SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 735420年 10.4061 / 2011/735420 735420年 评论文章 在体外人类胚胎干细胞的分化和成熟为多功能细胞 马哈茂德 阿米尔- 1、2 那不勒斯 克劳迪奥。 3、4 Aldahmash 阿卜杜拉 1、2 李 兰德尔·J。 1 干细胞单位 大学医学院解剖学系 沙特国王大学 11472年利雅得 沙特阿拉伯 ksu.edu.sa 2 分子内分泌学实验室(KMEB) 内分泌学的医学生物技术中心和部门 大学医院的欧登塞的南丹麦大学 5000欧登塞C 丹麦 sdu.dk 3 沙特国王大学医学院 11472年利雅得 沙特阿拉伯 ksu.edu.sa 4 一般病理学系 临床病理学和卓越研究中心心血管疾病 第一医学院 那不勒斯大学费德里科•II 80138年那不勒斯 意大利 unina.it 2011年 16 6 2011年 2011年 05年 12 2010年 19 05年 2011年 2011年 版权©2011 Amer Mahmood et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

人类胚胎干细胞(为),可能产生任何分化后代,是一个有吸引力的细胞移植治疗来源,再生医学和组织工程。意识到这种潜力,必须能够控制ESC分化和直接的发展这些细胞在特定的通路。基础科学领域的胚胎发育、干细胞分化和组织工程提供了重要的见解的关键途径和支架调节hESC分化,产生了先进的建模原肠胚形成的文化和有效感应的内胚层,中胚层,外胚层,许多下游衍生品。这些发现已经导致识别的几个途径控制为其分化为中胚层衍生品如肌母细胞、间质细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、以及hemangioblastic衍生品。下一个挑战将是证明这些细胞的功能效用,两者兼而有之 在体外和在临床前模型的骨骼和血管疾病。

 1。介绍

组织工程是一个新兴的研究领域,旨在结合细胞再生功能组织与支持衬底。几种不同的胚胎干细胞和成年干细胞来源已被用于此目的( 1- - - - - - 4];然而,一些特定类型的细胞可能会在特定的应用程序更好的结果。其中,人类胚胎干细胞(为)可能构成组织工程的一个重要新资源,主要是由于广泛的分化能力和高增殖潜能。事实上,许多成人瀑特异性细胞和干细胞增殖能力有限,长期后失去分化功能 在体外文化。

 2。体外<斜体> < /斜体> ESC分化

这种区别时,才会正确的刺激是出现在媒体文化。尽管所有的科学家都同意hESC的潜力,它已变得明显的是,多能性是一把双刃剑;相同的可塑性,允许hESC生成数百种不同的细胞类型也使得他们难以控制。

 3所示。策略区分人类ESC分成三个胚芽层

hESC分化的基本方法分为三类。

直接分化为单层细胞外基质蛋白( 5]。

分化与基质细胞(coculture 6]。

在悬浮培养形成的三维球形结构,称为拟胚体(EBs) [ 7- - - - - - 11]。

EB开始分化形成是最常见的方法在文化由于其相似性postimplantation胚胎组织 在活的有机体内。应该注意,EB分化不重组胚胎发育的全套设备,没有形式的极性或“身体计划”hESC分化的所有三种方法是有效的,优点和缺点。每个方法表明hESC可以分化成广泛的细胞类型的文化。EB的优势提供一个三维的结构,增强了信息的交互,可能是重要的发展过程。ESCs人类已经成功地分化成组织来源于三个胚芽层使用的所有三种方法( 5, 18, 19]。

 4所示。体外<斜体> < /斜体> Chondrogenic人类胚胎干细胞的分化

有三个不同的血统,生成骨架:体节的(中轴骨),侧板中胚层(肢体骨骼),和神经嵴(头骨和脸)。框架包含三个特定的细胞类型:在软骨,软骨细胞和成骨细胞和破骨细胞在骨。而间充质来源的软骨细胞和成骨细胞、破骨细胞是造血的血统( 20., 21]。

