儿睾丸17岁的周,之后,MAGE-A4-positive生殖母细胞和spermatogonia逐步增加到28周。MAGE-A1和NY-ESO-1蛋白质也发现在胎儿睾丸9岁的周,在卵巢13周的年龄,但这些蛋白质显示微分表达式通过雄性和雌性生殖细胞发展模式。我们的数据对Mage-a、Mage-b Mage-d表达模式在鼠标原始和胎儿生殖细胞也首次演示CTA含义在早期小鼠种系发展以及相似与相异的CTA在老鼠和人类胚胎细胞表达模式。

除了生殖细胞,MAGE-A家庭成员被表达在体细胞血统,特别是,在人类发展中中枢神经系统和周围神经和肌刀和成肌细胞在早期阶段(从5到8周)但没有MAGE-A表达式中检测出17 - 23周的神经结构旧胎儿或在成年人的大脑 29日]。此外,这些作者报道,计蛋白表达在早期neuroectodermal和外胚层的细胞,但他们表达消失在这些血统的后来分化细胞。此外,MAGE-A蛋白表达不与neuroectodermal规表达式模式的细胞与生殖细胞。我们发现MAGE-A4 MAGE-A8表达间充质和neuroectodermal细胞来源于他早期细胞符合以前的观测对人类胎儿组织和细胞分化他畸胎瘤( 29日]。另一方面,我们并没有发现计表达上述分化细胞类型。因此,进一步详细的CTA检查表达式模式在不同的细胞类型来自多能细胞在体外分化和胚胎组织中可以阐明这种差异。

cta的表达中也检测到肿瘤组织。我们确认MAGE-A8 MAGE-D1 d2表达在胚胎外的内胚层细胞来源于他。以前,超过50人的胎盘免疫组化染色的样品不同的妊娠年龄、MAGE-A3和MAGE-A4表达高水平的披露而NY-ESO-1的表达和量规是零星的 31日]。全基因组分析CTA表达在正常和癌组织显示MAGE-A 2 - 6, 8 - 11, XAGE表达在胎盘 30.]。人类MAGEL2基因及其小鼠同系物MAGEL2被发现在人类和小鼠胎盘( 56]。综上所述,所有这些数据证明cta参与生殖细胞系和体细胞血统发展不同的哺乳动物。特定的时空模式的cta表达可能与不同血统的决心和规范在胚胎和多能干细胞分化(图 6)。

cta表达多能细胞和不同血统的衍生品。数据总结了本研究(以棕色和红色)和( 29日- - - - - - 31日, 34, 47- - - - - - 50, 52- - - - - - 57]。人类cta使用大写字母标记。

我们工作的另一方面是CTA表达谱的分析恶性畸胎瘤细胞系的同行的多能干细胞和癌症细胞系来源于neuroectodermal和中胚层来源的组织为了找到CTA的特异性表达在正常和病理组织的发展。最初,我们比较CTA的未分化的细胞他,hEC细胞,EBs由这些细胞系。他和hEC细胞CTA概要文件非常相似,但hEC细胞表达了两个额外的基因,MAGE-A2 MAGE-B2,没有多能干细胞中表达。此外,hEC PA-1细胞表达MAGE-A4不像他SC3a细胞系。有趣的是,CTA概要研究小鼠ES细胞不同于那些只在Mage-a4老鼠EC细胞,而且,此外,老鼠EC F9细胞表达Mage-a4而不是人类EC PA-1细胞。然而,Mage-a4也表示在正常小鼠EG细胞系。因此,MAGE-A4 / MAGE-A4表达式模式是可变的小鼠和人多能和畸胎癌的细胞,和这个表达式在多能细胞的特异性问题仍然是开放的。正常睾丸的最近的研究和不同类型的生殖细胞肿瘤显示正常spermatogonia MAGE-A4而未分化精原细胞瘤特异表达和精原细胞瘤细胞和生殖细胞肿瘤病患则消极抗原( 47]。另一方面,MAGE-A2的表达,a3, b1, b2也发现在大多数精原细胞瘤的研究虽然MAGE-A2和MAGE-A4表达纯胚胎性癌肿瘤,以及半纯粹的卵黄囊肿瘤样本( 33]。此外,在我们的研究中hEC PA-1cells表示MAGE-A2和MAGE-B2没有在他发现细胞,和,因此,这些cta可能被视为候选基因的进一步调查早改变了多能细胞的标记。