主要有两种模式的骨形成,或骨,都涉及到预先存在的间充质组织转变成骨组织。

软骨内骨化形成的过程是一个软骨中间,取而代之的是骨头。

膜内的骨化间充质组织的直接转换成骨头 。

这两个方法之间的主要区别骨形成的存在在软骨内骨化软骨阶段;间充质细胞增殖并分化成prechondrocytes然后成软骨细胞。软骨细胞是第一个skeleton-specific细胞在胚胎发育期间出现。Chondrogenic凝聚间充质干细胞(msc)分化,策划的高机动性分组框Sox9基因在skeletogenesis是初始事件, Runx2控制软骨细胞成熟以及[ 22, 23]。

Chondrogenic分化已经在无血清刺激媒体包含外源性细胞因子和生长因子,特别是TGF - β总科,包括三维条件下文化。表列出的不同的研究 1清楚地表明,软骨的形成可以通过使用3 d文化;然而,朱克斯et al。组是第一组成功形成透明软骨细胞从老鼠的ESCs(制)使用脚手架与TGF - β3所示。此外,朱克斯组织显示,可以获得一个完整的软骨内成骨矿化结合矩阵,当透明软骨细胞形成 在体外是成熟的 在活的有机体内( 4]。尽管软骨已经形成 在体外,没有研究提供了数据显示软骨内成骨过程中获得的 在体外ESCs msc或文化。

在体外模型的直接分化胚胎干细胞chondrogenic血统。

天EB形成 帖子EB分化 分化的条件 Chondrogenic标记研究 细胞线(年代) 参考
5 封装的EBs盯住水凝胶为17天 水凝胶在存在差异化的EBs chondrogenic介质(CM)接受BMP-2和TGF - β1 类型I, II, X胶原和骨钙蛋白。蛋白聚糖含量测量 Mouse-D3和human-BG03 ( 12- - - - - - 15]
N / R EB在陶瓷颗粒细胞被播种 陶瓷支架上细胞分化 在体外21天在CM中补充了TGF - β3和21天 在活的有机体内成熟 形态学研究和蛋白聚糖含量进行了分析 Mouse-IB10、人类MSC和山羊MSC ( 4]
从第二天7类风湿性关节炎 EBs是镀 RA-treated EB文化产物处理TGF - β3 Sox9, D15:蛋白聚糖,Col2a1 Col10a1 MMP13 Mouse-CGR8、E14Tg2a EFC1 ( 16]
28 4周后EBs是分离和自组装为额外的4周 EBs的分化与组合chondrogenic中补充TGF - β1、TGF - β3、BMP-2和igf - 1 (100 ng / mL) Sox9, Col1a1 Col2a1 Human-BG01V ( 17]

培养基是高葡萄糖杜尔贝科修改鹰与1 - 5%胎牛血清的培养基补充。因素为软骨细胞分化:添加抗坏血酸,50 μg / mL;敏捷,10或100海里;脯氨酸,40 μg / mL;丙酮酸钠,100 μg / mL;,50毫克/毫升;TGF - β10 ng / mL;RA, 10−7M;BMP, 10 ng / mL(范围、10 - 800 ng / mL)。 Aggrecan, Sox9, II型胶原、X型胶原蛋白,和 scleraxis多聚酶链反应(PCR)检测结果进行了分析。

BMP:骨形态形成蛋白;上校:胶原蛋白;D:天(s);敏捷:地塞米松;海尔哥哥:胚状体的身体;FGF:纤维母细胞生长因子;IGF:胰岛素样生长因子;MMP:矩阵metalloproteases;挂钩:poly-ethylene甘油;类风湿性关节炎:视黄酸; TGF- β:转化生长因子- β;OC:骨钙素。

组织工程软骨生长 在体外使用cell-scaffold构造和生物反应器( 28]。Tigli等人的研究旨在调查灌注生物反应器的影响在chondrogenic潜在的工程结构多孔丝素蛋白支架播种hESC-derived msc。培养4周后,构造灌注生物反应器培养显示更高的粘多糖(笑话)( P < 0.001 ),DNA ( P < 0.001 )、总胶原蛋白( P < 0.01 )和胶原蛋白II ( P < 0.01 )相比,静态文化。机械结构刚度增加3.7倍动态文化条件下,和rt - pcr的结果得出结论,细胞培养在灌注生物反应器高表达( P < 0.001 )cartilage-related基因相比,静态文化。截然不同的差异在组织形态,包括多边形细胞外基质的结构工程结构薄浅区和内区在静态和动态条件下,分别。研究结果表明,灌注生物反应器可用于调节组织工程软骨的生长,提高组织生长 体外。