neuroectodermal癌症行CTA表达式的分析表明,MAGE-A8 MAGE-B2, MAGE-A3, a6 MAGE-D1一起,d2表达在大多数细胞系测试而neuroectodermal早期细胞来源于他表示只有MAGE-A4和MAGE-D1, 2。因此,没有共同的基因MAGE-A,法师- B,计家庭公布在正常和肿瘤细胞谱系。另一方面,MAGE-A1和MAGE-A3表达的频率在不同的星形细胞瘤和恶性胶质瘤已经演示了不同范围从0到30% 58- - - - - - 60]。因此,CTA在脑瘤可能低的组织特异性表达模式。同时,我们决定MAGE-A8和MAGE-A4常见cta横纹肌肉瘤,骨肉瘤的表达谱线,和MAGE-A8也发现他细胞的间质衍生品。有趣的是,neuroectodermal和中胚层起源的肿瘤细胞系表达MAGE-A8虽然通常是表达间充质细胞他衍生品。

最近发现一些商品交易顾问基金,包括SSX NY-ESO-1, N-RAGE,也表现在未分化的间充质干细胞(msc)源自成人骨髓或胚胎肝脏,但他们的表达下调后骨细胞和脂肪细胞的分化 33]。这些重要的数据需要进一步调查以来,目前尚不清楚CTA表达式的特点是msc在体外培养或激活同样的癌症。

总的来说,CTA表达式是高度可变的频率在不同肿瘤类型( 28, 30., 60]。例如,黑素瘤、卵巢、肝脏和肺癌肿瘤“CTA-rich”,因为他们有高频率的CTA表达造血,冒号,肾和胰腺癌症CTA表达的频率较低。此外,更高的组织学分级和后临床阶段的癌症和转移性肿瘤显示CTA表达的频率高于原发性肿瘤。CTA的频率表达与预后最差。因此,它似乎是合理的,cta异常激活和表达不同的癌症和谱系特异性较低。然而,考试和系统化的CTA在胚胎和成年正常细胞表达模式以及不同类型的肿瘤细胞可能照亮CTA是否与正常和病态的传承发展。

 5。结论

我们已经表明,一些商品交易顾问基金,比如MAGE-A3, a4, a6, a8,量规,表示在未分化他细胞和早期分化EB MAGE-A家族只有一个基因表达在后期他细胞分化细胞衍生品,MAGE-A8胚胎外的内胚层和间充质细胞和MAGE-A4 neuroectodermal祖细胞。像他的细胞,小鼠多能细胞系,ES和EG细胞,也表达了cta Mage-a家庭但没有表达Mage-b家庭基因与外胚层和原始生殖细胞。此外,我们发现不同的表达模式MAGE-A4 / Magea4在人类和小鼠多能和畸胎癌的细胞。尽管他CTA表达模式的相似性和恶性同行,hEC细胞,CTA的两个研究,MAGE-A2 MAGE-B2,只发现在hEC细胞而不是他。这些cta可能被视为标志基因转换多能细胞的候选人进行进一步的研究。比较分析CTA的癌症细胞系来源于neuroectodermal和中胚层起源和他的组织细胞衍生的祖细胞类似的血统已经表明,在大多数情况下,CTA异常表达在肿瘤细胞和显示较低的组织特异性。因此,CTA表达模式的进一步调查和识别多能和多功能干细胞及其衍生物以及不同类型的癌症是一个重要的一步的理解CTA功能在正常和肿瘤细胞也可能是有用的隔离和删除异常CTA-expressing细胞提高干细胞治疗的安全性。

 确认

作者感谢t . m . Nikonova她协助组织切片制备。他们感激教授n n Mamaev博士和t . L。Gindina (SPb i . p .巴甫洛夫医科大学)可能使用Ikaros4核型分析系统对透射光(MetaSystems,德国)。他们也感谢博士谢尔盖Vasetskiy批判阅读的手稿。这项工作是支持的俄罗斯基础研究基金会拨款05-04-49185,11-04-00379。

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