 5。体外<斜体> < /斜体>分化人类胚胎干细胞intoMesenchymal和成骨的血统

成骨细胞分化从多功能msc ( 29日]。这种分化过程是由一些细胞因子,包括我国在内的TGF - β、Wnt和刺猬( 30.]。BMP2是最有力的倡导者之一MSC分化成成骨细胞 在体外和诱导骨形成 在活的有机体内。Runx2直接成骨细胞分化的主基因和调节骨钙蛋白、骨桥蛋白的表达两个主要组件的骨基质( 31日]。

协议指导ESCs的分化为成骨的血统可分为至少两种方法(表 2和表 3)。第一种方法是基于报告ESCs的多步分化成为成骨细胞谱系。Barberi等人首先区分为多功能MSC-like的细胞群。hESC-derived msc进一步分化为成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞,成肌细胞 27]。其他组实现了MSC-like coculture分化的ESCs osteoprogenitor细胞(OP9细胞)或生长因子的使用。所有协议MSC人口使用间充质细胞表面标记(表 2)。

模型胚胎干细胞分化的多能间充质干细胞。

天EB形成 分化的条件 选择 功能分析 标记的研究 细胞线(年代) 参考
没有一个 Coculture hESC OP9血清细胞的媒体 流式细胞仪与CD73净化+ 分化 在体外成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞 细胞表面标记:CD29、CD44、CD54CD73 CD90、CD105D21:矿化D17:脂滴 Human-H1和H9 ( 24]
没有一个 单层直接分化bFGF2和PDGF AB 流式细胞仪和CD105净化+和CD24− 分化 在体外成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞 细胞表面标记:CD29、CD44、CD49aCD105,存在D21:矿化D14:脂滴D21:蛋白聚糖 Human-H1和HUES9 ( 25]
没有一个 自发单层分化细胞hESC殖民地 血清(10%) 分化 在体外成骨细胞和脂肪细胞 细胞表面标记:CD13、CD44、CD71,CD73 CD105,存在3周后:矿化一个 D21:脂滴 Human-H1 ( 26]
没有一个 Coculture hESC OP9血清细胞包含的媒体 流式细胞仪与CD73净化+ 分化 在体外成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞 细胞表面标记:CD29、CD44、CD54 CD73 CD90、CD105,CD106 CD166 STRO1 Human-H1和H9 ( 27]

培养基是 α最小的必要媒介或杜尔贝科修改鹰的媒介。一个在这项研究中,他们没有分析主要通过PCR成骨细胞的标记。

bFGF2:碱性纤维母细胞生长因子2;CD:集群的区别;OP9:鼠标基质细胞。

在体外模型直接胚胎干细胞的分化为成骨的血统。

天EB形成 分化的条件 选择 成骨细胞的标记物研究 细胞线(年代) 参考
1 - 6 定向分化成骨的因素的存在 血清和成骨的因素 D21/35:矿化结节,高山、骨钙素和I型胶原蛋白 ESCs Human-H9、鼠标 ( 32- - - - - - 34]
从第二天7类风湿性关节炎 RA治疗EB文化产物处理BMP +成骨的因素 RA和BMP-4 D12:矿化 Mouse-CGR8、E14Tg2a EFC1 ( 16]
3 Coculture EBs的初级bone-derived细胞(hPBDs) 14天,与BMP-2体内骨形成 条件媒体hPBDs D7和14:矿化、骨钙素、胶原蛋白,骨桥蛋白、BSP Human-CHA3 ( 35]
5 单个细胞的分化与生物活性玻璃发起 血清和成骨的因素 D21:矿化、骨钙素、高山和cbfa-1 / Runx2 Mouse-E14 ( 36]
4 - 5 EB的单个细胞悬液直接分化成骨的因素的存在 血清、成骨的因素和mac排序# D21:矿化、骨钙素、Cadherin-11 cbfa-1 / Runx2 Human-H1、H9 Mouse-CEE ( 37- - - - - - 39]

培养基是 α最小的基本介质或杜尔贝科修改鹰的介质,补充了10 - 20%胎牛血清。成骨分化的因素增加了: β- g, 10毫米(范围,2 - 10毫米);抗坏血酸,50 μg / mL;敏捷,10或100海里;RA, 10−7M;BMP, 100 ng / mL(范围、10 - 800 ng / mL)。 Cbfa1, BSP, 高山,和 OC多聚酶链反应(PCR)检测结果进行了分析。

#老鼠研究细胞按Cadherin-11表达式,和互补脱氧核糖核酸微阵列。

高山:碱性磷酸酶;asc。酸:抗坏血酸;BMP:骨形态形成蛋白;BSP:骨涎蛋白; Runx2:核心绑定的因素 α1;D:天(s);敏捷:地塞米松;ES:胚胎干细胞;FGF:纤维母细胞生长因子; βg: β甘油磷酸酯;类风湿性关节炎:视黄酸;OC:骨钙素。

第二种方法ESCs分化成成骨的血统没有任何MSC-like一步,和所有的协议或多或少是相同的。协议通常是基于两个步骤;包括EB形成的第一步,第二步是坚持文化的EBs的中断到单个细胞群或镀在EBs上涂层组织培养板有或没有成骨分化的因素。提高成骨分化,不同的方法已经被使用。川口等人添加维甲酸(RA)在EB步骤中,其次是在单层BMP-2分化( 16];相比之下,金等人与人类主要cocultured EBs bone-derived细胞诱导成骨分化( 35]。单层分化通常需要21天,观察到的矿化后茜素红或者冯Kossa染色。ESCs演示成功地分化成活跃的成骨细胞,成骨细胞的标记的表达进行了分析(表 3)。

最近的出版物描述了一种新的生产方法骨骼肌祖细胞进一步分化为成熟的成骨细胞。这个协议生成的肌原性的细胞在无血清培养为其在EBs媒体包含sb - 431542,一种小分子抑制剂的TGF - β苯丙酸诺龙/节点信号通路( 40]。如前所述,EBs导致代内胚层的中胚层和外胚层的血统。研究表明,sb - 431542抑制TGF -介导的 β/苯丙酸诺龙/节点信号导致减少的形成内胚层的细胞类型和大幅增加肌肉细胞的形成,包括骨骼肌、在一个相当高的效率;52%的表示MyoD实验细胞。本研究不仅是承诺在其产生骨骼肌中胚层祖细胞的能力,而且在它提供的信息关于hESC本质的区别。

为临床应用协议是真正有用的理想情况下允许执导,均匀的分化为感兴趣的细胞类型。这意味着最好的差异化策略可以避免随机和异构分化那些参与EB形成等步骤。我们最近发表的研究提供重要的新方向的发展未来的中胚层分化策略。第一项研究依赖于人类EB形成的初始阶段分化( 40]。我们抑制TGF - β在EB /苯丙酸诺龙/节点信号形成使用SB - 431542(某人)在无血清培养基。TGF -的抑制 β信号通路导致选择性upregulation几个标记的参与中胚层诱导和肌原性的分化,就是明证TBX6和Myf5增强基因表达。EBs外植体培养的无血清培养基含有某人浓缩了细胞肌原性的表型。此外,我们演示了MSC分化SB-OG细胞的培养基的边后卫。

我们组发表的第二项研究中,我们证明基质细胞,获得来自hESC文化的选择性坚持透明质酸(HA),展览hMSC表型特征,包括已知的表面标记,能够分化为成骨细胞和脂肪细胞,形成异位骨植入羟基磷灰石/磷酸三钙(HA / TCP)在拥有[老鼠皮下注射 41]。在这项研究中没有用于其他生长因子或细胞因子的直接分化为成一个均匀的基质细胞,从骨髓msc一样的特征,包括 在活的有机体内骨形成。

随着干细胞的潜在范围应用在组织工程继续增长,适当的脚手架必须严格定义人工微环境为每个目标器官。这些微环境决定通过控制分化干细胞的命运。在这项研究中,我们调查了支架刚度对胚胎间质祖细胞行为的影响( 42]。机械不同的支架与相同的微观结构和表面化学生产利用核壳电纺。模量的核壳聚(醚砜)聚( ε己内酯)(PES-PCL)纤维(30.6 MPa)超过4倍的纯PCL (7.1 MPa)。祖细胞的生长在两个不同的支架导致了两种截然不同的人群。低模量PCL纤维为软骨形成提供了一个更合适的微环境,明显的标志upregulation chondrocytic Sox9、胶原蛋白2型,和aggrecan基因表达,生产chondrocyte-specific细胞外基质粘多糖。相比之下,硬核壳PES-PCL纤维增强骨支持通过促进成骨的Runx2,碱性磷酸酶、骨钙素基因表达,以及碱性磷酸酶活性。这些发现表明,支架的显微结构的刚度和单个纤维的柔软可能控制干细胞分化中发挥重要作用。这可能通过调节不同的细胞骨架组织事件和随后的细胞内信号控制differentiation-specific基因表达。

使用为肌腱组织工程刚刚开始。陈等人把hESC-derived间充质干细胞(hESC-MSCs)在针织silk-collagen海绵支架和评估这种构造在促进肌腱再生的功效。当受到机械刺激 在体外,hESC-MSCs展出tenocyte-like形态和tendon-related基因表达标记胶原蛋白类型我和三世,Epha4, scleraxis,以及其他mechanosensory结构和分子,如纤毛,整合蛋白和肌凝蛋白。异位移植的组织工程肌腱 在活的有机体内机械刺激更有规律地对齐显示细胞和胶原纤维。这反过来导致增强的肌腱再生 原位,更好的组织学评分和优越的机械性能特征。此外,细胞标记和细胞外基质表达分析表明,移植hESC-MSCs不仅直接造成肌腱再生,而且施加一个environment-modifying影响植入网站 原位。因此,组织工程肌腱可以成功的通过播种在针织hESC-MSCs silk-collagen海绵支架机械刺激(紧随其后 43]。

 6。Embryonic-Derived Hemangioblasts

是一个伟大的需要干细胞治疗策略来刺激arteriogenesis和neoangiogenesis在心血管疾病( 44]。在这方面,hemangioblasts (HSs)是造血和内皮细胞的前体,可以生成具有良好的功能特性的新技术从单一blastomere-derived干细胞不需要破坏胚胎,从而最大限度地减少道德和监管问题[ 45, 46]。这一过程可能会有一个伟大的治疗的影响。最近的一项研究报道静脉注射骨髓细胞的影响(bmc)和商品,补充1.0%的维生素E,维生素C, 0.05%和6%的精氨酸,ApoE的缺血性下肢−−/糖尿病和非糖尿病的老鼠 47]。血液流动被激光多普勒血流计,监测和毛细血管密度确定部分的内收肌和semimembranous肌肉anti-CD31抗体。BMC或独自HS和BMC + h增加血流量和毛细血管密度和减少间质纤维化。这些影响被附加太放大,至少部分通过一氧化氮通路,减少系统的氧化应激和巨噬细胞浸润。有趣的是,端粒酶活性增加了HS治疗。因此,静脉HS ApoE干预治疗性血管生成增加−−/糖尿病小鼠后肢。这也是符合证据表明商品从人类胚胎干细胞可以生成与功能多层血管平滑肌细胞(Lu et al。( 46])。另一方面,一项最近的研究表明,高速钢仍epigenetically塑料和要求PRC1防止神经基因表达( 48),在另一项研究中,当商品衍生品是来自人类诱导多能干细胞,他们表现出有限的扩张和早期衰老 49]。从其他研究可能出现进一步的治疗策略:一个探索的可能性,多能祖细胞是居民在人类胎儿主动脉壁( 49)和另一个移植的组织工程血管人类心肌( 50]。

 7所示。结论

世界各地的科学家正在试图理解hESC增长和lineage-specific分化的控制。这些见解使可再生的一代的高纯度的细胞群不同的血统。用这些工具,我们现在可以开始测试这些细胞的功能通过移植的高纯度,良好的人口到不同的临床疾病模型。获得lineage-specific祖细胞移植将允许比较更成熟的数量来确定哪个阶段整合最好的成人组织,最终提供了最大的好处。高纯度的可用性细胞群从不同的血统也为细胞生物学家提供了一个机会与组织工程师互动生成的文化系统,将更准确地模拟重要器官形成的三维方面。这样的工程组织可能是更有效的移植后也可以支持更有效成熟不同细胞类型的文化。用这些工具,为其潜在的治疗现在已经准备好被测试领域的例如成骨的血统和血管再生。

 承认

这项工作是支持的医学院研究中心院长职科研、沙特国王大学,利雅得,沙特阿拉伯。

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